复旦大学免疫实验ELISA双抗体夹心法检测抗原
双抗原夹心法实验步骤
双抗原夹心法实验步骤引言：双抗原夹心法是一种常用的实验技术，用于检测特定抗原在样本中的存在与否。
本文将详细介绍双抗原夹心法的实验步骤，以帮助读者了解该实验的操作流程。
一、实验准备1. 准备所需试剂和器材：包括抗原、抗体、标记物、酶底物、缓冲液、洗涤液、显色液等。
2. 根据实验需求，选择合适的抗原和抗体，确保它们具有高度特异性和亲和力。
3. 标记物的选择要考虑到其稳定性和灵敏度，常用的标记物有酶、荧光剂和放射性同位素等。
4. 预先调制好所需的缓冲液和洗涤液，确保其pH值和离子浓度合适。
二、实验步骤1. 预处理样本：将待测样本进行必要的预处理，如离心、稀释等，以获得适合实验的样本液。
2. 涂盒涂层：将特定抗原涂覆在微孔板的孔底上，通常采用直接吸附的方法，将抗原溶液加入孔中，静置一段时间，使其充分吸附。
3. 阻断：用适当的阻断剂（如牛血清蛋白）处理微孔板，以防止非特异性结合。
4. 加入待测样本：将预处理后的样本加入孔中，充分接触抗原，并与抗原发生特异性结合。
5. 加入一抗：在孔中加入与抗原结合的第一抗体，使其与待测样本中的抗原形成夹心复合物。
6. 洗涤：用洗涤液充分洗涤孔中的未结合物质，以减少非特异性反应。
7. 加入二抗：在孔中加入与第一抗体结合的酶标记的第二抗体，形成抗原-第一抗体-第二抗体的夹心结构。
8. 再次洗涤：用洗涤液彻底洗涤孔中的未结合物质，确保准确的结果。
9. 加入标记物：在孔中加入与酶标记的第二抗体结合的底物，使其发生化学反应产生信号。
10. 反应停止：通过加入反应停止剂，停止底物的化学反应，防止信号继续放大。
11. 测定结果：使用合适的测定仪器（如酶标仪、荧光仪等）测定底物反应产生的信号强度，根据信号强度判断抗原的存在与否。
三、实验注意事项1. 实验过程中要严格控制各步骤的时间和温度，以确保实验结果的准确性和可重复性。
2. 洗涤步骤的次数和时间要根据实验需求进行优化，以保证洗涤彻底而又不影响反应的灵敏度。
双抗夹心法测抗原原理
双抗夹心法测抗原原理双抗夹心法是一种常用的免疫学实验方法，用于检测特定抗原的存在。
它利用抗原与抗体的特异性结合来实现检测，从而确定样本中是否含有目标抗原。
双抗夹心法的原理可以简单概括为三个步骤：固定抗体、夹心抗原和检测抗体。
固定抗体被涂在固体表面上，如实验室常用的微孔板。
这些抗体通常是特异性的，能够识别并结合目标抗原。
固定抗体的涂布可以通过直接涂布、吸附或共价结合等方法完成。
接下来，待检测的抗原样品被加入到微孔板中，与固定抗体结合形成抗原-抗体复合物。
这一步骤被称为抗原的夹心过程，因为抗原被夹在固定抗体和检测抗体之间。
检测抗体被加入到微孔板中，与已夹心的抗原结合。
检测抗体通常与标记物相结合，例如酶、荧光染料或放射性同位素等。
通过检测标记物的信号，可以确定目标抗原的存在量。
双抗夹心法的关键在于抗原与抗体的特异性结合。
抗原是一种能够被免疫系统识别并引发免疫反应的物质，可以是细菌、病毒、细胞表面蛋白等。
而抗体是由免疫系统产生的特异性蛋白质，能够与特定抗原结合形成稳定的复合物。
在双抗夹心法中，固定抗体和检测抗体的选择非常重要。
固定抗体必须具有针对目标抗原的特异性，以确保只有目标抗原能够结合。
而检测抗体则需要与固定抗体结合的位置不同，以便检测标记物的信号不受干扰。
除了特异性结合，双抗夹心法还具有高度灵敏性和可重复性的优点。
通过选择合适的抗体和优化实验条件，可以使其达到非常低的检测限度。
因此，双抗夹心法被广泛应用于医学诊断、生物学研究和药物开发等领域。
需要注意的是，双抗夹心法虽然在抗原检测中具有很高的可靠性和准确性，但仍然存在一些局限性。
首先，抗体的特异性有时可能受到干扰物的影响，导致误判。
其次，双抗夹心法无法提供关于抗原的定量信息，只能确定其存在与否。
双抗夹心法是一种常用的抗原检测技术，通过特异性抗体的结合来确定样本中是否含有目标抗原。
其原理简单明了，操作方便，具有高度灵敏性和可重复性。
在今后的医学和生物学研究中，双抗夹心法将继续发挥重要作用，为人们提供可靠的实验手段。
双抗体夹心法
⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原.洗涤除去未结合的抗原及杂质.⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭，阻止待检血清中非特异IgG吸附固相.
⑶加待检血清,孵育,使固相抗原和待检抗体充分结合,洗涤除去未结合的非特异抗体 及其他血清成分.
⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原彳寺检抗体-酶标抗抗体（或酶标SPA复 合物.
⑷加底物显色.固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原的量.现多采用针对单一抗原决定簇特异性的单克隆抗体做固相化和酶标抗体,则受检样
品和酶标抗体可一次性加入,简化流程,缩短反应时间.若标本中待测抗原浓度过高,抗 原可分别与酶标抗体和固相抗体结合而不形成上述夹心复合物（类似于免疫沉淀反
应中抗原过剩时的后带现象）,使最终结果低于实际含量（钩状效应）,甚至出现假阴性 现象.因此对此类标本应适当稀释后再测定.另外，当血清中存在类风湿因子（RF）时，类
是双抗原夹心法.
操作步骤:
⑴将特异性抗体包被固相载体McAb.孵育一定时间,使形成固相抗体,洗涤除去未结 合的抗体和杂质.
⑵加待检标本,孵育,使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应,形成固相抗原抗
体复合物.洗涤除去其他未结合物质.
⑶加酶标抗体,孵育,使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物.洗涤除去未结 合酶标抗体.
1.双抗体夹心法 双抗体夹心法,属于非竞争结合测定.它是检测抗原最常用的ELISA,适用于检测分子 中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原,而不能用于小分子半抗原的检测.其基本工作原理是:利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测 抗原分子上两个抗原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物.由于反 应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量
elisa双抗体夹心法实验报告
elisa双抗体夹心法实验报告实验报告：ELISA双抗体夹心法实验一、实验目的本实验旨在通过ELISA双抗体夹心法，检测待测样品中目标蛋白的含量，为相关研究提供依据。
二、实验原理ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种灵敏的免疫学检测方法，通过将特异性抗体与酶标记结合，实现对目标蛋白的定量检测。
双抗体夹心法是一种常用的ELISA 技术，其原理是将两种特异性抗体分别固定在酶标板的不同位置上，形成两个“抗体夹心”，实现对目标蛋白的双重捕获，从而提高检测的灵敏度和特异性。
三、实验步骤1.酶标板包被：将第一种特异性抗体（capture antibody）包被在酶标板孔中，以固定化抗体形式捕获目标蛋白。
2.封闭：加入封闭液（通常为正常血清或BSA），填充孔内未结合的位点，以减少非特异性吸附。
3.洗涤：洗涤液清洗酶标板，去除未结合的物质。
4.样本加入：将待测样本加入酶标板孔中，与固定化的抗体发生特异性结合。
5.洗涤：再次洗涤酶标板，以去除未结合的物质。
6.酶标二抗加入：将第二种特异性抗体（detection antibody）与酶标记结合，形成酶标二抗。
将酶标二抗加入酶标板孔中，与目标蛋白发生特异性结合，形成“抗体夹心”。
7.洗涤：洗涤液清洗酶标板，去除未结合的物质。
8.显色反应：加入底物溶液，发生显色反应。
若目标蛋白存在，则呈现颜色变化。
9.终止反应：加入终止液，停止显色反应。
10.吸光度测定：用酶标仪测定各孔的吸光度值（通常在450nm处测量），根据吸光度值判断目标蛋白的含量。
四、实验结果根据实验数据，绘制标准曲线图和散点图，分析待测样品中目标蛋白的含量。
通常，标准曲线图横坐标为蛋白浓度，纵坐标为吸光度值。
通过将待测样品的吸光度值与标准品进行比较，计算出待测样品中目标蛋白的浓度。
五、实验总结本实验通过ELISA双抗体夹心法成功检测了待测样品中目标蛋白的含量。
实验过程中需注意保持操作环境的清洁和干燥，避免影响实验结果。
elisa双抗体夹心法临床应用
elisa双抗体夹心法临床应用ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，可以用于检测特定抗体或抗原的存在。
在ELISA实验中，常用的检测方法之一就是双抗体夹心法。
本文将介绍ELISA双抗体夹心法在临床应用中的重要性和优势。
一、ELISA双抗体夹心法原理ELISA双抗体夹心法是一种通过两种抗体反应来检测目标分子的方法。
首先，在试验板上吸附抗原，然后加入第一种对抗原特异的抗体，使其与抗原结合。
接着，加入第二种与第一种抗体不同的抗体，这第二种抗体常被标记有酶等物质，以便后续检测。
通过测量酶的底物反应程度，可以确定目标分子的存在量。
二、ELISA双抗体夹心法在临床诊断中的应用1. 疾病诊断：ELISA双抗体夹心法可以用于检测患者体液中特定抗原或抗体的存在，帮助医生进行疾病的早期诊断。
例如，在HIV感染的诊断中，ELISA双抗体夹心法有着很高的敏感性和特异性，可以快速准确地检测出HIV抗体的存在。
2. 肿瘤标记物检测：ELISA双抗体夹心法也常用于检测患者体液中的肿瘤标记物，帮助筛查和监测肿瘤患者的疾病进展。
通过检测血清中特定肿瘤标记物的水平，医生可以及早发现肿瘤的复发或转移。
3. 药物检测：在药物治疗过程中，ELISA双抗体夹心法可以帮助医生监测患者体内药物浓度的变化，确定药物的治疗效果，以及调整治疗方案。
三、ELISA双抗体夹心法的优势1. 敏感性高：ELISA双抗体夹心法可以检测非常低浓度的抗原或抗体，具有较高的敏感性。
2. 特异性好：通过选择特异性较好的抗体，可以确保ELISA双抗体夹心法对目标分子的检测具有较高的特异性。
3. 操作简便：ELISA双抗体夹心法操作简单，不需要复杂的仪器设备，适合临床快速检测的需求。
总结：ELISA双抗体夹心法作为一种重要的生物医学检测技术，在临床应用中发挥着重要作用。
其高敏感性、良好特异性和操作简便性，使其成为临床诊断和治疗中不可或缺的工具，有助于提高疾病的早期诊断率和治疗效果，促进患者的健康管理。
ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原
ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原临床ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原对于含多个抗原决定簇的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便，现有的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。
具体测定方法如下：1．首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
2．加入含待测物的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体反应而吸附于固相上。
3．加入酶标记的双抗体之二，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。
4．加入酶底物，温育显色测定(图2—1)。
在该测定模式中，有两步温育和板孔洗涤步骤，如果将上述测定步骤2和3并为一步，即将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。
最初的双抗夹心ELISA试剂盒，均采用两步法。
后来，人们为了节省时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。
目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HAg、。
FP和hCG等，基本上都采用一步法。
一步法相比于两步法，虽然操作简单‘但有其固有的缺陷，处理不好，对ELISA测定结果有严重影响。
在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原(Ag)浓度逐步增加时，将使固相抗体(Ab)与抗原的结合逐步达到饱和[(1)式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体(Ab’)后，a复合物的形成将直接与在第一步中形成的b复合物相关[(2)式]，因此，待测抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，而呈S形变化曲线。
而一步法双抗夹心ELISA的反应曲线则为钟形曲线。
也就是说测定显色随着待则标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(hook eHect)，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”(zonephen。
酶联免疫吸附试验ELISA双抗原夹心法
附件9 酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗原夹心法
检测血清总抗体
试验材料：
（1）纯化的重组汉坦病毒核蛋白抗原预包被酶标板：
（2）辣根过氧化物酶标记的纯化的重组汉坦病毒核蛋白抗原；
（3）缓冲液：
包被液：pH9. 6碳酸缓冲液；
稀释液：pH7.4 PBS（含5%脱脂奶）
洗涤液：pH7.4 PBS－T（0.05％吐温－20）；
（4）显色液：A/B液
（5）终止液：4N H
2SO
4
（6）酶标板、酶标仪。
检测步骤：
（1）将待检血清加入抗原孔，25μl/孔，同时用稀释液按工作浓度稀释酶标抗原，加入样品孔，25μl/孔，需设阴、阳性对照各3孔，37℃水浴1小时；
（2）用洗涤液洗涤6次，甩干；
（3）加显色液：于各反应孔内加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分钟；
（4）加终止液于每反应孔，一滴/孔。
结果判断：
于450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD均值，即P/N≥2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值≥2.1，则标本为出血热抗体阳性，反之阴性。
（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算）
意义：阳性结果，表明曾受到汉坦病毒感染。
1。
复旦大学免疫实验ELISA双抗体夹心法检测抗原
ELISA双抗体夹心法检测抗原实验时间：实验地点：实验人：1实验目的1.阐述ELISA（酶联免疫吸附测定）的原理，列举ELISA类型2.完成ELISA的基本操作3.学会分析实验结果4.能根据需要设计相应的ELISAS实验流程2实验原理ELISA：是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。
ELISA双抗体夹心法常用于检测抗原。
将已知道抗体吸附于固相载体上，加入待检含相应抗原的标本使之结合反应。
然后洗涤，再加入酶标抗体和底物进行测定。
但该方法只适用于检测多价大分子抗原，不适合检测小分子半抗原。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析，可以间接放大免疫反应结果。
所以说ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果,还可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
3实验材料1.酶标反应板（包被有抗CEA抗体）2.CEA标准品（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml）3.样品1和样品24.酶标抗体（酶结合物）5.底物液A和底物液B（显色剂A和B）6.终止液7.洗涤液4实验方法1.每孔依次加入0、5、10、20、40、80ng/mlCEA标准品、样品1、样品2各100μl。
2.37°C温盒内温育30min。
3.洗涤4次。
于吸水纸上拍干。
4.加入酶结合物100μl于各孔，轻轻混匀。
ELISA操作步骤（双抗体夹心法）
ELISA操作步骤（双抗体夹心法）ELISA操作步骤（双抗体夹心法）1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体，(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。
2 PBS洗3次，每次3分钟。
具体为.吸干或甩干孔内反应液；.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；.重复操作涤3次。
3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl。
将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃,40-60min。
4 PBS洗3次，每次3分钟。
5. 加入酶标抗体:酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37℃,30-60min之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加100μl。
6 PBS洗3次，每次3分钟。
7. 加入底物液(现用现配):TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl，底物加入量每孔100μl （TMB空白显色孔除外）,置37℃避光放置20-25分钟。
8. 终止反应:每孔加入终止液50μl(2M H2SO4)终止反应, 此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。
9 结果判断:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
也可测吸光值：在ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。
用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍，(数值的大小依具体检测要求而定)。
双抗体夹心elisa方法的原理
双抗体夹心elisa方法的原理
宝子，今天咱来唠唠双抗体夹心ELISA方法的原理哈。
ELISA呢，就是酶联免疫吸附测定，这双抗体夹心ELISA可有意思啦。
它就像是给抗原这个小坏蛋设了个包围圈。
有两种抗体参与哦。
一种是捕获抗体，就像一个小陷阱，先被固定在检测板上，就等着抗原上钩呢。
这个捕获抗体的形状和抗原的某个部分特别匹配，就像一把钥匙配一把锁一样。
然后呢，咱们要检测的抗原就大摇大摆地来了，它一头就扎进了捕获抗体这个小陷阱里，紧紧地结合在一起啦。
这时候，另一种抗体，也就是检测抗体就登场啦。
检测抗体也是专门针对抗原的，它从另一个方向和抗原结合，就像给抗原来了个前后夹击。
这个检测抗体还带着特殊的标记呢，就像是它的小标签。
这个标记可以是酶之类的东西。
接下来就更有趣啦。
当我们加入底物的时候，因为检测抗体上带着酶标记，这个酶就像一个小工匠，它会对底物进行加工。
底物被加工之后呢，就会发生一些变化，比如说变色啦。
我们就可以根据这个变化的程度来判断抗原的量。
如果颜色变得很深，那就说明抗原的量比较多；要是颜色浅，那抗原的量就少啦。
双抗体夹心ELISA方法可厉害了，它能够很灵敏地检测出抗原。
在医学上呀，它能检测出身体里是不是有病毒或者细菌的抗原，帮助医生判断病情。
在食品检测里呢，也能检测出有没有有害的微生物抗原，保障我们的食品安全。
反正这双抗体夹心ELISA方法就像一个小小的侦探，在微观的世界里，把抗原这个小目标给找出来，然后告诉我们它的情况呢。
是不是很神奇呀，宝子？ 。
ELISA-双抗夹心法检测抗原
3.封闭
1×Assay diluent， 200μl/孔加入到酶标板中，封 口膜封闭酶标板后，放入湿盒中，37℃避光孵育 2h。
37℃避光孵育2h
以上助教老师负责完成
4.洗涤 弃去孔内液体，用0.05%PBST洗板4次，（将
• 从冰箱中取出的试剂应该平衡至室温后使用； • 试剂最好现配先用
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固相载体
• 最常用的是聚苯乙烯：有较强的吸附蛋白质的性 能；
• 国际上标准的是微量滴定板8×12的96孔板式； • 已经包被抗原或者抗体的固相载体在低温（2-
8℃）干燥的条件下一般可以保存6个月。
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2）待测样品：取100μl待测样品加入酶标板，做复孔； 3）空白对照：取100μl 1×Assay diluent加入酶标板，做复孔；
待测样品---- 经ConA活化的小鼠淋巴细胞培养上清
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ELISA 操作要点
样品的保存 试剂的准备 固相载体 包被 加样 孵育(温育） 洗涤 显色和比色
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样本的制备与保存：
血清样品和细胞培养上清：5天内测定，可以放置于4℃， 超过一周，-80℃保存；
（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） ➢ 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法
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间接法检测特异性抗体
包被已知抗原
与待测抗体孵育
与酶标抗体孵育
加入底物
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显色
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优点:
1. 只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测 相应抗体的方法
双抗体夹心法elisa原理
双抗体夹心法elisa原理小伙伴，今天咱们来唠唠这个双抗体夹心法ELISA的原理，可有趣啦。
ELISA呢，就是酶联免疫吸附测定的简称，这双抗体夹心法ELISA就像是一场抗体的“三明治”制作大赛。
你看啊，咱们要检测的那个东西，比如说某种抗原，就像是三明治中间那块美味的肉。
那抗体呢，就是面包片啦。
先来说说这个抗体。
在这个检测里，有两种抗体哦。
第一种抗体是被固定在检测板上的，就像把一片面包稳稳地放在盘子里一样。
这个检测板就像是一个特殊的舞台，抗体就站在上面等着抗原的到来。
这个固定的抗体有个特殊的本领，它能特异性地识别咱们要检测的抗原。
什么叫特异性识别呢？就好比一把钥匙开一把锁，这个抗体就只能和咱们要检测的那种抗原紧紧结合，对其他乱七八糟的东西可没兴趣。
当咱们把含有抗原的样本加到这个有固定抗体的检测板上的时候，就像是把肉放在了面包片上。
抗原就会和固定的抗体来个亲密接触，它们紧紧地抱在一起，这个过程就像是命中注定的相遇一样。
这时候，抗原就被固定在检测板上啦。
接下来呢，第二种抗体就该登场啦。
这第二种抗体也是针对咱们要检测的抗原的，它就像是另一片面包，要把抗原夹在中间。
这个抗体可自由啦，在溶液里游来游去，当它发现检测板上已经被固定住的抗原的时候，就会迅速地结合上去。
这就形成了抗体 - 抗原 - 抗体这样的一个“三明治”结构。
是不是超级酷？但是呢，这还没完事儿哦。
咱们怎么知道这个“三明治”已经做好了呢？这就需要一点小魔法啦，这个第二种抗体上面还连接着一种酶呢。
这个酶就像是一个小信号员，它可以催化一种化学反应。
当我们加入一种特殊的底物的时候，这个酶就开始工作啦。
在酶的催化下，底物会发生变化，这个变化我们是可以看到的。
比如说，会产生颜色变化，就像变魔术一样，从无色变成有色。
颜色的深浅就和抗原的量有关系啦。
如果抗原很多，那形成的“三明治”就多，酶催化底物产生的颜色就深；要是抗原少呢，“三明治”少，颜色就浅。
你看，这个双抗体夹心法ELISA就像是一场精心编排的小剧场。
双抗夹心elisa原理
双抗夹心elisa原理
双抗夹心ELISA（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫分析技术，双抗夹心ELISA是一种检测抗原的方法，它可以测量生物体表面的抗原，也就是说它测量的是生物体表面的抗原分子以及它们的活性。
ELISA的过程分为三步：1）将抗原与酶联抗体结合；2）将抗原和抗体结合的板上的反应物加入酶；3）将酶反应物中的抗原或抗体测量出来。
在双抗夹心ELISA中，采用双抗体技术，即使用两个不同的抗体对目标分子进行夹心和抑制反应。
第一个抗体是夹心抗体，它能够结合抗原，并将其夹在板上，而第二个抗体是抑制抗体，它能够将夹心抗体结合的抗原结合在一起，防止其他抗体与抗原结合。
最后，将用酶连接抗体来检测抗原，通过酶的活性来测量抗原的水平。
双抗体夹心法实验步骤
双抗体夹心法实验步骤1. 前言双抗体夹心法是一种非常常用的免疫检测方法，广泛应用于生物学、医学、环境科学等领域。
这种方法利用两个专一性强的抗体共同夹持待测物质，从而形成类似“夹心”的结构，可以大幅度提高检测的精准度和准确性。
本文将详细介绍双抗体夹心法的实验步骤。
2. 实验器材1. 96孔微孔板2. 吸头或移液器3. 洗板缓冲液4. 夹心板抗原或抗体5. 试剂盒中提供的初级抗体（通常是兔抗)6. 试剂盒中提供的生物素化二级抗体（通常是山羊抗）7. 过氧化物酶（HRP）结合酶标记荧光素底物8. 磷酸化蛋白酶抑制剂3. 实验步骤3.1. 板面涂覆1. 取出一张96孔微孔板；2. 加入200 μl 夹心板抗原或抗体（1-5 μg / ml 的浓度在PBS缓冲液中）。
在室温下静置2～12小时使其附着于微孔板上；3. 弃去液体，在孔内加入300 μl 1％牛血清蛋白（BSA）的PBS缓冲液，在常温下保存微孔板。
3.2. 洗涤1. 取出洗板缓冲液，并将96孔微孔板中的PBS液体涂覆洗净（如果您使用的是自己配制的洗板缓冲液，请按照所使用的方案操作）；2. 重复1次。
3.3. 初次抗体夹心反应1. 取出您的实验物质，并将其加入到96孔微孔板中的每个孔中，通常情况下是50μl（如果您没有在预处理中加入样品，则当前步骤可以忽略）。
2. 在4℃条件下，静置2个小时；3. 弃去孔中的液体，在平板中添加330μl PBS缓冲液；4. 重复步骤 2 次。
3.4. 二次抗体夹心反应1. 在96孔微孔板中的每个孔中加入100μl色素化的抗原抗体，通常情况下是1000～5000倍的稀释度，在PBS缓冲液中（如果用于夹心的是抗体，则当前步骤可以忽略）；2. 在4℃条件下，静置2个小时；3. 弃去孔中的液体，在平板中添加330μl PBS缓冲液；4. 重复步骤 2 次。
3.5. 酶标记亚细胞ALP反应1. 在96孔微孔板中的每个孔中加入100μl碱性磷酸酶[ALP]标记的生物素化羊抗体，通常情况下是5000倍稀释度（如果您使用的不是生物素化羊抗体，则当前步骤可以忽略）；2. 在4℃条件下，静置2个小时；3. 弃去孔中的液体，在平板中添加330μl PBS缓冲液；4. 重复步骤 2 次。
双抗体夹心ELISA检测HIV-1 gp41抗原方法的建立
抗 体 夹 心 法 检 测 系 列 稀 释 的 @AB9;D 多 肽 ! 出 现 阳 性 反 应 的
! 收稿日期 " 7<<4;<C;9C ! 作者简介 " 于澜 (9:33; #!女 !助教 !硕士 !(";EQW0#0QT0QT9<C9m_WTQJX/E
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ELISA双抗体夹心法检测癌胚抗原
操作步骤
（1）加样：依次加入6个标准品（0、5、10、20、 40、80ng/ml）、样品1、样品2，每孔100ul， 混匀；
★ OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高 吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。
癌胚抗原CEA
(1) CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。 CEA升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺髓 样癌等。但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特异性 结肠炎等疾病，15%～53%的病人血清CEA也会升高，所以CEA 不是恶性肿瘤的特异性标志，在诊断上只有辅助价值。
包被
将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。
蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质 分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种 物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影 响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更 易吸附到固相载体表面。
DEPARTMENT OF IMMUNOLOGY
ELISA双抗体夹心法检测癌胚抗原
操作步骤
（1）加样：依次加入6个标准品（0、5、10、20、 40、80ng/ml）、样品1、样品2，每孔100ul， 混匀；
（2）温育：37℃，30分钟； （3）洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，
静置10秒，甩干，重复4次后，拍干； （4）加酶：加入酶标抗体，每孔100ul，混匀； （5）温育：37℃，30分钟； （6）洗板：同步骤3 （7）显色：加入显色剂A、B，每孔各一滴，混匀，
ELISA的类型 ★ 双抗体夹心法 ★ 竞争法 ★ 间接法
双抗体夹心法
检测抗原最常用的方法
elisa双抗体夹心法实验报告
elisa双抗体夹心法实验报告Elisa双抗体夹心法实验报告引言：Elisa（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验技术，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
本实验旨在通过Elisa双抗体夹心法检测特定抗原的存在与浓度。
本文将详细介绍实验的步骤、原理和结果分析。
实验步骤：1. 准备样品：收集待测物质样品，如血清或细胞上清液，并进行必要的预处理，如离心、稀释等。
2. 涂布抗体：将特异性抗原抗体溶液均匀涂布在微孔板的孔底，使其吸附在固相上。
3. 阻断：加入适量的阻断剂（如牛血清蛋白）封闭孔底未被抗体吸附的部分，以防止非特异性结合。
4. 样品加入：将处理好的样品加入微孔板中，与固相上的抗体发生特异性结合。
5. 洗涤：用洗涤缓冲液多次洗涤微孔板，去除未结合的物质。
6. 检测抗体：加入与待测物质特异性结合的检测抗体，形成夹心复合物。
7. 二抗结合：加入与检测抗体结合的酶标记二抗，形成二抗-检测抗体-待测物质的三重夹心复合物。
8. 底物添加：加入底物溶液，使酶标记二抗催化底物发生显色反应。
9. 反应终止：加入反应终止液，停止底物的反应。
10. 读取结果：使用酶标仪测量吸光度值，根据标准曲线计算待测物质的浓度。
实验原理：Elisa双抗体夹心法基于特异性抗原抗体的结合反应，通过将待测物质夹在两个特异性抗体之间，实现对待测物质的定量检测。
该方法的关键在于使用两个不同特异性的抗体，一个用于固定在微孔板上，另一个用于检测抗体结合。
在实验过程中，首先将特异性抗原抗体固定在微孔板上，形成固相。
然后加入待测物质样品，样品中的特定抗原与固相上的抗体发生特异性结合。
接着，加入检测抗体，该抗体与待测物质上的特异抗原结合。
最后，加入酶标记的二抗，该二抗与检测抗体结合，形成夹心复合物。
通过加入底物和反应终止液，可以测量底物反应产生的吸光度值，从而计算待测物质的浓度。
结果分析：根据实验结果，通过测量吸光度值，可以得到待测物质的浓度。
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ELISA双抗体夹心法检测抗原
实验时间：实验地点：实验人：
1实验目的
1.阐述ELISA（酶联免疫吸附测定）的原理，列举ELISA类型
2.完成ELISA的基本操作
3.学会分析实验结果
4.能根据需要设计相应的ELISAS实验流程
2实验原理
ELISA：是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。
ELISA双抗体夹心法常用于检测抗原。
将已知道抗体吸附于固相载体上，加入待检含相应抗原的标本使之结合反应。
然后洗涤，再加入酶标抗体和底物进行测定。
但该方法只适用于检测多价大分子抗原，不适合检测小分子半抗原。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析，可以间接放大免疫反应结果。
所以说ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果,还可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
3实验材料
1.酶标反应板（包被有抗CEA抗体）
2.CEA标准品（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml）
3.样品1和样品2
4.酶标抗体（酶结合物）
5.底物液A和底物液B（显色剂A和B）
6.终止液
7.洗涤液
4实验方法
1.每孔依次加入0、5、10、20、40、80ng/mlCEA标准品、样品1、样品2各
100μl。
2.37°C温盒内温育30min。
3.洗涤4次。
于吸水纸上拍干。
4.加入酶结合物100μl于各孔，轻轻混匀。
5.37°C温盒内温育30min。
6.洗涤4次。
于吸水纸上拍干。
7.每孔分别加显色剂A和B各一滴，轻轻混匀。
8.37°C温盒内避光温育15min。
9.加入终止液1滴，肉眼观察结果并读取OD450、630值。
5结果分析
5.1实验现象
各孔内加入酶标抗体后，溶液变红；分别加入显色液后，溶液变蓝，并且深浅明显，标准品中抗原含量越小，溶液越浅；加入终止液后，溶液变黄。
5.2数据处理：
图1：OD450-OD630-抗原含量回归直线图
根据回归曲线计算:
样品一的抗原浓度为11.10ng，误差为：11.10-10.00/10.00×100%=11.00%
样品二的抗原浓度为41.82ng，误差为：41.82-40.00/40.00×100%=4.55%
5.3误差分析
●在洗板的时候会在孔内出现气泡，导致后续加入洗涤液的时候量不够但孔内
已经满了，洗涤可能不是很充分，就会抗原与酶联抗体结合复合物增多或者酶联抗体有残留，而使得最后酶量增多，OD测值偏大，这可能是标准品抗原含量为10ng和40ng的吸光值偏大的主要原因。
●在加入抗原和二抗的时候加样的时候，会有少量残留在枪头内，残留量有所
差异，这是不可避免的误差。
5.4注意事项：
1.在加样的时候要保证加在加样孔里，减少挂壁，可以用两只手支撑着保持加
样的稳定性，避免交叉感染；加样时要及时更换枪头。
2.温育的时候要有塑料纸遮住反应板表面，防止液体挥发或有异物落入板孔而
影响后续抗原抗体结合反应。
3.洗涤的时候，尽量加满洗涤液在孔里，并保证一定的浸泡时间；在甩去液体
的时候，不要翻过来，平移至吸水纸拍干，尽量减少气泡的残留，防止对后续的洗涤造成影响。
4.加入显色液时应尽量保证避光，因为光照很有可能会增加显色液显色程度或
造成过氧化氢分解等影响实验结果。
5.在显色液加完、温育后，应及时快速添加终止液，终止酶催化反应。