HBV-DNAPCR检测规程

1 目的

规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检验工作，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测，保证检验结果的质量。

2 范围

本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）

3 试剂

中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒

4 仪器

Roche LightCycler荧光PCR检测仪

高速台式冷冻离心机

微量加样器（覆盖1-1000μl）

5 样品处理

样品处理按《PCR实验室标本处理规程》进行收集和处理，具体操作见本规程附录1和附录2。

6 测定

6.1 PCR扩增

6.1.1 打开稳压器电源，再打开计算机电源。

6.1.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。

6.1.3 将循环条件设定为：

6.1.4 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。

6.1.5 将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。

6.1.6 关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。

6.1.7 扩增结束后关闭扩增仪电源，取出PCR反应管，密封放入垃圾桶。

6.2 产物分析

6.2.1 条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光数值为F1/F2。点击Quantification读取结果。

6.2.2 基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。

6.2.3 噪声容限（阈值）：调节在阴性质控品以上，要求在Step3：Analysis下相关性r值＜-0.97，接近-1.0。

6.2.4 对照标准：保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值（默认为40）。

6.2.5 最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M），关闭计算机。

7结果判断

7.1 如果Ct值＝40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＜1×103。

7.2 如果Ct值＜40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＝ M

7.3 检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。

8 注意事项

8.1 各标本沸水浴时间误差不超过1分钟。

8.2 加样时每加完一个要立即盖上封闭好离心管。

9 支持性文件

9.1 《乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒操作说明书》

8.2 《临床基因扩增检验实验室工作规范》

10 质量记录

附录1：HBV项目标本采集、运送流程图

附录2：HBV样本处理流程图

阳性标准品的稀释及处理：

充分混匀