基因工程药物的分离纯化(ppt)
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分离纯化的技术要求： ①技术条件温和能保持产物生物
活性。 ②选择性好，能从复杂的混合物
中有效的将目的产物分离，达 到较高的纯化倍数。
③收率要高。 ④两个技数间能直接衔接，
不需要对物料加以处理。 ⑤纯化过程要快，满足高
生产率的要求。
⒈细胞破碎与固液分离
⑴细胞收集： 离心法、膜分离法。 ⑵细胞破碎：机械破碎法、非机械 破碎法。 ⑶固液分离
①配基固定化 ②吸附目的物 ③样品解吸
⑷凝胶过滤
凝胶过滤是以具有大小一定的多孔 性凝胶作为分离介质，小分子能进 入孔内，在柱中缓慢移动，而大分 子不能进入孔内，快速移动，利用 这种移动差别可使大分子与小分子 分开。
根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子 的动力学体积的大小差异，可以利用 凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。
①菌种的类型及其代谢特性。 ②原材料培养基的来源及其质量。 ③生产工艺及条件。
⒉物料中杂质的种类和性质。 ⒊目的产物特性。 ⒋产品质量的要求
二 、分离纯化的基本过程
发酵液
细胞分离 胞内产物
胞外产物
细胞破碎
固液分离
浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品
包含体 细胞碎片分离
变性
复性
三、分离纯化的技术
与反相色谱相比，疏水色谱回收 率较高，蛋白质变性可能性小。
⑶亲和层析（affinity chromatography，AC）
亲和层析是利用固定化配基与 目的蛋白质之间特异的生物亲 和力进行吸附，如抗体与抗原、 受体与激素、酶与底物之间的 作用。
配基：在亲和层析中起可逆性结 合的特异性物质。 载体：与配基结合的支撑物。 亲和层析大体可分三步：
固定相介质表面的疏水性比反相 色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚 合物键合相或大孔硅胶键合相。
流动相为pH6～8盐水溶液。
在高盐浓度时，蛋白质分子中疏 水性部分与介子的疏水基团产生疏水 性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白 质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐 步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗 脱时间越长。
⒉目的产物的分离纯化
目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和 生物学特性来决定。
产物特性
作
用
等电点 相对分子量 疏水性 生物特异性 溶解性 稳定性
决定离子交换种类及条件 选择不同孔径的介质
与疏水、反相介质结合的程度 决定亲和配基
决定分离体系及蛋白浓度 决定工艺采用温度及流程时间
基因工程药物的分 离纯化(ppt)
②含有大量细胞及代谢产物；
③表达产物稳定性差，易失活变 性；
④表达产物的种类繁多、结构不 一、活性各异；
⑤对其质量要求纯度高、无菌、 无热原。
一、建立分离纯化工艺的根据
⒈含目的产物的起始料的特点 基因工程菌的发酵产物其上游过程的 各种因素对分离、纯化工艺有影响。 包括：
⒊非蛋白质杂质的去除
DNA、热原质和病毒的纯化方法： ⑴ DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离 子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离 子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸 性，可选择条件使其吸附在阳离子交 换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏 水层析也有效。
⑵热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生 的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。 分子量小的多肽或蛋白质中的热原可 用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可 用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏 水性可用疏水层析法。
决定分离体系及蛋白浓度
决定工艺采用温度及流程时间
分离纯化的方法依赖色谱分离方法
⑴离子交换层析（ ion exchange chromatography IEC）
离子交换层析的基本原理是通过带电的 溶质分子与离子交换剂中可交换的离子 进行交换，从而达到分离的目的。
它具有分辨率高容量大操作容易，该法 已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要 方法。
⒉目的产物的分离纯化
目的产物含有大量杂质必须进 行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根 据其分子的理化性质和生物学 特性来决定。
产物的特性在分离纯化中的作用
产物特性 等电点 相对分子量 疏水性 生物特异性 溶解性 稳定性
作
用
决定离子交换种类及条件
选择不同孔径的介质
与疏水、反相介质结合的程度
决定亲和配基
常用固定相为硅胶烷基键合相。
流动相为低离子强度的酸性水溶 液，加入能与水互溶的乙腈、甲 醇、异丙醇等有机溶剂。
由于固定相骨架疏水性强，吸附 的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱 下来。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
疏水色谱的原理与反相色谱的原 理相似，主要是利用蛋白质分子表面 上的疏水区域和介质中的疏水基团之 间的相互作用，无机盐的存在能使相 互作用力增强。
⑶病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。
四、选择分离纯化方法 的依据
⒈根据产物表达形式来选择
分泌型表达产物的发酵液体积很 大但浓度较低纯化前必须浓缩可 用沉淀和超滤法。
产物在周质表达是介于细胞内可溶性 表达和分泌表达的一种形式,它可以 避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白 类杂质,在一定程度上有利于分离纯 化.为了获得周质蛋白
⑵反相色谱 和 （reversed phase chromatography，RPC） 疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）
反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质 疏水性的差异来分离纯化的。
反相色谱是利用溶质分子中非 极性基团与非极性固定相之间相互作 用力的大小以及溶质分子中极性基团 与流动相中极性分子之间在相反方向 作用力的大小差异进行分离的。
主要应用两个方面：
①脱盐和更换缓冲液
②蛋白质分子的分级分离。
在产品的形成阶段前用于除去产物的 多聚体及降解产物。
⒊非蛋白质杂质的去除
DNA、热原质和病毒的纯化方法： ⑴ DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0
以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性， 可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。 亲和层析和疏水层析也有效。 ⑵热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂 多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用 超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去， 脂多糖是疏水性可用疏水层析法。 ⑶病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。
活性。 ②选择性好，能从复杂的混合物
中有效的将目的产物分离，达 到较高的纯化倍数。
③收率要高。 ④两个技数间能直接衔接，
不需要对物料加以处理。 ⑤纯化过程要快，满足高
生产率的要求。
⒈细胞破碎与固液分离
⑴细胞收集： 离心法、膜分离法。 ⑵细胞破碎：机械破碎法、非机械 破碎法。 ⑶固液分离
①配基固定化 ②吸附目的物 ③样品解吸
⑷凝胶过滤
凝胶过滤是以具有大小一定的多孔 性凝胶作为分离介质，小分子能进 入孔内，在柱中缓慢移动，而大分 子不能进入孔内，快速移动，利用 这种移动差别可使大分子与小分子 分开。
根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子 的动力学体积的大小差异，可以利用 凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。
①菌种的类型及其代谢特性。 ②原材料培养基的来源及其质量。 ③生产工艺及条件。
⒉物料中杂质的种类和性质。 ⒊目的产物特性。 ⒋产品质量的要求
二 、分离纯化的基本过程
发酵液
细胞分离 胞内产物
胞外产物
细胞破碎
固液分离
浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品
包含体 细胞碎片分离
变性
复性
三、分离纯化的技术
与反相色谱相比，疏水色谱回收 率较高，蛋白质变性可能性小。
⑶亲和层析（affinity chromatography，AC）
亲和层析是利用固定化配基与 目的蛋白质之间特异的生物亲 和力进行吸附，如抗体与抗原、 受体与激素、酶与底物之间的 作用。
配基：在亲和层析中起可逆性结 合的特异性物质。 载体：与配基结合的支撑物。 亲和层析大体可分三步：
固定相介质表面的疏水性比反相 色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚 合物键合相或大孔硅胶键合相。
流动相为pH6～8盐水溶液。
在高盐浓度时，蛋白质分子中疏 水性部分与介子的疏水基团产生疏水 性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白 质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐 步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗 脱时间越长。
⒉目的产物的分离纯化
目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和 生物学特性来决定。
产物特性
作
用
等电点 相对分子量 疏水性 生物特异性 溶解性 稳定性
决定离子交换种类及条件 选择不同孔径的介质
与疏水、反相介质结合的程度 决定亲和配基
决定分离体系及蛋白浓度 决定工艺采用温度及流程时间
基因工程药物的分 离纯化(ppt)
②含有大量细胞及代谢产物；
③表达产物稳定性差，易失活变 性；
④表达产物的种类繁多、结构不 一、活性各异；
⑤对其质量要求纯度高、无菌、 无热原。
一、建立分离纯化工艺的根据
⒈含目的产物的起始料的特点 基因工程菌的发酵产物其上游过程的 各种因素对分离、纯化工艺有影响。 包括：
⒊非蛋白质杂质的去除
DNA、热原质和病毒的纯化方法： ⑴ DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离 子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离 子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸 性，可选择条件使其吸附在阳离子交 换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏 水层析也有效。
⑵热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生 的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。 分子量小的多肽或蛋白质中的热原可 用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可 用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏 水性可用疏水层析法。
决定分离体系及蛋白浓度
决定工艺采用温度及流程时间
分离纯化的方法依赖色谱分离方法
⑴离子交换层析（ ion exchange chromatography IEC）
离子交换层析的基本原理是通过带电的 溶质分子与离子交换剂中可交换的离子 进行交换，从而达到分离的目的。
它具有分辨率高容量大操作容易，该法 已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要 方法。
⒉目的产物的分离纯化
目的产物含有大量杂质必须进 行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根 据其分子的理化性质和生物学 特性来决定。
产物的特性在分离纯化中的作用
产物特性 等电点 相对分子量 疏水性 生物特异性 溶解性 稳定性
作
用
决定离子交换种类及条件
选择不同孔径的介质
与疏水、反相介质结合的程度
决定亲和配基
常用固定相为硅胶烷基键合相。
流动相为低离子强度的酸性水溶 液，加入能与水互溶的乙腈、甲 醇、异丙醇等有机溶剂。
由于固定相骨架疏水性强，吸附 的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱 下来。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
疏水色谱的原理与反相色谱的原 理相似，主要是利用蛋白质分子表面 上的疏水区域和介质中的疏水基团之 间的相互作用，无机盐的存在能使相 互作用力增强。
⑶病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。
四、选择分离纯化方法 的依据
⒈根据产物表达形式来选择
分泌型表达产物的发酵液体积很 大但浓度较低纯化前必须浓缩可 用沉淀和超滤法。
产物在周质表达是介于细胞内可溶性 表达和分泌表达的一种形式,它可以 避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白 类杂质,在一定程度上有利于分离纯 化.为了获得周质蛋白
⑵反相色谱 和 （reversed phase chromatography，RPC） 疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）
反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质 疏水性的差异来分离纯化的。
反相色谱是利用溶质分子中非 极性基团与非极性固定相之间相互作 用力的大小以及溶质分子中极性基团 与流动相中极性分子之间在相反方向 作用力的大小差异进行分离的。
主要应用两个方面：
①脱盐和更换缓冲液
②蛋白质分子的分级分离。
在产品的形成阶段前用于除去产物的 多聚体及降解产物。
⒊非蛋白质杂质的去除
DNA、热原质和病毒的纯化方法： ⑴ DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0
以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性， 可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。 亲和层析和疏水层析也有效。 ⑵热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂 多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用 超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去， 脂多糖是疏水性可用疏水层析法。 ⑶病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。