HBV-DNAPCR检测规程
乙肝病毒核酸检测(金豪)作业指导书
HBV-DNA检测（PCR）作业指导书1. 目的：规范本中心对乙型肝炎病毒DNA定量检测的方法细则。
2. 范围：乙型肝炎病毒DNA定量检测。
3. 职责：3.1 检测人员：负责按照本检测细则对被检样品进行检测。
3.2 复核人员：负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核。
3.3 科室负责人：负责对科室综合管理和检测报告的签发。
4. 方法：实时荧光PCR法5. 仪器：博日FQD-48(M4)荧光定量PCR仪6. 试剂与材料6.1 试剂来源：北京华大吉比爱生物技术有限公司，试剂有效期为12个月。
6.2 材料：PCR所使用的吸管、试管、加样枪头以及微量离心管都应一次性使用。
特别是微量离心管和试管都应为无菌。
6.3 可调移液器（0.5～10ul、10～200ul、100~1000ul）应该用重量法效正后再使用。
7．操作步骤7.1 样本要求：7.1.1、血清：1600rpm20分钟分离全血取血清；7.1.2、血浆：EDTA抗凝剂，1600rpm20分钟，分离血浆。
7.2样本处理7.2.1、待测血清/血浆及对照个100ul，分别加至1.5ml离心管中；7.2.2、再加100ul浓缩液，振荡混匀，13000rmp10分钟，弃上清液；7.2.3、然后加入10ul内参对照品，50ul核酸提取液；7.2.4、100℃干浴或沸水浴10分钟，13000rmp离心10分钟，吸取上清液备用。
7.3扩增试剂准备7.3.1、核酸反应液振荡混匀，2000rpm10秒；7.3.2每管加入反应液25ul；(样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管弱阳性对照+4管工作标准品)7.3.3加样：加入处理过的样品个5ul，盖紧管盖，2000rpm10秒。
7.4 PCR 扩增反应程序如下：仪器检测通道选择：HBV发光荧光基团为FAM,淬灭荧光基团为TAMAR荧光素,参考荧光基团为Rox荧光基团。
8. 结果判断：分析软件自动结合,4个定量校准品制定标准曲线，并计算各样品的结果。
HBVDNA核酸扩增及产物分析标准操作程序
HBV-DNA核酸扩增及产物分析标准操作程序一、目的：规范实验室操作，正确使用ABI-5700荧光定量PCR仪进行HBV-DNA扩增分析，以保证实验结果的准确性。
二、适用范围：乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒、ABI-5700荧光定量PCR仪。
三、职责：由临床基因扩增检验实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：1、PCR扩增1）打开稳压器电源，再打开计算机电源。
2）打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
3）将循环条件设定为4）检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
5）将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中设定好反应孔位置。
6）关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。
7）扩增结束后先保存结果，再关闭扩增仪电源，取出PCR 反应管，密封放入垃圾桶。
2、产物分析1）基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。
2）阈值的设定：原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
3）对照标准：阳性对照参控品的Ct值应小于28，标准曲线的拟和度应大于等于0.990，否则视为定量结果无效；阴性、空白对照的扩增曲线应平坦，Ct值等于30或0，否则结果无效。
4）结果判断：检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。
5）填写检验记录，关闭计算机。
此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题，则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的人员讨论，以决定是否需要变更本程序。
乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书
乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书-模板1.目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。
2.范围适用于乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）定量检测（PCR-荧光探针法）。
3.职责3.1操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。
3.2专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。
3.3实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。
4.原理采用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样品核酸纯化之后，通过荧光定量PCR对HBV DNA进行扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（CT）实现对未知样品的检测。
另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。
5.样品要求5.1适用样品类型：血清或血浆。
5.2样品采集：5.2.1血清用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2:^，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
5.2.2血浆用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA （乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂的真空采血管，立即轻轻颠倒混匀5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后分离血浆于无菌的1.5ml 灭菌离心管。
5.3样品保存和运送使用专用样品0c冰壶送检，温度约维持在4℃左右。
分离后的血清或血浆可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。
5.4拒收样品：拒绝重度溶血样品、肝素抗凝的血浆。
6.仪器和试剂6.1仪器AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。
乙肝病毒核酸检测实验操作流程
原理图
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个荧光信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
操作流程
一、标本采集
一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注 入无菌的干燥玻璃管 用一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注 入含EDTA或枸橼酸钠抗凝 剂的试管
血 清 的 采 集
93℃ 30秒→55℃ 45秒→30个循环
结果分析
1.
2.结果读取
3.结果报告
结果的报告必须简单清楚 定量测定则必须报告量的多少 1、结果高于测定方法线性范围上限，可报告>多少； 也可对样本稀释后再测，结果乘以稀释倍数 2、结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可， 不能报告“0”或阴性
乙肝病毒核酸检测 实验操作流程
广西临床检验中心 唐 娟
主要内容
HBV-DNA的检测原理
标本采集
HBV-DNA操作流程
DNA 提取 PCR 扩增
HBV-DNA检测结果分析
临床意义
检测原理
HBV ： 用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一
条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反
应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧 核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩 增法定量检测乙型肝炎病毒DNA
室温（22～25ºC）放置 30～60 分钟血标本使用 水平离心机，4000转/分 离心5分钟
血 浆 的 采 集
立即轻轻颠倒玻璃管混合 5～10次，使抗凝剂与静 脉血充分混匀
吸取上层血清，转移至 1.5ml灭菌离心管
5～10分钟后即可分离出 血浆，转移至1.5ml灭菌 离心管
HBV-DNAPCR检测规程
1 目的规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检验工作，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测，保证检验结果的质量。
2 范围本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）3 试剂中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒4 仪器Roche LightCycler荧光PCR检测仪高速台式冷冻离心机微量加样器（覆盖1-1000μl）5 样品处理样品处理按《PCR实验室标本处理规程》进行收集和处理，具体操作见本规程附录1和附录2。
6 测定6.1 PCR扩增6.1.1 打开稳压器电源，再打开计算机电源。
6.1.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
6.1.3 将循环条件设定为：6.1.4 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
6.1.5 将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。
6.1.6 关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。
6.1.7 扩增结束后关闭扩增仪电源，取出PCR反应管，密封放入垃圾桶。
6.2 产物分析6.2.1 条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光数值为F1/F2。
点击Quantification读取结果。
6.2.2 基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。
6.2.3 噪声容限（阈值）：调节在阴性质控品以上，要求在Step3：Analysis下相关性r值＜-0.97，接近-1.0。
6.2.4 对照标准：保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值（默认为40）。
6.2.5 最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M），关闭计算机。
7结果判断7.1 如果Ct值＝40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＜1×103。
7.2 如果Ct值＜40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＝ M7.3 检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。
PCR检测HBV DNA - 滁州中心血站
一、检测对象
本院住院、门诊及外院送来的HBV-M检 测阳性血清标本
二、HBV PCR杂交酶联定量检测
• 试剂： 由上海浩源生物科技有限公司提供，按 说明书进行标本预处理、核酸扩增、杂交 检测和实验结果判断等步骤进行，每步操 作都必须严格按说明书操作，否则都可导 致结果无法判断。
二、HBV PCR杂交酶联定量检测
PCR检测HBV DNA
滁州市第二人民医院 谢瑞玉
摘 要
通过乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增 （PCR）酶联免疫吸附试验（ELISA）定量 检测HBV-M阳性标本中的HBV DNA数量， 可以反映HBV真实感染和复制状态，结合 HBV DNA含量测定判断HBV病毒复制状态， 对乙型肝炎的辅助诊断、治疗及判断预后具 有重要的指导意义。
四、讨Байду номын сангаас
论
谢 谢！
• 仪器和实验条件 伯乐公司生产的基因扩增仪和芬兰生产的 酶标仪，实验室必须严格区分三个区域， 即前PCR室，样品制备室和后PCR室。
三、结 果
我们分别对“大三阳”、“小三阳”及 “一五阳”组进行了统计，结果显示“大 三阳”组阳性率为100％且拷贝数范围在 105~109/ml，“小三阳”组阳性率为52％， “一五阳”组阳性率为66％
[医学]乙肝病毒核酸检测实验操作流程
![[医学]乙肝病毒核酸检测实验操作流程](https://img.taocdn.com/s3/m/88d373c2172ded630b1cb63b.png)
主要内容
HBV-DNA的检测原理
HBV-DNA操作流程
标本采集 DNA 提取
PCR 扩增
HBV-DNA检测结果分析
临床意义
检测原理
HBV ：
用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一 条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反 应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧 核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩 增法定量检测乙型肝炎病毒DNA
结果分析
1.
2.结果读取
3.结果报告
结果的报告必须简单清楚
定量测定则必须报告量的多少 1、结果高于测定方法线性范围上限，可报告>多少； 也可对样本稀释后再测，结果乘以稀释倍数 2、结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可， 不能报告“0”或阴性
临床意义
1、诊断早期乙型肝炎，提高HBV检测阳性率。 2、判断HBV的传染性及病毒复制情况，综合血清学指
三.PCR 扩增步骤
取上清液2ul点样 ↓↓ 8000rpm离心数秒 ↓↓ 按顺序放进扩增仪微孔中
↓↓
编辑软件，设置循环条件
↓↓
保存文件，运行
注意：吸取上清液中上层2ul进行加样， 不要吸取到沉淀。
循环条件
循环次数、温度 93℃ 2分钟 93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环 93℃ 30秒→55℃ 45秒→30个循环
注意事项
3.浓缩离心后若出现有“絮状悬浮物”，去上清时应一 并把“絮状悬浮物”吸除，不影响实验结果。如不 吸取絮状悬浮物会导致实验结果偏低。
4.加入20ul的DNA提取液（DNA提取液用前充分融解 混匀),并用震荡器剧烈震荡混匀20秒后,瞬时离心。
乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测标准操作规程
乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测标准操作规程（PCR-荧光探针法）1.目的: 规范乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围: HBV DNA 荧光定量检测。
3.职责:3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献：4.1 中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书。
4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书。
5. 内容：5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。
5.2 实验原理：用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而定量检测乙型肝炎病毒DNA。
5.3 性能参数：5.3.1 精密度：检测下限为5.0x102IU/ml。
5.3.2 线性范围：1.0x103～1.0x108IU/ml。
5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集5.4.1 标本类型：血清。
5.4.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
5.4.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月，应避免反复冻融。
5.4.4 运送条件：标本运送采用0℃冰壶。
5.4.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。
5.5 设备和试剂：5.5.1 设备： DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。
乙肝病毒核酸扩增荧光检测操作规程
乙肝病毒核酸扩增荧光检测操作规程1. 目的：规范乙肝病毒核酸扩增荧光检测，保证HBV -DNA检测结果准确、可靠。
2. 范围：适用于HBV -DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为血清。
3. 职责：操作人负责按照本操作规程进行乙肝病毒核酸扩增检测。
4. 程序：4.1检验方法：4.1.1 DNA 提取（样本制备区）将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV 临界阳性质控品进行同步处理。
4.1.1.1 取200μl 样品，加入450μlDNA 提取液I 和4μl 的内标溶液，用振荡器剧烈振荡混匀15 秒，瞬时离心数秒。
100℃恒温处理10±1 分钟；4.1.1.2 12000g 离心5 分钟，备用。
4.1.2 PCR 试剂准备（试剂准备区）直接使用HBV-PCR 反应管。
4.1.3 加样（样本制备区）往上述HBV 反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本核酸、HBV 阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV 临界阳性质控品和阳性定量参考品的上清各20μl。
盖紧管盖，8,000rpm 离心数秒后转移至扩增检测区。
4.1.4 PCR 扩增（扩增和产物分析区）4.1.4.1打开“Setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控（NTC）、阳性质控以及未知样本（Unknow）、阳性定量参考品（Standard），并在“Sample Name”一栏中设置样本名称；探针检测模式设置为：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2：VIC ，Quencher Dye2：none；Passive Reference：Rox。
4.1.4.2 打开instrument窗口，设置循环条件如下：93℃2 分钟，93℃45 秒→55℃60 秒→10 个循环，93℃30 秒→55℃45 秒→30 个循环。
保存文件，运行。
4.2 结果分析反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline 的Start 值、End 值以及Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可以在3～15、End 值可设在5～20，在Log 图谱窗口设置Threshold 的Value 值，使基线位于扩增曲线指数期,调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis 自动获得分析结果，在Report 界面察看结果，记录未知样本数值（C）。
医院PCR乙型肝炎HBV核酸扩增PCR荧光检测程序
医院PCR乙型肝炎(HBV)核酸扩增（PCR）荧光检测程序（SOP-HBV）【试剂盒组成】DNA浓缩液（1.4ml/管） 1 管裂解缓冲液560ul 1管参比品(3×105~ 3×108copies/ml)10ul 各1管HBV-PCR反应液704ul 1管阳性标准品 20ul 1管临界阳性标准品 20ul 1管阴性标准品 20ul 1管酶溶液32ul 1管【操作步骤】1. 标本采集、保存和运送用无菌注射器抽取受检者静脉血1毫升，注入灭菌1.5ml Eppendoff管，于室温静置2小时,8000rpm离心5分钟，吸取200µl血清(注意勿带入红细胞)转入另一灭菌 1.5ml Eppendoff管，即为血清标本。
标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。
标本运送应保持在4℃以下。
2.试剂准备：按标本的数量和所需的对照数量配置反应液。
配置：按每个反应取HBV-PCR反应液22ul，酶1ul计算加于一总的无菌离心管中，震荡混匀。
分装：用微量加样器在每个PCR反应管内加入23ul上述混匀的反应液，转移到样品处理区，4℃保存。
3. 标本及对照标准品的处理取50ulDNA浓缩液加入到确定数量的0.5ml离心管中(浓缩液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取), 再分别加入血清标本50µl及20 ul阴性、临界、阳性对照品，混匀，室温静置2分钟，8000rpm离心5分钟，弃上清。
加入10ul裂解缓冲液，剧烈振荡后短暂离心，沸水浴10分钟(误差不超过1分钟), 13,000 rpm离心10分钟, 取上清液2µl做PCR反应。
4. PCR反应在Roche LightCycler热循环仪上设定如下程序；“SINGLE”。
仪器检测通道选择F1通道；其他为默认值。
5.结果判定a、基线设定用荧光显示模式F1/F2读取结果。
基线设定原则以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且CT值不出现任何数值为准（根据仪器实际情况，一般在0.001-0.1范围内调整）。
乙肝dna检测规程模板
乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测标准操作程序1.目的：明确乙肝病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测。
2.适用范围：2.1适用于进行乙肝病毒核酸定量检测的检验人员。
2.2适合仪器：LightCycler型核酸扩增荧光检测仪2.3方法原理：采用PCR方法结合荧光探针的扩增技术2.4样品要求：血清3.职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。
4.试剂来源：中山大学达安基因股份有限公司HBV DNA荧光PCR检测试剂盒。
5.质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒6.标准操作：6.1 试剂准备（在试剂准备区操作）6.1.1将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（Taq酶为液态试剂，临用前取出，用后立即放回冰格），完全融解后混匀。
6.1.2根据当次实验标本量，取出相应试剂总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为n (n=标本数+1管阴性对照+1管阳性对照+1管临界阳性对照+4管阳性参控品)（定性检测无需做阳性参控品），取PCR反应管，转移至样本制备区。
6.2 样本制备及加样（在标本制备区操作）6.2.1 取血清标本40ul，或阴阳性对照标准品各10ul（强阳性标准品使用前加入稀释液90ul 混匀），加等量DNA提取液打匀，（提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。
如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后填满吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截）。
沸水浴10分钟，转至4℃静置8-12小时以保证病毒颗粒充分裂解。
6.2.2 10000rpm离心5分钟，取上清液2ul直接加入到PCR反应管中，6000rpm离心数秒。
6.2.3 将各反应管带入PCR仪。
6.3 PCR扩增（在扩增区操作）按仪器使用说明或标准操作程序操作。
扩增条件如下：93℃→2分钟预变性93℃30秒→55℃60秒（40个循环）6.4 结果判断：6.4.1 2个阴性对照的Ct值应无数值，1个强阳性对照的Ct值应小于等于30，1个临界阳性对照的Ct值应大于阳性对照的Ct值，并小于等于38，否则实验视为无效。
HBV-DNA试剂准备
HBV-DNA试剂准备标准操作规程
1.目的
使PCR 人员熟悉HBV - DNA 定量核酸检测实验的试剂准备操作。
2.范围
HBV - DNA 定量检测实验的PCR 反应液配制。
3.操作人员
PCR室在岗工作人员。
4. 操作步骤
4.1 HBV - DNA 试剂准备：
4.1.1 试剂复融：从冰箱中取出HBV - DNA 定量试剂盒，取出PCR 反应液组分：HBV - PCR 反应液、酶混合物、DNA提取液、DNA浓缩液、校准品及阴、阳性质控品，置于室温复融，复融后把试剂震荡混匀并瞬时离心5 秒。
酶混合液不需复融，震荡混匀后瞬时离心5 秒，立即放回4 ℃冰箱。
4.1.2 排PCR 管：在PCR 管盒上排列n 个PCR 管（n ＝标本数＋阴性质控品＋阳性质控品+5个定量参比品)，并盖上PCR 盒盖。
4.1.3 配液：取出HBV-PCR反应液，将n×29μL HBV-PCR反应液， n×1μL Taq DNA 聚合酶加入一个1.5ml离心管中并震荡混匀，瞬时离心后，向每一个PCR
反应管中分装30μL，盖上管盖后转移到样本处理区的传递窗内。
4.1.4 配液结束后立即把HBV - PCR 反应液、酶混合物置于一20 ℃冰箱。
将质控品、校准品、DNA提取液和DNA浓缩液转移到样本处理区的传递窗内。
乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规程
乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规程（PCR和DNA反向点杂交）1. 目的：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规章，保证检测结果的准确性。
2. 应用范围：对HBV的基因型和耐药突变基因检测。
3. 职责3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献4.1 亚能生物技术（深圳）有限公司乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒剂说明书。
4.2 中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册。
5. 内容5.1 检测方法：PCR和DNA反向点杂交5.2 实验原理：设计特异的PCR引物扩增获得HBV目的基因片段，该片段包含了所要检测的基因型和耐药基因突变位点。
通过PCR产物与设计的探针进行特异性杂交，根据膜条特定位置显色（蓝色）与否来判断HBV的基因型和耐药突变类型。
5.3 性能参数3 copies /ml 。
5.3.1 灵敏度：检测下限为 1.0 ×105.3.2 稳定性：产品有效期为6个月，在有效期内产品性能稳定5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.4.1 标本类型：血清或血浆。
5.4.2 标本保存：制备好的血清或血浆室温放置不超过2小时，2～8℃保存不超过48h，-18 ℃以下保存不超过半年，应避免反复冻融。
5.4.3 运送条件：冰壶或泡沫箱加冰袋密封，在途时不宜超过48h。
5.5 设备和试剂5.5.1 设备：DA 7600 荧光定量PCR仪、低速离心机、生物安全柜、高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/ 干式恒温器、冰箱（4℃、-20 ℃）、移动/ 固定紫外灯、三孔电热恒温水浴箱、振荡恒温水浴箱。
5.5.2 试剂：5.5.2.1 试剂品牌亚能生物技术（深圳）有限公司乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒。
5.5.2.2 试剂批准文号：国食药监械（准）字2011第3401179号。
乙肝病毒(HBV)PCR检测
试剂盒组成
DNA提取液：裂解病毒蛋白外壳，使病毒DNA游离
PCR反应管：含有扩增HBV特异DNA片段的引物、 dNTPs、Taq酶、PCR缓冲液、Mg2＋等，只需加入 模板即可进行扩增反应。
阳性模板：纯化的HBV －DNA，无病毒外壳，无 感染性，直接加入PCR反应管扩增后用作阳性对照。
加好样的PCR反应管放入PCR扩增仪的反应板上， 扩增程序：
（1）93ºC 3分钟 预变性 （2）三步循环：
93ºC 45秒（变性） 55ºC 45秒（复性） 共35个循环 72ºC 1分钟（延伸）
（3）72ºC 保温5分钟 （防止延伸不完整）
3. 电泳检测： 直接取PCR反应产物加入2％琼脂糖凝胶上电泳 20分钟，EB染色后在紫外灯下观察，若在314bp 处（与阳性对照处于同一位置）出现条带，则怀 疑为HBV阳性。
1. 标本处理： 每六人一组，取血清40ul加入0.5离心管，再加入 40ulDNA提取液，沸水浴10分钟，10000rpm离心 5分钟，上清用于扩增反应。
2. PCR反应： 每两人一组 其中一人取一PCR反应管，取1步骤离心后的上清2ul， 加入PCR反应管底层溶液中，6000rpm离心数秒。 另一人取一PCR反应管，取阳性模板2ul加入加入 PCR反应管底层溶液中，6000rpm离心数秒。
扩增人ß – actin特异片段
每两人一组ห้องสมุดไป่ตู้在一0.5离心管中加入以下组分：
模板
4ul
引物
2ul
dNTPs
1ul
Taq酶
0.5ul
10×PCR缓冲液 2.5ul
ddH2O
15ul
（反应体系为25ul）
（所发0.5ml离心管已加好除模板以外的所有组分，请 加入4ul昨日所提取的基因组DNA溶液即可进行扩增）
PCR实验室操作流程
乙型肝炎病毒（HBVDNAPCRABI7300)检侧标准操作程序一、INFORMATIONFORTEST检测信息项目名称乙型肝炎病毒核酸方法聚合酶链反应方法依据卫生部《全国临床检验操作规程》第三版（2006)第七篇第六章第一节二、ANALYTICALPRINCTPLE检测原理聚台酶链式反应（PCR〕可对特定核苷酸片段进行指数级的扩增，而实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，荧光物质有两种：荧光探针和荧光染料.我们目前是使用TaqMan荧光探针的检测原理:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’一3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,荧光信号强度也等比例增加（图一）。
这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
三、操作步骤（一）试剂配制1、进入试剂准备区，开启冰箱冷冻层取出HBV—DNA检测试剂盒。
查看外包装盒（包括生产批号、有效期)，无误后拆开试剂盒，取出核酸提取液、反应液及Taq酶（核对核酸提取液、HBVPCR反应液及Taq 酶管上批号与试剂外包装盒批号是否一致)(图1）,不一致则不可使用，需更换新的试剂。
室温平衡20min，完全融化后2000rpm离心备用。
2、核酸提取液的分装(1）取0.5ml离心管架置于超净工作台内（开机前用紫外线消毒30分钟）,用右手拿起镊子逐个将离心管放入离心管架（注意应夹住离心管外壁，不能碰到管内壁)，摆放顺序为横列从左往右摆，竖列为从上往下隔行排，离心管个数为n(n=样本数+对照品+质控品).完成后将镊子放回原位（图2）.(2)用移液器准确吸取核酸提取液50ul分装至0。
乙肝脱氧核糖核酸标准
乙肝脱氧核糖核酸标准
乙肝脱氧核糖核酸（HBV DNA）是乙型肝炎病毒的核酸，其检测是乙肝诊断和治疗监测的主要手段之一。
HBV DNA检测可通过各大医院的检验科室进行，其标准一般如下：
1. 采用定量PCR检测技术，测量阳性标准物质，得出样本中的病毒载量。
2. 一般检测限为10至100 IU/mL，也有的检测限为20至200 IU/mL。
3. 对于表面抗原（HBsAg）阳性的患者，建议每3至6个月进行一次HBV DNA检测。
4. 对于慢性乙肝患者，建议随诊期间每3至6个月进行一次HBV DNA检测。
5. 对于接受治疗的乙肝患者，建议在治疗前、治疗12周内（进行治疗1至2次）、治疗24周内（进行治疗3至4次）和治疗结束后进行HBV DNA检测。
6. 治疗结束后，应每3至6个月进行一次HBV DNA检测，以确
保病毒的持续性逆转录酶抑制。
总之，HBV DNA检测是判断乙肝病情和治疗效果的主要指标之一，其标准应根据临床情况和医生建议进行检测。
乙肝dna检测的操作规程
乙肝dna检测的操作规程
乙肝DNA检测的操作规程主要包括以下步骤：
1. 采集血液样本：通过抽取受检者的静脉血液来获取样本。
建议在空腹状态下进行抽血，以提高检测的准确性。
2. 提取DNA片段：利用特定的设备和技术，如EV卸电泳、PCR等，从血液样本中提取出乙肝病毒的DNA片段。
这一步骤是检测的关键环节，需要使用精密的仪器和专业的操作。
3. 比对和分析：将提取出的DNA片段与标准样本进行比对，通过特定的检测方法，如荧光定量PCR、基因测序等，分析DNA片段的特性和序列，以确定乙肝病毒的种类和复制程度。
4. 得出检测结果：根据比对和分析的结果，得出乙肝病毒DNA的定量或定性检测结果。
通常情况下，检测结果会以数字或阴阳性方式呈现。
5. 报告与解读：将检测结果整理成书面报告，并提供给医生或受检者。
医生根据检测结果判断受检者是否感染乙肝病毒，以及病毒的复制程度和传染性。
受检者应遵循医生的建议进行相应的治疗或监测。
需要注意的是，乙肝DNA检测是一项高技术含量的实验，需要由经过专业培训的医务人员进行操作。
同时，乙肝病毒的检测结果解读需要结合其他相关检查结果和临床表现进行综合分析，因此最好在医生的指导下进行。
HBV荧光定量PCR实验流程图
3核酸提取：提取样本数量；按2012-CX-15对样本进行核酸提取；提取过程有无异常
4离心机：离心是否正常；按2012-CX-03次维护离心机；按2012-CX-04次维护干浴锅。
离心或干浴中异常情况及处理
5实验后：填写记录；消毒试验台面和器具；紫外消毒1小时（固定、移动、传递窗紫外灯）；按2012-GL-13文件处理废弃物；按2012-CX-05进行加样枪次维护；生物安全柜使用正常并按2012-CX-07进行次维护。
3试剂配制记录：按基因扩增实验室2012-CX-11配制10%次氯酸钠消毒液ml
4实验后：填写记录；消毒试验台面和器具；紫外消毒1小时（固定、移动、传递窗紫外灯）；按2012-GL-13文件处理废弃物；按2012-CX-05进行加样枪次维护；操作过程是否正常。
样本处理区（二区）
1实验前：打开通风设备；记录室内温湿度；是否在控；按2012-CX-07开启生物安全柜
核酸扩增及产物分析区（三区）
1实验前：打开通风设备；记录室内温湿度；是否在控
2室内质控结果：阴性是/否在控；阳性是/否在控；标准曲线：斜率、截距、r值
失控原因及处理：
3扩增仪：开机后自检正常；按2012-CX-02操作及设定扩增参数；将样本标识填写于扩增仪相应位置；
仪器使用正常；按2012-CX-02维护扩增仪。
无锡联合利康医学检验所荧光定量PCR实验流程图
检测项目：HBV-DNA定量检测扩增仪保存文件名：实验日期：2015-
试剂准备区（一区）
1实验前：打开通风设备；记录室内温湿度；是否在控；按2012-CX-06开启超净工作台
2试剂盒及用量：试剂厂家：杭州艾康生物科技有限公司批号有效期限
hbv_dna检测的基本流程
hbv_dna检测的基本流程1. 样本采集
- 静脉血液采样
- 正确标识并保存样本
2. 样本预处理
- 离心分离血浆
- 提取血浆中的核酸
3. 核酸扩增
- 使用聚合酶链式反应(PCR)技术
- 扩增hbv_dna靶序列
4. 扩增产物检测
- 实时荧光定量PCR检测
- 凝胶电泳检测
5. 结果分析
- 根据ct值或带型分析结果
- 判断hbv_dna是否存在及含量水平
6. 报告出具
- 对检测结果进行解读
- 出具规范的检测报告
整个流程需要在无菌条件下进行操作,严格控制质量,确保检测结果的准确性和可靠性。
hbv_dna检测结果是判断肝炎病毒感染状态及疗效评估的重要依据。
HBV-DNA检测标准操作程序
2.3 吸取已编号的待测血清或血浆样本、试剂盒中的阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照及定量标准品（1→）各200μl,分别加入到1.5ml离心管中，在离心管上编好号，振荡混匀。
2.4 56℃温浴15-2Omin,期间颠倒混匀数次。
2.5 加入200Ul无水乙醇，充分混匀，将全部液体转入装有2ml收集管的硅胶柱中，IoOoorPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
2.6 在硅胶柱中加入500Ul溶液Wl（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），1000OrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
2.7 在硅胶柱中加入500Ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），1000OrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
2.8 在硅胶柱中加入500Ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇）,IoOOOrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液。
2.9 将硅胶柱放入收集管中，1200OrPm空管离心3min,丢弃收集管。
2.10 将硅胶柱放入新的1.5ml离心管中，开盖静置L2min,往硅胶柱中心加入80Ul 的TE洗脱液，静置2-5min,1200OrPm离心2min,丢弃硅胶柱，盖好离心管盖，做好相对应的编号。
（注意：TE洗脱液的体积应不少于50ul,体积过小影响回收率。
为增加基因组DNA的回收率，可将TE洗脱液稍微加热。
获得的DNA应保存在-20°C,以防DNA降解。
）3 .加样（在样本处理区进行）3.1 向设定的n个PCR反应管中分别加入步骤1处理好的样品DNA、强阳性对照、临界阳性对照、阴性对照以及定量标准品（4个）各20μ∣,盖紧管盖，稍做离心。
3.2 将PCR反应管转移到检测区，放入相应的荧光PCR检测仪内，记录样品摆放顺序。
4 .PCR扩增（检测区）4.1 循环条件设置使用ABI7500和Line-Gene9660荧光PCR检测仪时循环程序设置如下：1150℃2min无2195℃9min无34595℃15sec无58℃50sec单次采集荧光4138℃10sec无■阴性对照无定量值出现，且内标Ct值W40；■强阳性对照检测值范围(3.16X105-3.16X106),临界阳性对照检测值范围(3.16×101-3.16×102),且内标Ct值W40。
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1 目的
规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检验工作，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测，保证检验结果的质量。
2 范围
本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）
3 试剂
中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒
4 仪器
Roche LightCycler荧光PCR检测仪
高速台式冷冻离心机
微量加样器（覆盖1-1000μl）
5 样品处理
样品处理按《PCR实验室标本处理规程》进行收集和处理，具体操作见本规程附录1和附录2。
6 测定
6.1 PCR扩增
6.1.1 打开稳压器电源，再打开计算机电源。
6.1.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
6.1.3 将循环条件设定为：
6.1.4 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
6.1.5 将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。
6.1.6 关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。
6.1.7 扩增结束后关闭扩增仪电源，取出PCR反应管，密封放入垃圾桶。
6.2 产物分析
6.2.1 条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光数值为F1/F2。
点击Quantification读取结果。
6.2.2 基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。
6.2.3 噪声容限（阈值）：调节在阴性质控品以上，要求在Step3：Analysis下相关性r值＜-0.97，接近-1.0。
6.2.4 对照标准：保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值（默认为40）。
6.2.5 最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M），关闭计算机。
7结果判断
7.1 如果Ct值＝40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＜1×103。
7.2 如果Ct值＜40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＝ M
7.3 检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。
8 注意事项
8.1 各标本沸水浴时间误差不超过1分钟。
8.2 加样时每加完一个要立即盖上封闭好离心管。
9 支持性文件
9.1 《乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒操作说明书》
8.2 《临床基因扩增检验实验室工作规范》
10 质量记录
附录1：HBV项目标本采集、运送流程图
附录2：HBV样本处理流程图
阳性标准品的稀释及处理：
充分混匀。