新城疫病毒分子生物学及其疫苗的研究进展_侯巍

新城疫（Newcastle Disease，ND）是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一，自1926年首发于印度尼西亚和英国新城以来，在其近80年的历史中，新城疫在全世界曾发生过多次大流行［1］。

近年来虽无世界性流行，但区域性爆发新城疫的报道却屡见不鲜，在我国许多地区每年都有此病的发生，并且在水禽和野鸟体内也分离到新城疫病毒。

新城疫病毒的分子生物学研究及其应用方面取得了重大成就，现将新城疫病毒的分子生物学及其新城疫疫苗的研究进展综述如下。

1新城疫病毒的分子生物学特性1.1NDV的形态学特征该病毒是副粘病毒科、副粘病毒属成员，成熟的病毒粒子的直径为100~250nm，有囊膜的病毒粒子通常呈圆形，囊膜上有纤突约长为8nm，其内部为一核心—核衣壳结构，直径约为17nm。

新城疫病毒极不稳定，用乙醚处理使病毒粒子彻底破坏，囊膜表面具有HA和NA。

1.2NDV病毒的理化特征新城疫病毒在55℃经45min或阳光直射下经30min灭活。

4℃经几周，-20℃经几个月，-70℃经几年感染力不受影响，碳酸钠和氢氧化钠的消毒效果不稳定，大多数去垢剂能迅速将其灭活。

总的来说，NDV对理化因素的抵抗力相当强。

在实际中，新城疫暴发后经2~8周，仍能从鸡舍、产蛋巢、羽毛和其他物质中分离到病毒。

1.3病毒的生物学活性1.3.1血凝性：NDV具有凝集红细胞的特性，是由于HN蛋白能结合于红细胞表面的受体。

所有的NDV毒株都可凝集人、小鼠、豚鼠的红细胞。

1.3.2神经氨酸酶活性：它是HN分子的一部分，存在于副粘病毒属的所有成员。

其酶的作用是可将病毒逐渐从红细胞上洗脱下来，另外NA还作用于受体位点，是F蛋白充分接近而发生病毒与细胞膜的融合。

1.3.3细胞融合与溶血：病毒复制时附着于受体位点，继之病毒囊膜与细胞膜融合，也可导致两个或多个细胞融合。

红细胞膜常因与病毒之间的膜融合和导致红细胞溶解，产生溶血。

1.4病毒的培养NDV易在10~12日龄鸡胚尿囊胸腔中生长，接种病毒后鸡胚在24~72h死亡，呈现出血性病变和脑炎。

感染的尿囊液能凝集红细胞。

大多数毒株能在许多继代细胞和传代细胞中增殖。

最常见的为鸡胚成纤维细胞，但是细胞培养物的病毒浓度常比鸡胚低一个滴度。

1.5病原性NDV各毒株对不同宿主的致病力变化很大。

对鸡是高度敏感的毒株，对鸭和鹅的敏感性弱，或不表现新城疫病毒分子生物学及其疫苗的研究进展侯巍（四川省动物疫病预防控制中心，四川成都610041）摘要：新城疫是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一，特别是对养鸡业造成重大经济损失。

利用分子生物技术已研究出了很多基因工程疫苗用于预防鸡新城疫，比如基因工程活载体疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗等。

近年来随着反向遗传操作技术的发展，新城疫病毒已经被开发成病毒载体，可以携带外源基因研制新城疫病毒活载体疫苗，表达IBDV和IBV的新城疫活载体疫苗已经成功研制。

本文将从新城疫病毒的分子生物学及疫苗方面进行综述。

关键词：新城疫病毒；分子生物学；疫苗收稿日期：2011-06-22作者简介：侯巍（1983-），女，辽宁抚顺人，硕士研究生，从事预防兽医工作。

中图分类号：S851.33文献标识码：A文章编号：1673-8403（2011）09-0007-047临床症状。

前体蛋白F0需要裂解成F1、F2，才能使子代病毒粒子具有感染性，这种裂解是由宿主细胞蛋白酶来完成的。

若使其不裂解，则产生非感染性病毒粒子。

胰酶可以裂解NDV所有毒株的的F0，体外处理非感染性病毒可恢复其感染活性。

1.6病毒的基因组病毒的基因组由约15156个核苷酸组成，分子量（MW）约为5.5×106u，为单一开放阅读框架，至少编码六种病毒特异性的蛋白（L、NP、P、HN、F、M），几个结构蛋白在基因组上是按：3′-NP-P-M-F-HN-L-5′的顺序排列［2］。

每一基因末端含有转录终止序列及Poly（A）序列，每一基因的起始端和终止端有10～12个核苷酸是半保守的，这些保守序列为基因的扩增提供了必要条件。

L、NP和P三种蛋白称为内部蛋白，三者与病毒基因组RNA相结合构成病毒核衣壳。

L蛋白（Large protein）分子量220ku，是与RNA复制和转录过程密切相关的主要辅助性蛋白，是一种病毒RNA依赖性的RNA聚合酶。

NP蛋白（Nucleuo protein）分子量56ku，与病毒基因组RNA 相结合形成核衣壳，在转录和复制过程中充当模板。

P蛋白（Phospho protein）分子量39ku，为磷酸化蛋白，同病毒基因组RNA共同构成核衣壳，Hamaguchi 等证明其在病毒RNA合成过程中起着重要作用［3］。

M、HN和F称为囊膜蛋白。

M蛋白（Matrix protein）位于囊膜内层，分子量39ku，在RNA的合成和病毒的自身装配中起重要作用，此外，M蛋白还是病毒脂质囊膜内表面的支持物，能够维持病毒结构的完整性。

最重要的两个蛋白是HN蛋白（Haemagglutinin Neuraminidase protein）和F蛋白（Fusion protein），HN蛋白和F蛋白是构成NDV致病作用的分子基础。

2新城疫疫苗的研究进展2.1新城疫的常规疫苗目前在新城疫免疫预防中使用的常规疫苗主要有各种不同毒力的弱毒疫苗和灭活疫苗。

常用的活疫苗有I系(中等毒力)、Ⅱ系、Ⅲ系(毒力较弱)、Ⅳ系(LaSota株，毒力比Ⅱ系稍强)、V4株(耐热性好，毒力最弱)等。

其中Ⅳ系苗LaSota及其克隆化株Clone-30等在我国广泛应用且公认免疫效果较好。

徐秀臣等的试验证实ND-Clone30(C30)是目前比较理想的活疫苗，经过克隆化的C30毒力比LaSota株低，但仍保有原株的免疫原性。

用10个免疫剂量免疫7～10日龄雏鸡不引起症状，7d产生免疫力，14～21d达高峰，1次免疫持续期2个月，保护率达95％以上，受母源抗体影响小。

现在应用已逾数亿羽份，免疫效果良好。

王林果等用各种禽源分离株制备的灭活油乳剂疫苗研究对不同禽类的免疫效果，结果表明，APMV-1各种禽源分离株和经典疫苗株C30的灭活油乳剂苗对鸡、鹌鹑、鸽和鹅都有较好的免疫保护效果，仍能抵抗近年来从各种禽类分离的病毒。

APMV-1强毒株及标准强毒株F48E9的攻击，说明APMV-1各种禽源分离株之间的抗原性差别不大，各分离株与经典疫苗株C30虽然分属不同基因型，但它们的抗原性并不存在明显差异，C30株仍是我国各种禽类的良好疫苗，这与很多其他报道的结果基本一致。

在热带和亚热带地区广泛应用的NDV V4克隆株疫苗，在我国也进行了较系统的研究和应用。

邵华斌等对从澳大利亚引进的NDV V4自然无毒株选育成的NDV V4/鄂92株进行了生物学特性和免疫性测定。

该毒株在56℃6h病毒活性无影响，室温条件(10℃～25℃)保存6个月，37℃保存2周病毒仍有活力；37℃8周内H A滴度不变；鸡胚平均致死时间(MDT)>168h；1日龄雏脑内致病指数(ICPI)为0.00。

制备活疫苗安全性试验表明，用10倍使用量接种7日龄雏鸡无不良反应；最小免疫量表明，用104EID50/0.1ml免疫18日龄雏鸡，14d后攻毒保护率达90%；免疫持续期试验证明，用106EID50免疫18日龄易感雏鸡，有效抗体（H I> 1∶16）可持续4个月以上；保存期试验证明，疫苗-15℃保存有效期为18个月，4℃～8℃保存为4个月。

由于该疫苗耐热性、安全性较好，适用于农村散养户免疫预防。

为了减少因免疫次数多对鸡群的应激反应，近年来国内对联苗的研究也更加重视。

新城疫、传染性支气管炎联合疫苗早已研制成功，并可将2种病毒接种于同一鸡胚中生产疫苗，试验结果证明，这种疫苗具有良好的免疫效果和实用价值。

王丽男等对鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病三联活疫苗的安全性和免疫效力进行了试验，结果证明该疫苗的安全性和免疫效果良好。

用常规量的10倍剂量接种雏鸡未见不良反应，鸡群状态良好；雏鸡接种后7d逐渐产生免疫力，20d达高峰。

该三联苗具有安全有效、使用方便等优点。

张秀美等用3种不同来源的新城疫、禽流感二联灭活油乳剂苗免疫商品肉用仔鸡群，跟踪检测其免疫抗体水平。

结果发现，3种疫苗免疫后的NDV抗体水平都较好，但禽流感病毒抗体水平表现不一，特别是H5亚型抗体水平一直处于免疫临界线以下。

因此提出禽流感病毒抗原与其他抗原联8合免疫是否可行的问题。

多联苗的田间免疫保护效果尚有待进一步跟踪研究。

近年来进行了不少免疫增强剂的研究。

张春杰等应用R T-P C R技术，在国内首次从NDV I系苗接种的鸡胚脾细胞中扩增出鸡IL-18全基因，并将该基因定向克隆至p c D N A，载体上构建了鸡：IL-18真核表达载体(pcD，NA3-ILl8)，进而观察其对N D V疫苗的免疫增强作用。

结果表明，同时接种pcDNA3-ILl8质粒和NDVⅣ系活疫苗的免疫鸡在接种后35d内(特别是15d后)所产生的HI抗体效价、T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖反应均高于单纯Ⅳ系活疫苗免疫组及pcDNA3空白质粒和Ⅳ系活疫苗联合免疫组鸡。

田兴山等研究人工合成免疫刺激C p GDNA联合NDV疫苗对SPF鸡免疫应答的影响。

以NDV为模式病毒，分别以不同浓度人工合成韵免疫刺激序列CpG DNA联合NDV低毒力活疫苗(C30)免疫SPF新雏鸡。

结果显示，不同浓度的C p GD N A均能显著提高仔鸡的特异性抗体滴度、淋巴细胞白介素-2诱生活性以及淋巴细胞增殖反应，证明CpG DNA能增强鸡对常规疫苗的免疫应答能力。

徐怀英等研究N D壳聚糖微球疫苗及其免疫效果。

壳聚糖是一种优良的天然载体，具有良好的生物相容性和生物降解性，制备的微球(Microsphe-re,MS)具有控制释放、靶向作用等特点，被广泛地用于药物、酶等的载体。

试验以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，选择适当的乳化体系，制备出粒径小、分散性好、抗原含量及包封率高的疫苗微球。

与LaSota系活疫苗(滴鼻)、灭活苗(肌注)同时对比免疫SPF鸡，进行MTF试验(测淋巴细胞转化率)、血清、HI抗体检测和攻毒保护试验等，证实ND壳聚糖微球疫苗(口服)具有较好的免疫效果。

2.2新城疫的新型疫苗2.2.1亚单位疫苗：亚单位疫苗是利用重组DNA技术高效表达NDV的免疫原性基因，并辅以佐剂而制成的疫苗。

目前，国内外科研工作者已广泛开展了关于包含保护性抗原的亚单位疫苗的研究。

丁壮等［4］利用相同系统表达的NDV长春株的HN蛋白作为亚单位疫苗，雏鸡可抵抗NDV强毒攻击，并可获得100%的保护。

与常规疫苗相比，亚单位疫苗在制备、免疫程序和免疫剂量上都需要大量的人力、物力、财力，并且使用单一蛋白进行免疫，不能产生和全病毒免疫相同的免疫效果，因此亚单位疫苗没有得到广泛应用。