聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤全面.doc

聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤

一、制胶前的准备

1、玻璃板的准备

用洗涤剂将玻璃板反复擦洗，然后用清水冲洗干净，待玻璃板晾干后，将1mm塑料薄片沾少许清水，使其贴在玻璃板上，然后将另一块凹行玻璃板与原玻璃板紧贴。

2、垂直平板支架的安装

将准备好的玻璃板，放入垂直支架内，两侧用钢夹使其固定，钢夹的高度不要超过凹行玻璃的凹口处为宜，两侧选用力度大小适中、对称的钢夹。

3、玻璃板的密封

将1%琼脂糖用微波炉加热融化后，倒入支架板底槽中，使其密封即可，然后用吸管吸取少量琼脂溶液，沿玻璃板两边的缝隙内加入，使其密封，待其冷却凝固后备用。

二、凝胶的制备

1、30%的丙烯酰胺溶液的配制（1L）

配方：丙烯酰胺（Acr）290g 甲叉双丙烯酰胺（Bis）10g

步骤：称取样品，倒入烧杯中

用蒸馏水定容至1 L

将烧杯置于搅拌器上，使溶液充分溶解至透明

将完全溶解的溶液分多次过滤到棕色容器中保存备用

2、10ｘTBE溶液的配制（1L）

配方：Tris：108g；硼酸：55g ；EDTANa２：7.44g

步骤：称取各成分至烧杯

用蒸馏水定容至1L

用玻璃棒搅拌至溶剂完全溶解

分瓶倒装待用

3、PAGE凝胶的制备（一块胶为例）

配方：30%的丙烯酰胺溶液10ml ; 10ｘTBE溶液4ml；双蒸水16ml;20%的过硫酸铵（AP）200ul;TEMED溶液20ul

步骤：将各成分称量好之后混合好以备灌胶

4、灌胶

把垂直支架倾斜30°，将配好的PAGE凝胶溶液沿凹形玻璃平口处缓缓倒入至距平口7mm处为宜，倒入过程中要避免气泡的产生，发现有气泡产生时，要待气泡消失后再倒入。灌胶完成后，用枪吸取少量水密封胶口，压平胶面。当胶面与水之间有一条明显的界限时，表示凝胶已凝固，可以开始点样电泳。

三、点样及电泳

1、0.5ｘTBE缓冲溶液的配制

量取950ml的蒸馏水，然后加50ml的10ｘTBE溶液至1000ml处，装瓶摇匀，备用。

2、垂直平板电泳槽的安装

将制作好的胶放入垂直电泳槽内，凹形玻璃向内侧。选择合适的梳子，轻轻插入玻璃板内，梳子底部与胶面刚好接触为宜。将插好梳子的玻璃板紧贴电泳槽的硅胶密封圈，用钢夹使其固定。

倒入0.5ｘTBE缓冲溶液于电泳槽内，以刚好淹没凹形玻璃平口为宜。

3、点样

用微量移液器吸取1ul的溴酚蓝溶液，根据PCR产物量大小吸取适量样品，点入胶孔内即可。每次加样前，微量移液器要用蒸馏水清洗，以避免交叉污染。为了确保各个胶孔之间都相互隔离，

在点样之前可先吸取少量的溴酚蓝点入胶孔两端，看是否有渗漏现象，如果有渗漏现象，要重新安装梳子。每块胶都要点上maker标记。

4、电泳

点样结束后，接通电源，调节电压至300V，90min，时间电泳时间根据PCR产物分子量适当延长。

四、染色、显影

1、染色液、显色液的配制

染色液：0.1%AgNO3。AgNO3 1g 加水至1L 溶解待用。

显色液：2%NaOH。NaOH 20g 加水至1L溶解待用

2、取胶

把电泳完成后的玻璃板取下，小心拔出梳子

揭去凹形玻璃，去掉底部的琼脂凝胶，小心将胶揭下，放入染色槽中

3、染色

将胶用蒸馏水冲洗2次，倒入适量的染色液，以淹没胶体为宜，计时10min

4、显影

染色好的胶体，用蒸馏水冲洗2次，倒入显色液（用前加3ml的甲醛），轻摇至显出清晰的带为止

5、拍照

将显好色的胶用水冲洗2次后，置于玻璃板上，在室温下拍照，用于分析处理。