2.分子生物学蛋白质研究

并在信号肽被切除后，在分子伴侣的作用下折叠成其天然 构象（如果是寡聚体蛋白，在还需要进行组装）。
信号肽决定去向：1). 通过高尔基体和运输小泡而被调 节性地（如胰岛 细胞中的胰岛素、胰岛 细胞中的胰高 血糖素、胰岛腺泡细胞中的各种蛋白酶原、乳腺细胞中的 酪蛋白和乳白蛋白等等）或非调节性地（如肝细胞中的白 蛋白和转铁蛋白、淋巴细胞中的免疫球蛋白、成纤维细胞 中的胶原蛋白和粘连蛋白等等）运送到细胞外面去；2). 通 过运输小泡被运送到溶酶体中（各种酸性水解酶）；3). 先 输送到高尔基体，然后再通过运输小泡送回到内质网腔中。
3.蛋白定位： 蛋白分子在细胞内的定位决定于其自身的结构 。
定位于细胞不同部位的蛋白分子携带有不同的结构 信号。
20世纪70年代，德国出生的美国科学家Blobel就 提出“信号假说”：每一种蛋白质在真核细胞器中 的定位是通过新生肽链中短暂存在的“信号”序列 协助完成的。1999年，Blobel“因发现蛋白质具有内 在的、支配它们在细胞内的转运和定位的信号”而 获得了诺贝尔生理学和医学奖。
肽链内部就有一段序列具有这三种功能：跨内质网膜、 停止转运和膜锚定。
（5）过氧化物酶体蛋白的定位： ①过氧化氢酶、脂肪酰辅酶A氧化酶 (fatty acyl CoA oxidase)、尿酸盐氧化酶(urate oxidase)等蛋白的C-末端都 存在一保守的SKL序列。 ②另一些过氧化物酶体蛋白，包括硫解酶（thiolase）,的 定位信号被发现是位于N-末端的一段序列。
二、蛋白质的结构与功能
1.蛋白质结构： （1）根据结构进行的蛋白质归类： ①纤维状蛋白(fibrous proteins)，如胶原蛋白、蛛丝蛋白、 蚕丝蛋白等，完成功能时相对比较被动，由较为单一的重 复性二级结构单位组合而成； ②球形蛋白(globular proteins)，如酶、运输蛋白、防御蛋 白等等，完成功能时相对比较主动（在发挥生物学功能的 时候进行分子识别），经常由结构和功能都具有一定独立 性的结构域(domains)组成，含有混合的二级结构成分（α 螺旋和β片层）和随机绕曲。
列被线粒体基质中的特异蛋白水解酶切除，然后蛋白分子 自发地或在分子伴侣蛋白帮助下折叠形成其天然结构。
（2）细胞核蛋白的定位： “核定位信号(nuclear localization signal, NLS)”。而且都
是通过体积巨大的细胞核孔复合体（大约是核糖体的30倍） 进入细胞核的。
步骤：1). 在细胞质中，核蛋白被合成、并折叠成特定 的三维空间结构，然后暴露在表面的核定位信号（NLS）与 存在于细胞质中的“输入因子α(importin α)”结合，同时， 输入因子α又与另一存在于细胞质中的输入因子β (importin β) 结合。2). 载运蛋白/输入因子α/输入因子β复合物通过输入因 子β与核孔复合体识别，并被转运进入细胞核中（需要消耗 ATP）。在细胞核中，一个叫做Ran的蛋白的GTP结合形式 (Ran-GTP)与进入细胞核中的运载复合物上的输入因子β特
③在哺乳动物细胞中，二级去稳定残基包括天冬氨酸 (Asp)、 谷氨酸(Glu)和半胱氨酸(Cys)，；三级去稳定残基是指天冬 酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)。
位于N-末端的Asp, Glu和Cys能被一种ArgtRNA-蛋白转移酶(R-transferase)识别，然后在 N-末端加上一个精氨酸残基（为一级去稳定残 基）。而三级不稳定残基先要被一种N末端酰胺 水解酶(N-terminal amidohydrolase)作用而变成 Asp和Glu，之后再被Arg-tRNA-蛋白转移酶作用 而加上一级不稳定残基精氨酸。
（3）分泌蛋白的定位： 信号序列：长度一般为16-30个残基；含有1或多个碱性
残基；随后接着是6-12个疏水性残基。 当合成的肽链长度为大约70个氨基酸残基时，最先被
翻译出来的N-末端序列作为“信号序列 (signal sequence)” 伸出了核糖体，并被存在于细胞液中的所谓“信号识别颗 粒 (signal recognition particle, SRP)”所特异结合，同时新生 肽链的合成也暂时停止。然后所形成的复合体再与内质网 膜上的所谓SRP受体特意识别和结合。之后，信号识别颗粒 及其受体将脱离核糖体，同时，新生肽链进入存在于内质 网膜上的转位子 （translocon）打开的通道中。这时，新生 肽链的合成重新启动，合成的新剩肽链假如内质网腔中，
步骤：1）.前体蛋白在细胞液中的自由核糖体上被合成， 并释放到细胞液中。2).细胞液中的分子伴侣蛋白，线粒体 输入刺激蛋白（mitochondrial import stimulating factor, MSF）或Hsp70（为细菌中DnaK的同源蛋白），与还未完
全折叠好的前体蛋白分子结合，以维持这种非天然构象， 并阻止它们之间的聚集。3). 前体蛋白上的信号序列与线粒 体外膜上的特异受体/外膜转运酶复合体（Translocase of outer membrane, TOM complex）识别、并被转运跨过外膜。 4). 前体蛋白在膜间质中与位于内膜上的“内膜转运蛋白复 合体（translocase of inner membrane, TIM complex）”接 触并被转运进入线粒体基质。5). 前体蛋白上的基质导入序
（1）线粒体蛋白的定位 ： “基质导入序列”（matrix-targeting sequence）：
富含带正电荷的氨基酸（主要是精氨酸和赖氨酸），常
含有丝氨酸和苏氨酸，不含酸性氨基酸（如天门冬氨酸
和谷氨酸）。进入线粒体基质和插入线粒体内膜的蛋白 （如柠檬酸合酶和细胞色素c氧化酶等）只含有上述信号 肽。而进入膜间质的蛋白前体（如细胞色素c）上除了含 有上述信号肽之外还含有一段紧接在后面的所谓“膜间 质导入序列 (intermembrane-space-targeting sequence) ”。 在将插入到外膜的前体蛋白（如外膜孔道蛋白，porin） 的上述共同信号肽之后紧接有一段所谓的“停止转运和 外膜定位序列 (stop-transfer and outer-membrane localization sequence) ”。
一、蛋白分子的折叠、组装、细胞内定位及降解
1.蛋白质的折叠： （1）热力学角度：微量热（microcalorimetry）技术（通 过测定所产生的微小热量来估算一个蛋白溶液在热变性过 程中的焓变（enthalpy））。
（2）动力学角度：巨大数目的原子的参与而导致的复杂 性和原子之间相互作用的协同性(cooperativity) 而导致的 快速性（一般在毫秒，甚至更短的时间范围内发生）。
④存在于肽链内部的一些保守序列，如Arg-X-XLeu-Gly-X-Ile-Gly-Asx和 Pro-Glu-Ser-Thr （即 所谓的PEST序列）也使蛋白分子“短命”。
（2）细胞内蛋白降解的途径 第一阶段是将要被降解的目标蛋白分子内部的
一个赖氨酸被一串的泛素（ubiquitin，76个氨基酸 残基组成）分子所修饰，；第二步是被泛素修饰的 蛋白分子进入由三十多个亚基形成的圆柱型与细胞 液隔开的蛋白降解复合体（26S proteasomes）空腔 中，并被切割成短肽。
第二类为由3条肽链形成的“三链螺旋(triple helix)”，如胶 原蛋白等；
E1将泛素激活；E2通过其肽链上的一个半胱氨酸残基将 激活的泛素从E1上接管过来；特异识别了将被降解的底物蛋 白中的N-末端去稳定残基的E3（该蛋白又叫N-识别蛋白，Nrecognin）再与连接有泛素的E2相互作用形成一复合物。之 后，泛素分子从E2上被转移到了底物蛋白上，并与一肽链内 部的赖氨酸残基共价连接。通过多轮的E2，E3相互作用，在 连接到底物蛋白上的泛素分子上再加上了多个泛素分子。这 种带有成串泛素分子的底物蛋白再被26S蛋白酶复合体 （26S proteasomes）所识别。其隔离的蛋白酶复合体腔中泛素分子 先被释放出来，然后底物蛋白被水解成小的肽段。蛋白酶复 合体的作用是要消耗能量（ATP）的。
异结合，并使之脱离运载复合物，同时使运载的核蛋白也与 输入因子α分离。
在该模型中，帮助运输的蛋白分子需要不断重复地发
挥其作用：Ran-GTP/输入因子β复合物，以及输入因子α 都将被转运回到细胞质中，然后在Ran GTP 激活蛋白 （Ran GTP activating protein, RanGAP）的作用下GTP 被水解成GDP；细胞质中形成的Ran-GDP，在与输入因 子β脱离后，可能通过某种机制再被运回到细胞核中，然 后在一种叫做Ran核苷酸交换因子（Ran nucleotideexchange factor, 又被称为RCC1）的作用下转变成RanGTP形式。这样，输入因子β和Ran-GTP都可以分别在细 胞质中和细胞核中进入另一论的核蛋白转运循环。
4.蛋白降解： （1）末端规则： ①N-末端为精氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、酪氨酸、或色氨酸等“一级去稳定残基
(primary destabilizing residues)”的话，蛋白质分子的寿命 不会长于3分钟； ②当N末端为半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、 缬氨酸、或蛋氨酸等“稳定残基 (stabilizing residues)”的时 候，蛋白分子在细胞内可以存在30个小时以上而不被蛋白 酶水解。
（2）蛋白质的结构特征： ①纤维状蛋白:
一类为由2或3股α-螺旋相互缠绕而成的超螺旋性质的所谓 盘绕圈(coilded coils)结构，在氨基酸序列上表现为由7个残基组 成的周期性重复，其中的第一和第四个残基一般为疏水性残基 （如Leu, Ala等），如纤维蛋白原、肌球蛋白、血影蛋白、角 蛋白、神经丝等;
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2.寡聚蛋白的组装程 ： （1）蛋白质绝大多数都以寡聚或多聚体形式存在 （一般来说，具有生物学功能的蛋白质都是以同源 （由相同亚基组成）或异源（由不同的亚基组成） 寡聚体/多聚体的形式出现）。
（2）寡聚体的组装过程是一个分子特异识别的过程： “结构域对换模型(domain swapping model)”：寡聚 体的组装是一个亚基的一个“结构域”被另一相同亚 基的相同结构域置换的结果。
（4）膜蛋白的插入和定位： 拓扑序列 (topogenic sequences)（25个氨基酸残
基）：内质网跨膜信号序列（ER cross-membrane signal sequences）,可以位于肽链的N末端或是内部）; 停止转运序列(stop-transfer sequences)；膜锚定序列 (membrane-anchor sequences)。有时候两个、甚至三 个这样的拓扑序列合而为一，比如在细胞色素P450
（3）分子伴侣蛋白：只与蛋白质分子的非天然构象结合， 而不与已经折叠成天然构象的蛋白分子结合。
（4）蛋白质折叠的质量控制：质量控制的蛋白分子包括 两大类：第一类是分子伴侣蛋白，包括BiP (GRP78), Calnexin, Calreticulin, PDI (Protein disulfide isomerase), PPI (Peptidyl prolyl cis/trans isomerase等等；第二类是糖 基修饰蛋白，包括具有蛋白折叠感受器功能的尿苷二磷酸 -葡萄糖：糖蛋白糖基转移酶(UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase, UGGT)和糖苷酶II (glucosidase II)等。
这两类蛋白在细胞液中似乎是由不同蛋白因子识别 （分别被称为PTS1R和 PTS2R），到过氧化物酶体膜上
后却利用同一个运输通道，这类信号肽在蛋白进入后将被 切除掉。
（6）蛋白定位出错引起的疾病 Zellweger综合症的病人被发现是因为PTS1R
缺陷引起的。这类病人的过氧化物酶体是空的， 不含基质蛋白，但它们的膜蛋白是完整的（说明 膜蛋白是通过一条不同的途径定位的）。