实验三 植物不定芽诱导和快繁技术

三、普通茎尖培养与繁殖技术 茎尖培养可进行植物的无性快繁，并且技术 较为成熟，也叫微繁技术。 （一）茎尖微繁技术的一般方法 1、无菌培养体系的建立 外植体制备：正在生长的芽或腋芽、茎段、 鳞茎切块、块茎、球茎。茎尖组织大小为带2-4 个叶原基或更多。 操作程序：类似一般无菌操作基本技术培 养基：MS、B5、White等，糖2-3%，生长调节剂。 培养条件：1000-3000Lx、16h、25℃。
⑶培养 25-28℃，光照12-14h，光照度1500-2000Lx， 不定芽分化和生长期间3000-10000Lx。 2、影响叶肉组织培养的因素 ⑴基因型 不同植物种类、同一物种的不同品种间在 叶组织培养特性上有一定的差异。 ⑵细胞分裂素与生长素的组合 两种细胞分裂素都能促进芽的分化，6-BA 的作用好于KT，但6-BA对不定芽的进一步发育 （茎叶的形成）有抑制作用。
难生根的植物可以采取： ⑴降低无机盐浓度，1/2 MS培养基 ⑵采用IBA、NAA0.1-0.5mg/L 。 ⑶添加吸附剂。 ⑷减少琼脂。
5、试管苗的移植
小根5cm左右可以炼苗移栽。即将形成的小
植株转移到土壤的过程。这个过程是微繁殖最关 键的一步。 ⑴保持小苗水分供需平衡 ⑵选择适当的介质：珍珠岩、蛭石、粗砂、炉
Raggio 装置
三、离体根培养所用的培养基
离体根培养多用无机离子浓度低的
White培养基或其他培养基，MS、B5等也可采
用，但必须将其浓度稀释到2/3或1/2。
苜蓿离体根的培养液和西红柿离体根的
培养液如下：
成份
Ca(NO3)2.4H2O Na2SO4 KCl KNO3 NaH2PO4.2H2O MgSO4.7H2O MnSO4.4H2O FeC6H5O7.3H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI CuSO4.5H2O MoO3 甘氨酸 烟酸 维生素B1 维生素B6 蔗糖 Ph
叶）——上表皮朝上接在固体培养基上培养。
方法二： 70%酒精漂洗约10秒，饱和漂白粉液中浸315分钟，无菌水冲洗数次，放在无菌的干滤纸 上吸干水分以供接种用。对一些粗糙或带绒毛
的叶片要延长灭菌时间。注意要选择成熟的叶
片。 同一叶片的栅栏组织比海绵组织较成熟。培 养叶肉时因海绵组织在分裂前就死亡，如果栅 栏组织不发达就难培养。
叶 片 愈 伤 组 织 诱 导 形 成
⑵培养基 常用MS、B5、White、N6等培养基，3%糖， 培养基中添加椰子汁等有机添加物，有利于 叶片组织培养中的形态发生。 大多数双子叶植物的叶组织培养，细胞分 裂素特别是KT、6-BA有利于芽的形成，生长 素特别是NAA有利于根的发生，2,4-D有利于 遇伤组织的形成。一般BA 1-3mg/l，NAA 0.25-1mg/l。
四、影响离体根生长的因素 1、基因型 不同植物的根对培养的反应不同，番 茄、烟草、马铃薯、小麦可快速生长并继代培养无 限生长。萝卜、豌豆需长时间且有限。木本植物很 难生长。 2、营养条件 硝酸盐是最好氮源，蔗糖是最好碳 源，铁、锰、硼、硫、维生素不能缺少。 3、激素 生长素对不同植物反应不同 4、pH 5、光照和温度 25-27℃
胡 萝 卜 根 培 养
2、一般方法
100ml三角瓶，内装40-50ml培养液，如长时
间培养，可采用大型器皿500-1000ml培养液的发
酵瓶进行培养。根据需要可在瓶中添加新鲜培养
液继续培养或分割转移后继代培养。为避免培养
过程中培养基成分变化对生长的影响，可采用流
动培养方法。
2、根瘤菌结瘤实验的特殊方法
4、说明叶组织培养的一般方法
5、简述叶片培养中叶片消毒的一般程序
探讨
试比较根、茎、叶作外植体进行离 体培养的特点
速繁殖无性系、培养无病毒苗、品种改良。
二、茎尖培养一般方法 （一）材料的制备
健壮枝梢-去除叶片-分成1-2cm-自来水冲洗消
毒-75%的酒精30秒-0.1%升汞或20倍次氯酸钠消毒 8-10min-无菌水-修剪剥离茎尖，通常切割下顶端 0.1-0.1叶原基的茎尖-（无菌水）-接种。 （二）培养基
多为MS培养基及其改良配方，还有White配方、
Raggio1965年等设计了离体根的结瘤实验装
置。 此装置由两个部分组成，下部是试管，管中 装有含无机盐的营养液，并接种根瘤菌，上部是 玻璃盖，盖中有一单向开口的管状凹槽，槽中盛
放含有有机化合物的琼脂固体培养基。故有机营
养从根基部吸收，无机营养从根尖吸收。
Bunting和 Horrocks1964年修改 了Raggio等的装置， 变为在粗沙中提供无 机盐。利用这一技术 研究菜豆、大豆等离 体根根瘤菌的固氮情 况，结果表明这些根 瘤菌含有血红蛋白， 并能固定大气中的氮。
第四章
器官培养
宜职院08.9
目的与要求 了解离体根培养的实践意义，掌握离体根的培 养方法，熟悉离体根培养的培养基配方。了解植物 茎尖培养的意义，掌握茎尖培养的方法，以及茎尖 微繁技术。掌握叶培养概念，离体叶组织培养方法， 了解影响叶片组织脱分化和再分化因素。 具有植物离体根培养的认知和进行根培养的基 础能力，具有熟练进行植物茎尖培养和茎段培养的 能力，具有叶培养认知和进行叶培养的基础能力。
⑶细胞分裂素与生长素的组合
细胞分裂素与生长素配合使用，诱导芽分 化效果好于单独使用细胞分裂素。 ⑷供试植株的发育时间和叶龄 个体发育早期的幼嫩叶片较成熟幼嫩叶片分
化能力高，发育完全的叶片组织器官分化能力较
幼龄叶片组织再分化能力低得多。 ⑸叶脉 叶脉、叶柄分化能力较强。
⑹极性
叶背面朝上放置就不生长。
苜蓿浓度(mg/L)
200 200 65 82 18.6 740 4.5 4. 2.7 1.5 0.8 0.004 0.02 3 0.5 0.1 0.1 20000 5.5
西红柿浓度(mg/L)
143.9 100 40 10.6 368.5 3.35 2.25 1.34 0.75 0.38 0.002 0.01 4 0.75 0.1 0.1 15000 5.2
茎段
茎尖取 材有限，可 采用带节或 不带牙的茎 段进行培养。
第三节
叶的培养
一、离体叶培养概念及意义 1、离体叶培养概念 指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶 等叶组织的无菌培养。多经脱分化形成愈伤组 织，再由后者分化出茎和根。
2、离体叶培养意义 ⑴研究叶形态建成、光合作用、叶绿素形成等理 论问题的良好方法。 ⑵通过叶片组织的脱分化和再分化培养，以证实 叶细胞的全能性。 ⑶通过离体叶组织、细胞的培养，探索离体叶组 织、细胞培养的条件和影响因素。 ⑷利用离体叶组织的再生特性，建立植物体细胞 快速无性繁殖系，提高某些不易繁殖植物的繁殖系 数。 ⑸叶细胞培养物是良好的遗传诱变系统，经过自 然变异或者人工诱变处理可筛选出突变体应用于育 种实践。
⑺损伤
损伤后刺激诱导愈伤组织生长和器官发生。
3、离体叶组织的茎和芽发生途径
⑴直接产生不定芽
⑵由愈伤组织产生不定芽
⑶胚状体形成
⑷其他途径
叶片的分化程度较高，一般需要通过诱导 愈伤组织并经再分化才能产生植株，变异率较 高。再分化能力弱的植物种类而言，叶片离体 再生的难度相当大。
思考
1、简述植物离体根培养方法 2、植物茎尖培养有什么类型？ 3、茎尖微繁技术要点
（二）叶片组织的脱分化与再分化培养
1、叶组织培养的一般方法
⑴叶组织分离与消毒
大多数植物的叶原基、幼嫩叶片，双子叶 植物的子叶，单子叶植物心叶的叶尖组织， 都可用于叶组织的脱分化与再分化培养。
方法一：
幼嫩叶片培养时：选取植株顶端未充分展
开的幼嫩叶片——流水冲洗——蘸有少量75%酒精
的纱布擦拭叶片两面——放入0.1%升汞溶液中消 毒5-8min——无菌水冲洗3-4次——消毒后叶片转 入到铺有滤纸的无菌培养皿内——解剖刀切成 0.5cm×0.5cm左右的小块或薄片（如叶柄和子
灰渣、锯木屑等。
⑶防止杂菌滋生：保持环境干净，农药灭菌。 ⑷注意光温管理：避免阳光直射、温度适宜。
（二）影响茎尖微繁因素 1、基因型 2、外植体大小 3、供试植株生理状态 4、芽在植株上部位 5、供试植株年龄 6、培养基 7、褐变 8、玻璃化 9、极性 10、后生变化 11、中间繁殖体的形态发生能力 12、遗传稳定性
第二节
一、概念和意义
茎尖培养
1、茎尖培养概念
茎尖分生组织培养：指对不超过0.1mm的茎 尖或几十微米的茎尖进行的培养。特点：可获无 病毒苗，操作困难，成苗时间长。 普通茎尖培养：对几毫米至几十毫米长的茎
尖、芽尖及侧芽的培养。操作技术简单、易成活、
成苗时间短、繁殖速度快。
2、茎尖培养意义
茎尖培养在园艺植物离体培养中最常见，可快
第一节
根的培养
一、根培养的实践意义 1、是进行根系生理代谢研究的最优良试验体 系。 2、是研究器官分化、形态建成的良好体系。 3、建立快速生长的根无性系，对药物生产有 重要意义。
4、对根细胞培养物进行诱变处理，可筛选突
变体，用于育种实践。
二、离体根的培养方法 1、培养步骤： 离体根培养的第一步是要获得无性繁殖系。 方法如下： 种子表面消毒——无菌条件下萌发——根伸 长后切取1.0cm长的根尖——接种于培养基——侧 根生长——切取侧根的根尖扩大培养——获离体根 无性系
2、芽的增殖 ⑴顶芽和腋芽的发育；利用顶端优势 ⑵诱导不定芽产生；外植体直接产生不定芽
外植体脱分化-愈伤组织-不定芽
⑶原球茎的发育； 原球茎—种子发芽时，胚根部不出现，胚 逐渐增大，种皮一端破裂，膨大的胚呈圆锥状， 称为原球茎。即缩短的、珠粒状的、胚性细胞组
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成、类似于球茎的器官。
芽和种子发育—原球茎—植株
二、叶培养方法 （一）叶原基培养：叶原基培养是研究形态建成 的重要手段。 1、采用休眠期顶芽，剥去一部分鳞片。 2、在次氯酸5%溶液中浸泡20min，进行表面消毒。 3、切取柱状叶原基进行培养。 培养基采用Knop’s无机盐（部分修改）或 Kundson（1951）配方，添加Nitsch配方中的微 量元素（再加CoCL225mg/L）和2%蔗糖、8%琼脂， Ph5.5。部分实验中添加维生素、NAA、水解酪蛋 白等，温度24℃，人工光照24h。
B5配方、Heller配方、Gautheret配方等。
（三）培养方法 1、固体培养法 特点：琼脂做凝固剂，茎尖基部紧贴培养基。 优点：操作较为简单，普遍。 缺点：对有些植物培养较难。 操作：培养基分装——灭菌——冷却——茎尖 接种——25+3℃培养。 2、纸桥培养法 滤纸取代琼脂，液体培养基。 优点：营养物质能均衡持久地供给外植体，利 于外植体健康生长。 缺点：操作复杂。
3、中间繁殖体的增殖
第二阶段产生的芽、苗和原球茎，统称为中间繁 殖体。 茎尖的发育方向及调节是采用生长调节剂，BA、 KT、2iP促进发芽，IBA、NAA、2，4-D促生根。
4、壮苗和生根
胚状体可直接成苗，腋芽和不定芽须转入生根培 养基培养。矿质元素高利于茎叶生长，低利于生根， 故生根培养基中无机盐低。