第一章 生物产品分离技术研究的历史

第一章生物分离技术的研究历史

1．1引言

生化分离技术对生物技术对生物学的发展起着重要的作用，而近代生化分离技术与瑞典Uppsala密切相关。瑞典Uppsala大学在生化分离方法的研究最早起源于Svedberg。在20年代初，Svedberg在Uppsala大学物理化学系首先采用超高速离心技术，分离蛋白质等生物大分子。1924年，Svedberg发明了超高速离心机，并且首次从血液中分离出血红蛋白（Hb）[1]。1926年，Svedberg由于超高速离心机的发明及血红蛋白的发现获诺贝尔化学奖。

1925年，23岁的Arne Tiselius大学毕业后，作了Svedberg的研究生。当时Svedberg认识到蛋白质的物理性质不但可以在离心场中观察到，而且有可能在电场中研究。因此他鼓励Tiselius从事移动界面电泳法（Moving boundary method）的研究。1930年Tiselius首先发明了一种U型管自由移动界面电泳装置，之后Tiselius对该装置进行了改进，如采用冷却系统消除热扩散。他的学生Philpot和Svensson发明了一种紫外光学系统，用于检测蛋白质，即现在常用的紫外检测器的雏形。1937年Tiselius推出了新的电泳装置[2]，并将有关结果投到几个生物化学杂志，但这几个生物化学刊物都没有刊登这篇文章，可能这篇文章涉及的都是物理仪器的内容，而生物的内容较少。但Tiselius采用新的移动界面电泳装置从血清蛋白粗品中分离出血清蛋白及三种球蛋白，它将这三种球蛋白命名为α、β、γ球蛋白。1937年Uppsala大学因为Tiselius的工作专门成立了生物化学系，Tiselius成为生物化学系的第一位教授，但他的实验室仍主要在物理化学系，由于物理化学系拥有许多当时世界领先的仪器，如超高速离心机、电泳装置等。

40年代后，Tiselius开始了色谱分离技术的研究。1956年，Tiselius首先发明了羟基磷灰石，系统研究了吸附色谱的规律，建立了至今仍在应用的三种色谱洗脱方式：洗脱、前沿及置换，Tiselius首先将梯度洗脱引入色谱。由于Tiselius 在色谱及电泳方面的杰出贡献，1948年Tiselius获得诺贝尔化学奖[2]。

50年代后，Uppsala大学生物化学系在新型生化分离技术研究上进入了一个黄金时代。1959年发明了凝胶过滤（Gel filtration），60年代发明了等电聚焦、凝胶电泳。70年代的金属亲和层析分离技术和毛细管电泳技术等。培养了一大批世界著名的教授，如凝胶过滤的发明人Jerker Porath，毛细管电泳的发明人Stellan Hjerten等。而且Tiselius的许多学生进入了工业界，参与了瑞典两大生物

技术公司Pharmacia和LKB及美国的Bio-Rad公司的建设，如1950年Kirstie Granath在Pharamacia建立了物理化学实验室，1953年在电泳领域颇有建树的Svensson成为LKB的研究开发部主任；1954年Sephadex的发明人Per Flodin成为Pharmacia的葡聚糖实验室主任。1955年Bertil在Pharmacia建起了生物化学实验室。这些任命不但加强了工业界和Uppsala大学生物化学系的联系，而且加速了科研成果向企业界的转化，给企业带来了巨大的财富，如Pharmacia公司年销售额的三分之一（1983年）是从生化分离技术（介质）中获得的。LKB的主要产品如层析、电泳都来自Uppsala大学。美国Bio-Rad公司的层析介质Biogel A、Biogel P及毛细管电泳管也是来自Uppsala大学。世界范围内生化分离的层析介质（软介质）及电泳装置的技术主要来自Uppsala大学。因此60年代到80年代Uppsala大学生物化学系被国际学术界称为“Uppsala分离技术学院”。

1．2 凝胶过滤的发现历史

1.2.1 Dextran的发现

1941年23岁的Ingelman从Uppsala大学毕业后，作了Tiselius的研究生。Tiselius让他接手一个瑞典制糖厂的项目，从甜菜糖中分离出果胶，以替代进口果胶。当时由于二战，果胶极为缺乏，Ingelman意外的发现其提取的果胶中存在另一种多糖——葡聚糖（dextran）。为了提高dextran的成胶性，Ingelman采用一种双功能基团交联剂——环氧氯代丙烷进行交联，得到了一种不溶于水，但在水中溶胀的凝胶。他将有关结果报告给制糖公司，但制糖公司对这种水不溶性凝胶并不感兴趣，因此Ingelman1946年放弃了这个成果的专利申请。但Ingelman发现这种凝胶能够渗透一些物质而排斥一些物质，有可能用于医药，因此Ingelman 没有公开发表有关内容。1946年他进入Pharmacia后，继续dextran的研究。1947年Pharmacia推出了第一个基于dextran的浸剂溶液（商品名Macrodex）。1950年Pharmacia由Stockholm搬到了Uppsala，同时Ingelman被任命为dextran研究室主任，之后Pharmacia开发出许多dextran产品，成为世界上生产dextran的最大厂家[3]。

1.2.2 凝胶过滤和Sephadex的发明

50年代，Tiselius开始研究填充柱中的电泳。他的两个学生Per Flodin和Jerker Porath先后于1950年和1952年也加入了这个行列，研究用淀粉、纤维素等为填

充物抑制电泳热扩散，并在制备填充柱电泳上取得了进展。

1954年Flodin离开Tiselius实验室到Pharmacia任职，而Porath继续在生物化学系从事填充柱区带电泳的研究，但这两位朋友经常保持联系，讨论一些科研问题。当时Porath对纤维素粉的结果也不十分满意，由于其吸附作用较大。1956年秋天，Flodin建议Porach试一下交联dextran。Porath在实验中吃惊的发现大分子量的蛋白质反而比小分子量的蛋白移动的快。1957年Porath向Flodin报告了这一情况，并说交联dextran柱和几年前研究的淀粉柱具有类似的分子筛效应，但是物理性质要比淀粉好得多，而且孔径可以准确的控制。这两位科学家立刻意识到它们的发现就有重要的科学意义和潜在的应用价值。Ingelman知道这一消息后，立刻让Flodin专门制备凝胶，而Porath主要进行蛋白质和肽的分离实验，并且Pharmacia很快立项。经过几个月的实验，得到了令人满意的结果，开发了一种可以替代透析的色谱过滤技术。Pharmacia申请了两项专利，一项是凝胶制备，1958年3月申请，发明人为Flodin和Ingelman。另一项专利为凝胶过滤（gel filtration）方法，1958年4月申请，发明人为Flodin和Porath。申请专利后，由Pharmacia总经理Elis Goth和Tiselius教授提议，Pharmacia开始生产交联dextran，商品名为Sephadex，由Separation、Pharmacia和dextran三个字的字头组成。1959年Porath和Flodin在Nature上发表了著名的文章“Gel Filtration：A Method for Desalting and Group Separation”，第一次提出了凝胶过滤技术[4]。1959年，Pharmacia开始出售两种凝胶Sephadex G-25和Sephadex G-50。G为Gel的字头，数字表示胶的带水量（1克干胶所能带水的最大量乘以10）。1960年Pharmacia 又开发出Sephadex G-75，1963年Sephadex G-100和Sephadex G-200问世，1965年高度交联的Sephadex G-10 和Sephadex G-15上市，而且Sephadex的衍生物如DEAE－Sephadex也陆续问世，从而形成了Sephadex家族，Sephadex是目前生物分离中应用最广的层析介质之一。

1.3.Agarose 的发现和凝胶电泳的诞生

1961年美国的Polson首先将agar（琼脂）用于垂直柱电泳中，但由于agar 有很多带电基团，对电泳产生干扰，导致重复性不好。60年代初Uppsala大学生物化学系的Stellan Hjerten开始研究agar。通过文献检索和实验他发现agar是由agarose（琼脂糖）和agaropectin（琼脂果胶）组成，agar中的带电基团是agaropectin 引入的。其实这一结果早在1937年首先由日本学者Araki发现，Araki在一篇文章中阐述了agar是由两部分——琼脂糖和琼脂果胶组成，但由于这篇文章发表在日文杂志上，因此很少有人知道。Hjerten从agar中分离出agarose，并且将