碱性磷酸酶km值测定
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EXPERIMENT 3
酶促反应动力学 研究方法介绍
碱性磷酸酶km值测 定
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1
实验目的
学习环境因素对酶促反应速度的影响； 学习米氏方程及Km值得测定； 测量碱性磷酸酶km值；
实验原理
E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包 括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等
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[S]：底物浓度
V： 不同[S]时的反应速度
Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
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4
米－曼氏方程式推导基于两个假设：
(1) E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分 解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即 V＝k3[ES]。
＝
K2+K3 K1
(2)
令：
K2+K3 ＝ Km （米氏常数） K1
则(2)变为: ([Et]－[ES]) [S] ＝Km [ES]
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6
整理得:
[ES]＝[─Et─][─S]
(3)
Km + [S]
将(3)代入(1) 得
V＝─KK─3m[─E+─t][[SS]]
(4)
当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，
吸光度的倒数作纵坐标以底物浓度的倒数作横坐标，按
Lineweaver-Burk作图法求出Km值。
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17
【试剂】
1．酚试剂 2．2.5mmol／L磷酸苯二钠基质液
称取磷酸苯二钠635mg，用蒸馏水溶解后定容至1000ml， 加氯仿数滴以防腐，置于冰箱中可保存1年之久。 3．碱性缓冲液(pH-10.0)
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9
Vmax
定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓 度成正比。
意义：Vmax=K3 [E] 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的
转换数(turnover number)，即动力学常数K3。
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10
酶的转换数
定义 — 当酶被底物充分饱和时，单位时间内 每个酶分子催化底物转变为产物的分 子数。
称取无水Na2CO3 6.36g和NaHcO3 3.36g，先以适量蒸馏 水溶解，再定容至1000ml。 4．碱性磷酸酶液
称取碱性磷酸酶lmg，加水3~4ml，置于冰箱可保存5周左右。
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18
操作
试剂（ml）
1
2
3
4
5
6
2.5mM磷酸苯二钠
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.0
蒸馏水
0.8
0.6
0.4
ຫໍສະໝຸດ Baidu
0.2
－
－
碱性缓冲液
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
混匀后，37℃水浴5min
碱性磷酸酶
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
－
混匀后，37℃水浴15min(准确计时）
酚试剂
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
碱性磷酸酶
－
－
－
－
－
0.1
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16
碱性磷酸酶km值的测定
以不同浓度的磷酸苯二钠作为碱性磷酸酶的底物，在最适条件 下(pH=10.0，37℃)，准确反应15min。在碱性条件下产物酚可 以与酚试剂作用生成蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm波长 比色，色泽深浅与光密度成正比。反应式如下：
然后，以吸光度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以
➢ 关系式为：V = K3 [E]
0
[E]
当[S]>>[E]时，Vmax = k3 [E]
酶浓度对反应速度的影响
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14
温度对反应速度的影响
双重影响
温度升高，酶促反应速度 升高；由于酶的本质是蛋白质， 温度升高，可引起酶的变性，从 而反应速度降低 。
酶 2.0
活 性 1.5
最适温度 (optimum temperature)：
酶促反应速度最快时的 环境温度。 * 低温的应用
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1.0
0.5
0 10 20 30 40 50 60
温度 ºC
温度对淀粉酶活性的影响
15
pH对反应速度的影响
酶
最适pH
活
(optimum pH)： 性
酶催化活性最大时
的环境pH。
胃蛋白酶
淀粉酶
胆碱酯酶
0
2
4
6
8 10 pH
pH对某些酶活性的影响
(2) S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始
阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。
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5
推导过程
稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即 [ES]恒定。
K1 ([Et]－[ES]) [S]＝K2 [ES] + K3 [ES]
整理得：
([Et]－[ES])[S] [ES]
Km
[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时
的底物浓度，单位是mol/L。
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8
（二）Km与Vmax的意义
Km值
① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物 浓度。
② 意义：
a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。
即[Et]＝[ES]，反应达最大速度
Vmax＝K3[ES]＝K3[Et]
(5)
将(5)代入(4)得米氏方程式：V＝─V─m─a─x[S] Km + [S]
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7
❖ Km值的推导
当反应速度为最大反应速度一半时
V
Vmax Vmax/2
Vmax 2
＝ Vmax[S] Km + [S]
Km＝[S]
2
相关E学原理 （一）米－曼氏方程式
酶促反应模式——中间产物学说
E+S
k1 ES k3 E + P
k2
中间产物
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3
※1913 年 Michaelis 和 Menten 提 出 反 应 速 度
与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏 方程式( Michaelis equation)。
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
1/V
1/Vmax
1/[S]
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12
Hanes作图法
在林－贝氏方程基础上，两边同乘[S]
[S]/V
[S]/V=Km/Vmax + [S]/Vmax
Km/Vm
-Km
[S]
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13
酶浓度对反应速度的影响
V
➢ 当[S]＞＞[E]，酶可被 底物饱和的情况下，反 应速度与酶浓度成正比。
意义 — 可用来比较每单位酶的催化能力。
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11
（三）Ｋm值与Ｖmax值的测定
双倒数作图法(double reciprocal plot)
Vmax[S] V = Km+[S]
两边同取倒数
1/V=
Km Vmax
1/[S] + 1/Vmax -1/Km
林-贝氏(Lineweaver-Burk)方程
酶促反应动力学 研究方法介绍
碱性磷酸酶km值测 定
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1
实验目的
学习环境因素对酶促反应速度的影响； 学习米氏方程及Km值得测定； 测量碱性磷酸酶km值；
实验原理
E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包 括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等
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[S]：底物浓度
V： 不同[S]时的反应速度
Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
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米－曼氏方程式推导基于两个假设：
(1) E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分 解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即 V＝k3[ES]。
＝
K2+K3 K1
(2)
令：
K2+K3 ＝ Km （米氏常数） K1
则(2)变为: ([Et]－[ES]) [S] ＝Km [ES]
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6
整理得:
[ES]＝[─Et─][─S]
(3)
Km + [S]
将(3)代入(1) 得
V＝─KK─3m[─E+─t][[SS]]
(4)
当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，
吸光度的倒数作纵坐标以底物浓度的倒数作横坐标，按
Lineweaver-Burk作图法求出Km值。
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【试剂】
1．酚试剂 2．2.5mmol／L磷酸苯二钠基质液
称取磷酸苯二钠635mg，用蒸馏水溶解后定容至1000ml， 加氯仿数滴以防腐，置于冰箱中可保存1年之久。 3．碱性缓冲液(pH-10.0)
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Vmax
定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓 度成正比。
意义：Vmax=K3 [E] 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的
转换数(turnover number)，即动力学常数K3。
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10
酶的转换数
定义 — 当酶被底物充分饱和时，单位时间内 每个酶分子催化底物转变为产物的分 子数。
称取无水Na2CO3 6.36g和NaHcO3 3.36g，先以适量蒸馏 水溶解，再定容至1000ml。 4．碱性磷酸酶液
称取碱性磷酸酶lmg，加水3~4ml，置于冰箱可保存5周左右。
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操作
试剂（ml）
1
2
3
4
5
6
2.5mM磷酸苯二钠
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.0
蒸馏水
0.8
0.6
0.4
ຫໍສະໝຸດ Baidu
0.2
－
－
碱性缓冲液
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
混匀后，37℃水浴5min
碱性磷酸酶
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
－
混匀后，37℃水浴15min(准确计时）
酚试剂
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
碱性磷酸酶
－
－
－
－
－
0.1
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碱性磷酸酶km值的测定
以不同浓度的磷酸苯二钠作为碱性磷酸酶的底物，在最适条件 下(pH=10.0，37℃)，准确反应15min。在碱性条件下产物酚可 以与酚试剂作用生成蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm波长 比色，色泽深浅与光密度成正比。反应式如下：
然后，以吸光度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以
➢ 关系式为：V = K3 [E]
0
[E]
当[S]>>[E]时，Vmax = k3 [E]
酶浓度对反应速度的影响
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温度对反应速度的影响
双重影响
温度升高，酶促反应速度 升高；由于酶的本质是蛋白质， 温度升高，可引起酶的变性，从 而反应速度降低 。
酶 2.0
活 性 1.5
最适温度 (optimum temperature)：
酶促反应速度最快时的 环境温度。 * 低温的应用
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1.0
0.5
0 10 20 30 40 50 60
温度 ºC
温度对淀粉酶活性的影响
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pH对反应速度的影响
酶
最适pH
活
(optimum pH)： 性
酶催化活性最大时
的环境pH。
胃蛋白酶
淀粉酶
胆碱酯酶
0
2
4
6
8 10 pH
pH对某些酶活性的影响
(2) S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始
阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。
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5
推导过程
稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即 [ES]恒定。
K1 ([Et]－[ES]) [S]＝K2 [ES] + K3 [ES]
整理得：
([Et]－[ES])[S] [ES]
Km
[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时
的底物浓度，单位是mol/L。
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（二）Km与Vmax的意义
Km值
① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物 浓度。
② 意义：
a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。
即[Et]＝[ES]，反应达最大速度
Vmax＝K3[ES]＝K3[Et]
(5)
将(5)代入(4)得米氏方程式：V＝─V─m─a─x[S] Km + [S]
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❖ Km值的推导
当反应速度为最大反应速度一半时
V
Vmax Vmax/2
Vmax 2
＝ Vmax[S] Km + [S]
Km＝[S]
2
相关E学原理 （一）米－曼氏方程式
酶促反应模式——中间产物学说
E+S
k1 ES k3 E + P
k2
中间产物
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3
※1913 年 Michaelis 和 Menten 提 出 反 应 速 度
与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏 方程式( Michaelis equation)。
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
1/V
1/Vmax
1/[S]
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12
Hanes作图法
在林－贝氏方程基础上，两边同乘[S]
[S]/V
[S]/V=Km/Vmax + [S]/Vmax
Km/Vm
-Km
[S]
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13
酶浓度对反应速度的影响
V
➢ 当[S]＞＞[E]，酶可被 底物饱和的情况下，反 应速度与酶浓度成正比。
意义 — 可用来比较每单位酶的催化能力。
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11
（三）Ｋm值与Ｖmax值的测定
双倒数作图法(double reciprocal plot)
Vmax[S] V = Km+[S]
两边同取倒数
1/V=
Km Vmax
1/[S] + 1/Vmax -1/Km
林-贝氏(Lineweaver-Burk)方程