(完整版)流式细胞仪检测细胞凋亡
流式细胞仪在凋亡检测中的应用
流式细胞仪在细胞凋亡中的应用随着流式细胞术检测技术的发展以及越来越多的荧光探针、检测试剂盒的出现，应用流式细胞仪进行凋亡细胞的检测成为细胞凋亡研究中的新手段。
流式细胞术检测细胞凋亡是通过检测其光射特征及荧光参数进行的。
1 光散射法检测细胞凋亡：在流式细胞仪系统中，被检细胞在液流中通过仪器测量区时，经激光照射，细胞向空间360°立体角的所有方向散射光线，其中前向散射光(forward scatter,FSC)的强度与细胞大小有关，而侧向散射光(side scatte,SSC)的强度与质膜和细胞内部的折射率有关。
细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，核碎裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞FSC降低而SSC增高。
细胞坏死由于胞体肿胀，细胞核亦碎裂解，故FSC和SCC均增高。
正常细胞FSC高而SSC低。
根据光散射特性与细胞表面免疫荧光分析结合起来，用以区别辨认经这些特殊处理发生选择凋亡的淋巴细胞亚型，也可用于活细胞分类。
根据FSC和SSC判断凋亡细胞的可靠性受被测细胞形态上的均一性和核细胞浆比率影响很大，因此在某此淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好而在肿瘤细胞凋亡中其可靠性较差。
2碘化丙啶染色法检测细胞凋亡：碘化丙啶是常用的DNA染料，属于插入性荧光染料，可选择性定量嵌入DNA/RNA双螺旋结构中，受激后发射波长为620nm，由于碘化丙啶不能通过活细胞膜进入细胞内染色，因此具体操作用要用细胞经体积分数为70%的乙醇在细胞膜上打孔，把染料引入细胞内并将细胞固定。
细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰(apoptotic peak,AP),代表凋亡细胞。
根据此亚二倍体峰可以计算细胞的凋亡指数。
此方法优点是可定量检测，灵敏度高。
(完整版)流式细胞仪检测细胞凋亡
流式细胞仪检测细胞凋亡:PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器PBS溶液；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。
用棕色瓶4℃避光保存。
70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。
2. 3ml PBS洗涤1次。
3. 离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。
流式细胞仪检测早期细胞凋亡：AnnexinVPI双染色法
流式细胞仪检测早期细胞凋亡：AnnexinVPI双染色法流式细胞仪检测早期细胞凋亡:Annexin V/PI双染色法作者：发布日期：(2009-06-24) 浏览次数：0次细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。
这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。
PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。
巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症反应。
Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性，对PS有高度的亲和性。
因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。
PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。
两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。
因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。
凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如（PI）有拒抗染性，坏死细胞则不能。
细胞膜有损伤的细胞DNA可被PI着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。
因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。
在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为Annexin V -/PI-；右上象限是凋亡晚期细胞或凋亡继发性坏死细胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为早期凋亡细胞，显现Annexin V +/PI-（图1）。
图1 细胞凋亡的Annexin V-FITC/PI检测法试剂准备结合缓冲液：10mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2Annexin V-FITC溶液碘化丙锭（PI）溶液实验步骤1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，500~1000r/min离心5min，弃去培养液。
流式细胞仪检测细胞凋亡
流式细胞仪检测细胞凋亡:PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器PBS溶液；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。
用棕色瓶4℃避光保存。
70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。
2. 3ml PBS洗涤1次。
3. 离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。
流式细胞仪检测凋亡
流式细胞仪检测凋亡细胞凋亡的检测方法众多，流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。
由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。
因此，具有其它方法无可比拟的优越性。
本文主要结合我室的一些实际经验，力图简单明了的介绍流式在检测凋亡方面的应用。
下面是一幅凋亡过程图。
在凋亡诱导剂的作用下，首先是细胞色素C和apa f－1形成复合体，线粒体的功能发生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰丝氨酸外翻，这时细胞的形态已经发生了改变，可以看到细胞变小，胞核皱缩；最后是细胞内DNA断裂，形成凋亡小体。
在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的流式细胞仪的检测方法，我室曾经检测过的方法包括：1线粒体功能2DNA Cycle3 Caspases4Annexin V Assay6DNA Fragmentation Assays基本上涵盖了细胞凋亡的各个期，对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。
线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。
其检测主要采用阳离子型荧光染料。
原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。
可以在荧光显微镜下，或流式检测。
采用488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。
整个实验过程操作简单，只需要30min就可以见到结果。
Caspase家族可以检测的分子非常多，也有不少商业的试剂盒可以应用。
即使没有相应的试剂盒，只要有相应抗体基本上是可以检测的，具体的方法是参照细胞内蛋白检测的步骤。
在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。
在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。
Annexin－V是一种35－36 KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。
凋亡流式检测步骤
凋亡流式检测步骤凋亡是细胞生命的一个重要过程，它在生物体的正常发育和维持内稳态中起着关键作用。
凋亡的流式检测是一种常用的实验方法，通过分析细胞的染色性质和形态特征，可以快速准确地检测细胞的凋亡状态。
下面将介绍凋亡流式检测的具体步骤。
一、细胞样本的准备1. 收集需要检测的细胞样本，可以是细胞培养物或组织样本。
2. 用无菌PBS缓冲液洗涤细胞样本，去除培养基或组织液中的杂质。
3. 用离心机将细胞沉淀下来，去除上清液。
二、细胞的染色1. 用无菌PBS缓冲液重新悬浮细胞，使细胞浓度达到合适的浓度。
2. 加入适量的凋亡检测染料，常用的染料有Annexin V和PI。
3. 在室温下孵育一定时间，使染色剂与细胞充分反应。
三、流式细胞仪的设置1. 打开流式细胞仪，进行仪器的预热和校准。
2. 根据染色的荧光信号选择相应的检测通道，并设置适当的增益和门控。
3. 将已染色的细胞样本加入流式细胞仪的样本管中。
四、数据采集与分析1. 开始流式细胞仪的运行，以恒定的速度将细胞样本通过激光束。
2. 细胞在激光束中逐个通过，激光照射下的细胞会发出特定的荧光信号。
3. 流式细胞仪会记录下每个细胞的荧光信号，并将其转化为数字信号。
4. 利用流式细胞仪软件对采集到的数据进行分析和统计。
5. 根据细胞的荧光强度和染色的特征，可以判断细胞的凋亡状态。
通过以上步骤，我们可以快速准确地检测细胞的凋亡状态。
凋亡流式检测的优点是可以同时检测大量的细胞，具有高通量和高灵敏度的特点。
它在细胞生物学、免疫学和药物研发等领域都有广泛的应用。
值得注意的是，凋亡流式检测中的染色剂选择和流式细胞仪的设置对结果的准确性和可靠性有重要影响。
因此，在进行凋亡流式检测之前，需要仔细选择适合的染色剂和校准流式细胞仪。
同时，对于不同类型的细胞和凋亡机制，可能需要针对性地进行优化和调整。
凋亡流式检测是一种重要的实验方法，可以快速准确地检测细胞的凋亡状态。
通过合理的样本准备、细胞染色、仪器设置和数据分析，可以获得可靠的实验结果。
细胞凋亡的形态实验报告
一、实验目的本实验旨在观察细胞凋亡的形态学特征，了解细胞凋亡的发生过程，为细胞凋亡的研究提供形态学依据。
二、实验材料1. 细胞培养：小鼠胚胎成纤维细胞（NIH 3T3细胞）；2. 试剂：H2O2（双氧水）、Annexin V-FITC、PI（碘化丙啶）、RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液；3. 仪器：倒置显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪、超净工作台、CO2培养箱。
三、实验方法1. 细胞培养：将小鼠胚胎成纤维细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的CO2培养箱中培养，待细胞生长至80%左右时，进行实验处理。
2. 实验分组：（1）正常组：不做任何处理，作为对照组；（2）凋亡组：加入0.8mol/L H2O2溶液处理细胞24小时。
3. 细胞染色：（1）Annexin V-FITC/PI双重染色：收集细胞，用PBS缓冲液洗涤2次，加入Annexin V-FITC和PI，室温避光孵育15分钟；（2）H.E染色：收集细胞，用PBS缓冲液洗涤2次，加入H.E染色液，室温避光孵育15分钟。
4. 细胞观察：（1）荧光显微镜观察：用荧光显微镜观察细胞凋亡形态学特征，包括细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等；（2）流式细胞仪检测：用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
5. 数据分析：采用SPSS软件对实验数据进行统计分析。
四、实验结果1. 荧光显微镜观察：凋亡组细胞出现细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等形态特征，与对照组相比，凋亡组细胞凋亡率显著升高（P<0.05）。
2. 流式细胞仪检测：凋亡组细胞凋亡率显著升高（P<0.05），约为对照组的2倍。
五、实验讨论1. 细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，具有形态学特征，如细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等。
本实验中，凋亡组细胞出现这些形态特征，表明细胞凋亡已发生。
2. Annexin V-FITC/PI双重染色是一种常用的细胞凋亡检测方法，可以检测细胞凋亡率。
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡A n n e x i n V检测细胞凋亡 (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的D N A断裂片段分析 (7)实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)B r d U F l o w K i t s检测细胞增殖 (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits 试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)A c t i v e C a s p a s e-3检测细胞凋亡 (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)A n n e x i n V检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。
实验用品1. 一次性12⨯75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8︒C保存。
3. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10⨯，使用时，用稀释为1⨯浓度的应用液。
流式检测凋亡实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握流式细胞术的基本原理和操作流程。
2. 学习流式细胞术检测细胞凋亡的方法和技巧。
3. 了解细胞凋亡在生物学研究中的重要性。
二、实验原理细胞凋亡（Apoptosis）是一种由基因调控的细胞程序性死亡过程，对于维持生物体内环境的稳定具有重要意义。
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种基于激光的细胞分析技术，可以快速、准确地检测细胞的各种生物学特性。
通过流式细胞术检测细胞凋亡，可以了解细胞凋亡的发生过程、细胞凋亡相关基因的表达情况以及细胞凋亡在疾病发生发展中的作用。
三、实验材料1. 细胞：人肺上皮细胞（A549细胞）。
2. 试剂：Annexin V-FITC/PI染色试剂盒、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、EDTA、PBS缓冲液、胎牛血清等。
3. 仪器：流式细胞仪、细胞培养箱、细胞计数仪、显微镜等。
四、实验方法1. 细胞培养：将A549细胞接种于培养皿中，置于细胞培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期。
2. 细胞凋亡诱导：将细胞分为实验组和对照组，实验组加入一定浓度的凋亡诱导剂（例如：顺铂），对照组加入等量的PBS缓冲液。
3. 细胞处理：将实验组和对照组细胞分别收集，用胰蛋白酶和EDTA消化细胞，用PBS缓冲液清洗细胞，调整细胞浓度至1×10^6个/mL。
4. 细胞染色：取100μL细胞悬液，加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，混匀，室温避光孵育15分钟。
5. 流式细胞术检测：将染色后的细胞悬液注入流式细胞仪，设置合适的参数进行检测。
6. 数据分析：利用流式细胞术分析软件对检测数据进行处理和分析，得到细胞凋亡率。
五、实验结果1. 细胞凋亡率：通过流式细胞术检测，实验组细胞凋亡率为30%，对照组细胞凋亡率为5%。
2. Annexin V-FITC/PI染色结果：实验组细胞在Annexin V-FITC/PI染色后，大部分细胞位于Annexin V-FITC/PI双阳性区域，表明细胞发生了凋亡；对照组细胞主要位于Annexin V-FITC/PI单阴性区域，表明细胞未发生凋亡。
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 - 凋亡细胞的 DNA 断裂片段分析
凋亡细胞的D N A断裂片段分析
实验原理
在细胞发生凋亡后，最早出现胞膜外翻等现象，之后发生的程序性改变之一，就是细胞核酸内切酶激活，出现DNA 断裂片段。
核酸酶将染色质的高级结构断裂为50-300kb 的片段，最终断裂为200bp 大小的DNA 碎片。
DNA 碎片检测的方法是外源性TdT 酶催化反应，常指“end-labeling”或“TUNEL” (terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling)。
现在可以使用APO-DIRECT Kit，用流式细胞术来检测凋亡细胞由于DNA 断裂，造成DNA 链3’-OH 增多的情况。
在APO- DIRECT 分析中，TdT 酶催化DNA 单链和双链3’-OH 末端非模板依赖性的dUTP FITC 掺入反应。
由于采用了直接荧光标记的FITC-dUTP，所以一步反应后，就可以在流式细胞仪上检测DNA 碎片。
APO-DIRECT Kit（Cat. No. 6536KK）试剂盒：
实验用品
1.一次性12⨯75mm Falcon 试管
2.蒸馏水
3.PBS 缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8︒C 保存
4.固定液：含1%多聚甲醛的PBS 缓冲液
5. 70%乙醇
6.冰浴箱
7.微量加样器和加样头
8.APO-DIRECT Kit 试剂盒
9.流式上机检测。
细胞凋亡流式检测实验方案
细胞凋亡流式检测实验方案掌握细胞凋亡的检测方法，了解细胞凋亡的发生机制。
二、实验原理细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡过程，是正常细胞生长、发育和组织维持的重要机制。
细胞凋亡的发生涉及许多生物化学过程，包括蛋白酶的激活、蛋白磷酸化、核酸降解等。
目前，常用的细胞凋亡检测方法有DNA损伤、凋亡相关蛋白（如Caspase）的活性检测、Annexin V染色体外膜表面的磷脂酰胆碱变化等。
三、实验材料1. 细胞培养基、PBS缓冲液；2. Annexin V-PE/7-AAD染色试剂盒；3. 离心管、试管、离心机等。
四、实验步骤1. 将细胞接种于96孔或24孔板中，待细胞生长到适当密度后，按照不同处理方式分为不同组。
2. 处理细胞，如加入药物、病毒等，切换培养基等。
3. 用PBS缓冲液洗涤一次细胞，加入含Annexin V-PE/7-AAD染色试剂的PBS缓冲液，室温下酒暗处理15分钟。
4. 加入PBS缓冲液洗涤一次细胞，加入PBS缓冲液悬浮细胞，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。
五、实验结果分析1. Annexin V染色阳性、7-AAD染色阴性：表明细胞凋亡早期，细胞膜磷脂酰胆碱翻转，但细胞核仍完整无损。
2. Annexin V染色阳性、7-AAD染色阳性：表明细胞凋亡晚期，细胞膜磷脂酰胆碱翻转，细胞核已经破裂，DNA释放。
3. Annexin V染色阴性、7-AAD染色阴性：表明细胞无凋亡现象。
4. Annexin V染色阴性、7-AAD染色阳性：表明细胞处于坏死状态，细胞膜破裂，7-AAD染料可以进入细胞核结合DNA。
六、注意事项1. 实验过程中要注意无菌操作；2. 实验前要将所有实验材料消毒；3. 实验过程中要加强个人防护，穿戴实验室专用实验服、手套、口罩等；4. 实验结果分析时要注意对比组间差异明显性，结果分析应结合其他指标进行综合分析。
BD-FACSCalibur 流式细胞仪-细胞凋亡-操作步骤
BD/FACSCalibur流式细胞仪检测细胞凋亡操作步骤1、先给鞘液桶接超纯水。
2、把鞘液桶装上，拧紧。
3、开左边开关，从右向左依次打开，即总电源插头-交流稳定电压-插板-稳定输出电源。
（关机时从左向右关）。
4、按流式细胞仪开关。
换上新的已装超纯水的流式管。
5、将减压阀调至“run”（水缸旁边的黑色按钮）。
6、排气：将白色的手动排气阀从小头向大头移动，排气，2-3次，至无气泡。
最后停至小头。
自动排气：开始时是“低速”“standby”，调至“低速”“prime”，待排气完成会自动跳到“standby”，如此循环，到流式管内无气泡为止。
7、插电脑白色插头，打开电脑。
8、到无气泡时候调到“hign”“run”。
9、输入开机密码，打开电脑桌面上的“CELLQuest”（第四个图标）启动软件。
File→open Document→date→先找到打开自己之前的文件（cell dw 2018LSD）→Acquire→Connect to Cytometer→Acquisition面板中点击“change”修改文件名和日期，count改成1，即从第一个开始。
10、Acquire→counters→点击下面Acquisition control面板中的Acquire，看是否正常。
11、上样。
使仪器处于low run状态，样品管支架左移，上样品管后支架回位。
确认Acquisition control 窗口中Setup前需打勾（即不收集数据，用于仪器设置），点击Acquire。
仪器设置完成后，取消Setup前的“√”，点击Acquire 正式开始收集数据。
调界面操作：Cytometer →Detectors/Amps出现Detectors/Amps界面后，调FSC和SSC和FL1和FL3。
FSC调节的是门内细胞位置的左右，FSC调到E-1；SSC 调节的是门内细胞位置的上下，SSC调Voltage值，Amp Gain不动。
流式细胞仪检测凋亡和细胞周期等应用
荧光信号
使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色 分析
荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量
荧光样本制备
双色直接染色
端粒（荧光蛋白）
六）细胞内钙离子测定
1×106/ml的细胞悬液， 加入终浓度为1-5μmol/ml Fluo-3/AM，充分混匀， 室温避光作用60分钟。 以HEPES缓冲的Hank’s平衡盐溶液洗三次，重悬于 0.5ml同样的溶液，上流式细胞仪检测。 根据报告中给出的样品荧光强度计算细胞内钙离子 的浓度。
Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48
图 FCM测试细胞周
R1
期分布和凋亡
根据凋亡细胞的特点来检测
在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核 膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器 密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲， 但早期细胞膜的完整性未受到破坏
凋亡细胞的FSC ？SSC ？ 细胞坏死时，细胞肿胀，FSC ？，SSC ？
Date acquired: 14-Jan-03 File: 7Gy 4hr.001 Source: dongbo DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04
FCM检测胞内钙离子、 膜电位和线粒体功能
M1阴性界限划分完全是根据阴性对照！如下图：红色部分代表阴性对照，即： 所检测的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础 水平、未受刺激时等。蓝色部分即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、 药物作用后等。
六. 分选：
用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来， 用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 - Active Caspase-3 检测细胞凋亡
A c t i v e C a s p a s e-3检测细胞凋亡实验原理Caspase-3 在早期凋亡细胞中就已经活化，是凋亡程序中的重要的Caspase 酶。
凋亡细胞中，32kD 的原酶(Pro-caspase-3)裂解为一个17-21kD 亚单位和一个12kD 亚单位，两个亚单位形成二聚体，即为活化的Caspase-3，活化的Caspase-3 又水解、活化其它Caspase 酶和多种胞浆内成分（如D4-GDI，Bcl-2）和核内成分（如PARP）。
PharMingen 多克隆或单克隆Caspase-3 抗体可以识别Caspase-3 活化形式，它特异性识别由无活性的Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的断裂端，C92 单克隆抗体与Pro-Caspase-3 无交叉反应。
Active Caspase-3 Apoptosis Kit 特为流式细胞术分析凋亡细胞的Caspase-3 而设计。
包括荧光标记多克隆兔抗Active-Caspase-3 抗体（Anti-Active Caspase-3 FITC 或Anti-Active Caspase-3 PE）、固定/破膜剂、破膜/冲洗缓冲液。
实验步骤1Camptothecin 诱导细胞凋亡在DNA 合成中，需要拓扑异构酶I。
Camptothecin 是拓扑异构酶I 的抑制剂，它在体外依剂量不同而影响凋亡的发生。
在此，Camptothecin 做为常规的凋亡诱导方案，辅助细胞凋亡分析。
凋亡诱导试验用品1.用DMSO 制备1.0mM 的Camptothecin 储备液2.Jurkat T 细胞（ATCC TIB-152）凋亡诱导试验步骤1.1⨯106cells/ml 增殖的Jurkat T 细胞加入Camptothecin，Camptothecin 终浓度为4-6μM。
2.细胞37︒C 孵育4 小时。
2Active Caspase-3 染色步骤试验用品：1.12⨯75mm 的Falcon 管2.PBS 缓冲液3.凋亡检测试剂盒染色步骤：。
流式细胞仪细胞凋亡检测技术
流式细胞仪细胞凋亡检测技术一、固定细胞的染色方法1）PI单染色法方法一1．收集细胞（1～5）×106个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。
2．3ml PBS洗一次。
3．离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。
4．离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。
5．400目的筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃去PBS。
6．用1ml PI染液，4℃避光30min。
7．流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。
方法二1．收集细胞（1×106个），500～1000r/min离心5min，弃去培养液。
2．1ml PBS/FCS洗一次。
3．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，加入500μl PBS/FCS和500μl的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在4℃下固定4min。
4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％Tween 的PBS 1ml，37℃孵育15min。
5．1ml PBS/FCS洗3次，每次5min。
6．400目的筛网过滤1次。
7．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4℃避光至少30min。
染色在24h之内皆可行，流式细胞仪分析。
2）调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析1．离心收集细胞，PBS洗1～2次。
2．1％多聚甲醛低温下固定15min。
3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱内放置1～3天。
4．PBS轻洗1次5．细胞与TdT标记液37℃孵育，时间1～2h。
6．PBS轻洗1次。
7．细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。
8．含0.1％Triton-X 100的PBS轻洗1次。
4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％Tween 的PBS 1ml，37℃孵育15min。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
流式细胞仪检测细胞凋亡:PI单染色法
基本原理
其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：
1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器
PBS溶液；
PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。
用棕色瓶4℃避光保存。
70%乙醇
400目筛网
流式细胞仪
实验步骤
1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。
2. 3ml PBS洗涤1次。
3. 离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。
4. 离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。
5. 400目的筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS。
6. 用1ml PI染液染色，4℃避光30min。
7. 流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。
8. 结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。
如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。
注意事项
细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。
在分析结果时应该注意。