基因组序列注释--功能基因组学8

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产生突变体库的方法
研究一个基因的功能，最可靠的方法是把 一个基因的结构破坏掉，然后研究破坏后的表 现型。借助大量的突变体，将会加速人们对这 个物种基因功能的研究。 常见的方法是：
1、插入突变 2、缺失突变 3、物理化学诱变
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Promoter
Target gene
Promoter Antisense gene
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RNA干扰（RNAi）
• RNA干扰是指dsRNA（双链RNA）在细胞中可以诱发 与之同源的mRNA降解，从而导致编码该mRNA的基 因沉默的现象。
• RNA干扰的最初证据来自1995年Guo和Kemphues对线 虫的研究。他们发现，将par-1基因的反义RNA和正义 RNA注射进线虫体内，都能引起该基因的沉默。
– 菌落原位杂交法（in situ hybridization） – 反向PCR法（inverse PCR, IPCR） – 质粒拯救法（plasmid rescue）
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菌落原位杂交法
建立突变体基因组DNA克隆文库，以 转座子序列为探针与菌落克隆杂交，阳性 克隆即包含被转座子插入的目标基因。
T-DNA
T-DNA是农杆菌Ti质粒中的一个片段。农杆菌Ti质粒可以从植物伤 口侵入植物细胞，T-DNA可以整合到植物基因组中，并引起细胞疯狂 分裂，形成冠状肿瘤。
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转座子Ac/Ds系统
• Ac/Ds是目前植物中最常用的转座子系统。该系统来自 玉米，但已经通过转基因技术将该系统导入其它植物 （如水稻）中。
• 使用组成型启动子会同时造成过量表达和异位表达。
水稻OsMADS3基因过量和异位表达的表现
使用组成型启动子让来自水稻的OsMADS3基因在水稻中过量和 异位表达，发现在正常的小穗旁边还长出一个不完全的小穗。由此可 以推断，该基因与水稻的小穗发育有关。
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转座子标签 / T-DNA标签 （Transposon Tagging / T-DNA Tagging）
转座子转座插入是一个自发的过程，而T-DNA插入则是 通过转基因产生的。转座子插入和T-DNA插入引起突变的频 率要比自然突变的频率高。因此，在已知存在转座子的群体 或转基因后代群体中发现的突变体，很可能是转座子或TDNA插入引起的。通过转座子或T-DNA标签克隆基因的方法 主要有以下三种：
PCR product
T-DNA
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分子杂交检测法
对所有株系进行反向PCR（IPCR），然后将各株系 IPCR的产物按阵列形式固定在尼龙膜或玻璃片上，再以 各个待测基因的序列为探针进行杂交，有阳性杂交信号 的点（株系）即为该基因的插入突变体。
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• 基于该研究结果，1998年Andy Fire首次在线虫中证明， dsRNA可以有效地、特异地抑制基因的表达。
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RNA干扰所需的酶
• Dicer：为RNase III家族的一个成员，可以产生双链小 型干扰RNA（siRNA，长度21 ~ 23bp）。该酶含有多个 结构域，包括一个解旋酶结构域，两个相邻的RNase III 结构域，以及一个dsRNA结合基元。
• RISC（RNA-induced silencing complex）：由RNA诱导 的沉默复合体，是一种核酸蛋白复合体。
• RdRP（RNA-directed RNA polymerase）：由RNA指 导的RNA聚合酶。
RNA干扰的基本 过程
• Dicer与dsRNA结合，将 dsRNA剪切成siRNA。
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反义RNA
将目标基因颠倒过来，使其编码链变成模板链，而模板链变成编码 链，即成为该目标基因的反义RNA基因。将反义基因转入到植物细胞 中，反义基因将转录出反义RNA，而反义RNA会与目标基因的mRNA 结合，使之无法翻译，从而达到抑制目标基因表达的目的。
插入突变
插入突变作为研究基因组基因功能的有效手 段，广泛地应用于植物、哺乳动物的基因功能 的研究。这个技术手段的优势在于，插入片段 的序列已知，并且携带容易识别的报告基因。
其中，常用的插入突变技术有 • T-DNA插入突变 • Ac/Ds 转座子插入突变
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• Ac是自主型转座子，而Ds是非自主型转座子，需要Ac 存在时才能发生转座。因此，可以通过有性杂交的方 法将Ac和Ds聚合在一个基因组中。当发现某个Ds插入 引起的突变体时，又可以通过有性杂交的方法使Ac和 Ds分开，这样就能稳定地保存Ds插入突变体。
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过量表达和异位表达
• 通过转基因技术将完整的目标基因（包括启动子区域）导入正常 个体细胞中，使目标基因的拷贝数增加，这样可能会使目标基因 的表达量增加，超过了正常的需要（即过量表达），这会引起性 状的改变。由此可以推断目标基因的功能。
• 如果转基因中所用的启动子是组织特异的，而且其表达的部位与 目标基因正常表达的部位不同，则出现异位表达现象。异位表达 可能使得某种（些）性状在非正常的部位出现。据此也可推断目 标基因的功能。
质粒拯救法
经过改造的转座子带 有质粒的复制原点和选择 标记基因，从而犹如一个 载体。将突变体基因组 DNA酶切并连接后，可以 得到转座子和目标基因片 段组成的环状DNA。用它 转化大肠杆菌，目标基因 片段即被克隆出来。
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反向遗传学的研究方法：针对特定基因
功能基因组学是反向遗传学
• 传统的遗传学也称为正向遗传学，它是在已知基因功能的前提下，去 寻找基因（序列）的，亦即“从功能到基因”。
• 功能基因组学正好相反，它是在已知基因（序列）的前提下，去寻找 基因功能的，亦即“从基因到功能”，所以也称为反向遗传学。
正向遗传学的研究方法
• 图位克隆法：根据目标基因在染色体上定位的结果，对目标基因进行 克隆，最后了解其核苷酸序列。
5-AAGCTTATCCCGTGGTGGTATGAAAGGTTCCGCTATAGG-3 3-TTCGAATAGGGCACCACCATACTTTCCAAGGCGATATCC-5
5-AAGCTTATCCCGTGGTGGTATCCACCACGGGATAAGCTT-3 3-TTCGAATAGGGCACCACCATAGGTGGTGCCCTATTCGAA-5
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反向PCR法
将突变体基因组 DNA进行限制酶切， 然后用连接酶使之连 成环状。依据转座子 序列设计反向引物， 进行PCR，即可扩增 出目标基因片段。为 了提高特异性，可以 采用巢式（nested） PCR方法。
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• 消除或抑制基因的表达
– 基因敲除（gene knockout） – 反义RNA（antisense RNA） – RNA干扰（RNA interference）
• 提高或改变基因的表达
– 使目标基因过量表达（overexpression） – 使目标基因异位表达（ectopic expression）
功能基因组学 Functional Genomics
Xiaofang Xie College of Life Science Fujian Agriculture and Forestry University E-mail:xxf317@yahoo.com.cn
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PCR检测法
根据目标基因和T-DNA（或转座子）的序列设计一对 引物，则仅当T-DNA （或转座子）插入到目标基因中间 时，才能得到PCR产物。因此，能得到PCR产物的株系 即为该目标基因的插入突变体。
No PCR product
Target gene
为什么需要功能基因组学？
• 虽然从结构基因组学可以揭示基因组中基因的数量和分布， 并预测基因的种类和功能，但这仅仅是预测而已，并不能 肯定其确切功能，而且有许多基因的功能还无法预测。
• 从结构基因组学也无法知道各个基因参与了哪些生命过程， 其表达是如何调控的，不同基因之间是如何互作的。
• 总之，从结构基因组学无法了解基因的确切功能、表达调 控以及相互作用。功能基因组学的产生正是为了研究这些 内容。
• 转座子（或T-DNA）标签法：利用转座子（或T-DNA）插入引起的突 变，克隆控制突变性状的基因。
图位克隆（Positional Cloning）
图位克隆又称基于图谱的 克隆（map-based cloning）。 首先是寻找与目标基因紧密 连锁的标记，然后通过染色 体步行方法（chromosome walking）建立局域物理图， 找到与目标基因共分离的 BAC克隆。进一步通过亚克 隆和遗传互补试验（将野生 型基因转入突变体中），找 到目标基因。
建立随机插入突变体库及基因机械筛选
• 为了高通量地研究基因的功能，应该大规模地建立TDNA或转座子插入株系，然后对所有已知序列的基因 进行筛选，确定各个基因的插入突变体。
• 采取基因机械筛选的策略，可以同时对许多基因进行 筛选，实现高通量的分析目标。主要有以下三种方法： – PCR检测 – 分子杂交检测 – 侧邻DNA测序
侧邻DNA测序法
将所有株系的T-DNA（或转座子）插入位点两侧的序 列扩增出来并测序，然后将这些序列储存在一个基因敲除 数据库中。用生物信息学的方法将各个待测基因的序列与 该数据库中的序列进行比较，即可获知哪些株系发生了哪 些基因的插入突变。
功能基因组学的研究方法：高通量
• 建立大规模随机插入突变体库及基因机械筛选（gene machine screening）
• 分析基因表达谱（expression profile） – 转录组（ transciptome ） – 蛋白组（ proteome ） – 代谢组（ metabolome ）
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突变体库对于遗传学研究的意义
随着一些物种全基因组测序的完成，以及数 据库中现有的成百上千的ESTs 序列，如何分析 这些基因的功能、如何理解基因与基因之间在生 物体内的相互作用是一项重要的工作。基因功能 的预测建立在与其他物种同源基因之间的比对， 但许多基因的预测功能与他们实际的功能并不一 致。还有许多的基因功能尚未归类。突变体在研 究基因的功能的过程中十分重要。
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基因敲除
在体外先将某个基因 的内部插入一个选择标记 基因，使该基因失活。并 将包含该失活基因的染色 体片段组装到载体上。导 入细胞后，通过同源重组， 失活基因会取代细胞中原 来正常的基因，从而产生 基因失活突变体。
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• siRNA与RISC结合，形成 有活性的RISC复合体。
• 有活性的RISC与目标 mRNA结合（siRNA单链 与mRNA互补），将 mRNA切断。
RNA干扰的分子机制
dsRNA的来源
用于RNA干扰的dsRNA既可以在体外合成，然后导入到受体细 胞里，也可以人为地构建一个基因（将目标基因中某一段序列镜像 对接） ，将它导入到受体细胞，直接在受体细胞中合成dsRNA。该 基因具有自互补结构，因而转录出来的RNA可以形成发夹结构。
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突变体库对于遗传学研究的意义
30％为原来已鉴 定的基因；30％为 同源分析鉴定的基因； 10％为数据库中存在 同源序列，但功能未 知，称为孤儿家族； 剩下30％在数据库 中无同源序列，其中 7%很可能不是基因， 23％看起来像基因， 称为单身孤儿。
酵母基因组中基因的分类