植物表达载体及有关载体质谱图
国家自然科学基金结题报告
国家自然科学基金资助项目结题报告资助类别：青年科学基金项目亚类说明：附注说明：项目名称：CPK10基因调控拟南芥响应干旱胁迫的分子机制研究负 责 人：魏凤菊电话：0312-*******电子邮件：weifj98@依托单位：河北农业大学联 系 人：张永升电话：0312-*******资助金额：22（万元）累计拨款：22.0（万元）执行年限：2012.01-2014.122015年01月16日填表日期：国家自然科学基金委员会制（2012年）NS FC-R E PORT -2014412-TROPER-CFSN报告正文一、研究计划要点及执行情况概述。
研究基本按照原计划执行，一些研究内容稍作调整。
（1）检测了CPK10与HSP1蛋白的可能互作方式。
通过酵母双杂交技术得出HSP1可以发生自身互作。
在利用TAP （串联亲和纯化）技术结合质谱技术分析HSP1与CPK10的作用方式过程中，纯化获得的杂蛋白信号较强，试验未能顺利进行下去。
（2）筛选了与CPK10可能互作的其它靶蛋白。
分离保卫细胞并建立酵母cDNA 文库，通过酵母双杂交技术筛选互作蛋白，获得的蛋白经测序分析多为持家基因表达产物，利用构建的保卫细胞酵母文库筛选CPK10互作蛋白的方法暂告一段。
利用串联亲和纯化技术筛选CPK10可能的互作蛋白，再结合质谱分析技术测得蛋白的氨基酸序列，获得多个候选基因。
（3）对靶基因是否参与干旱逆境进行了初步分析。
检测靶基因受干旱诱导后的表达情况，组织及亚细胞表达情况。
（4）初步检测了cpk10突变体材料中靶基因的表达情况，明确的试验结果有待重复。
（5）获得了CPK10与CPK30的双突变体，初步进行了基因功能分析。
二、研究工作主要进展和所取得的成果。
（一）酵母cDNA 文库的构建及筛选将一定数量的拟南芥第3、4轮莲座叶叶片剪下后洗净，放入匀浆机中，加入适量的冷蒸馏水，打磨成碎表皮条，用孔径为75 μm 滤膜过滤，去除含有大量叶肉细胞的液体，收集碎表皮条。
质谱的图谱分析与介绍57页PPT
6
、
露
凝
无
游
氛
，
天
高
风
景
澈
。
7、翩翩新 来燕，双双入我庐 ，先巢故尚在，相 将还旧居。
8
、
吁
嗟
身
后
名
，
于
我
若
浮
烟
。
9、 陶渊 明（ 约 365年 —427年 ），字 元亮， （又 一说名 潜，字 渊明 ）号五 柳先生 ，私 谥“靖 节”， 东晋 末期南 朝宋初 期诗 人、文 学家、 辞赋 家、散
1
0
、
倚
南
窗
以
寄
傲Hale Waihona Puke ，审容膝
之
易
安
。
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
文 家 。汉 族 ，东 晋 浔阳 柴桑 人 （今 江西 九江 ） 。曾 做过 几 年小 官， 后辞 官 回家 ，从 此 隐居 ，田 园生 活 是陶 渊明 诗 的主 要题 材， 相 关作 品有 《饮 酒 》 、 《 归 园 田 居 》 、 《 桃花 源 记 》 、 《 五 柳先 生 传 》 、 《 归 去来 兮 辞 》 等 。
植物表达载体构建
共同特点
启动子的活化受到物理或化学信号的诱导； 启动子的分子结构都具有增强子、沉默子或类
似功能的序列结构； 感受特异性诱导的序列都有明显的专一性； 一部分该类型的启动子同时具有组织特异性表
达的特点； 该类启动子常以诱导信号命名，可分为光诱导
表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创 伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达启动子 和共生细菌诱导表达基因启动子。
在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物 质。 初始产物并不带有颜色，为无色的吲哚衍生物， 后经氧化二聚作用形成5，5‘-二溴-4，4’-二氯 靛蓝染料，使具有Gus活性的部位或位点呈现 蓝色。 注意：在测定时，由于植物体内的过氧化物酶 能促进氧化二聚作用，使颜色加深，所以染色 程度不能准确反映Gus活性，
植物表达载体构建
张玉刚 zyg4458@
载体 vector
克隆载体
载
体
原核表达载体
表达载体 真核表达载体
植物表达载体
质粒图谱及质粒构建
启动子 外源基因 终止子 启动子 报告基因 终止子
目的片段
（标记基因） 选择标记
载体
表达载体(expressing vector)
特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序 列
Figure 1 a) Mature cold stored potato tubers, transformed and control, stained for GUS activity. b) In vitro-grown microtubers, transformed and control, stained for GUS activity
GUS酶的显色反应以底物不同而不同： 5-bromo-4-chloro-3-indole-B-D-glucuronide 靛蓝 5-bromo-6-chloro-3-indole-B-D-glucuronide 橘红 4-methylumbelliferyl-B-D-glucuronide 荧光产物
载体图谱
一、pGADT7(Amp)酵母表达载体(AD-Amp)AD forward primer: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3'AD reverse primer: 5'-AGATGGTGCACGATGCACAG-3'F：GC AT CGA TAC ATG GC T TG T GCTACTCTGAR：GGCC GGATCC TTAAGAGAGGTAGCTGGGAGAD forward primer: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3'AD reverse primer: 5'-AGATGGTGCACGATGCACAG-3'二、pGBKT7(Kan0酵母表达载体(BD-Kan)三、BIFC(Kan)验证互做蛋白表达载体（德国）四、pGR107(Kan)表达载体（PVX-10kb）吴建国MCS:ClaI/SmaI/SalI(pgR107)MCS:ClaI/AscI/NotI/SalI(pgR106) 五、BIFC(Amp)载体（美国）3075（nEYFP-329bp）3076 (cEYFP-218bp)F：GGC GAATTC ATG GCTTGTGCTACTCTGA R：GGC CCTAGG AGAGAGGTAGCTGGGAG TAA TAG TGA六、RNAI(Kan)载体-pFGC5941（王宗华）七、pGEX-4T-1(Amp)原核表达载体八：pET-29a(Kan)原核表达载体九、. pEGAD(Kan)植物表达载体*XbaⅠ cleavage blocked by overlapping dam methylation. Must grow in dam-strain to cut. Note, XhoⅠ is not unique.pTRV2(a) Genome organization of TRV. The TRV-RNA1 open reading frames (ORFs) correspond to 134 and 194 kDa replicase, movement protein (MP) and a 16-kDa cysteine-rich protein. The TRV-RNA2 ORFs corresponds to coat protein (CP), and the 29.4 and 32.8 kDa proteins. gRNA, genomic RNA; sgRNA, subgenomic RNA. Asterisks (*) indicate the readthrough of 134 kDa protein.(b) TRV based VIGS vectors. TRV cDNA clones were placed in betweenthe duplicated CaMV 35S promoter (2×35S) and the nopaline synthase terminator (NOSt) in a T-DNA vector. LB and RB refer to left and right borders of T-DNA. Rz, self-cleaving ribozyme. MCS, multiple cloning sites.十、十一、1103-YFP十二：pBINPLUS十三、pBin438。
植物表达载体及有关载体质谱图
pCAMBIA super1300-GFP, pCAMBIA super 1300-EGFP，
pCAMBIA1390-GFP
• 3.农杆菌：LBA4404，EHA103、105，GV3101
2、其他植物载体
• 4. pRTL2ห้องสมุดไป่ตู้, pRTL2-GFP , pRTL2-RFP , pRTL2-YFP
• 5. pH7FWG2，pH7WGF2 6. pK2GW7
• 7. pBGWFS7
• 10. pHANNIBAL
8. pIFGW7
11. pKANNIBAL
9. pFGC5941
12. pDONR221，
• 13. pART27
14. pPD49.83
15. pBIN-GFP，
• 16. pPZP212, pPZP2121；pPZP212-GFP
植物表达载体表达载体原核表达载体真核表达载体的构建双元表达载体真核表达载体如何构建表达载体构建表达载体过表达载体超表达载体
植物表达载体
一、植物表达载体的分类 二、其中常用载体的载体信息
1、常用植物表达载体
• 1.pBI101，121，221；pBI121-GFP, pBI221-GFP
• 2.pCAMBIA 1300, 1301, 1302,1303，1304，1305，2300，
• pCAMBIA1302只含有绿色荧光蛋白GFP的报告基 因； • pCAMBIA3300和3301含编码抗除草剂草丁膦的bar
pCAMBIA1300
pCAMBIA3300
pCAMBIA3301
二、载体信息
PMI基因作为选择标记的植物表达载体构建及转化白花丹参体系的建立
PMI基因作为选择标记的植物表达载体构建及转化白花丹参体系的建立目的：构建含有大肠杆菌6- 磷酸甘露糖异构酶（6-phosphomannose isomerase，PMI）基因并替换潮霉素抗性（hygromycin，hyg）基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI，同时建立以PMI/甘露糖为筛选标记的白花丹参转基因体系。
方法：首先从大肠杆菌Escherichia coli DH5α中克隆PMI基因，然后以PMI基因替换植物表达载体pCAMBIA1305 中的hyg基因，构建了以PMI 基因为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI，并用电击转化方法导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404 中，用叶片浸染法转化白花丹参。
结果：在白花丹参MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1固体分化培养基中附加20 g·L-1甘露糖和10 g·L-1蔗糖为碳源的选择压力下，pCAMBIA1305-PMI 的转化率为23.7%，对再生植株用PCR检测证实了PMI基因的导入。
结论：建立了以PMI-甘露糖为选择系统的白花丹参转基因体系，可应用于后续目的基因的转化奠定了基础。
标签：6-磷酸甘露糖异构酶（PMI）基因；甘露糖；白花丹参；转基因筛选标记传统方法获得的转基因植物中存留的抗生素筛选基因可能会危害人类肠道内的正常菌落或传播到周围环境中引起基因污染。
虽然目前还没有关于标记基因迁移带来危害的报道[1]，但抗性标记基因潜在的生态环境和食用安全性一直颇具争议。
因此，培育具有无抗生素的生物安全性标记基因的转基因植株势必成为未来植物转基因的重要发展方向。
6-磷酸甘露糖异构酶（phosphomannose isomerase，PMI）基因编码6-磷酸甘露糖转移酶，其产物可催化6-磷酸甘露糖转变为6-磷酸果糖。
最新基因表达载体构建
1 用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于能 够 吸收环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称 为感受态细胞。 2 用大肠杆菌质粒与目的基因进行重组形成基 因——质粒重组DNA分子。 3 将基因——质粒重组DNA分子与感受态细胞 混合，在一定温度下，感受态细胞吸收周围重 组DNA分子，完成转化过程。
量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞， 这时农杆菌中的Ti质粒上的T—DNA分子可转 移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色DNA 分子之上。
农杆菌
农杆菌转化法示意图
农杆菌
T—DNA Ti质粒
EcoRI酶
核—DNA 目 标
目标细胞
DNA 重组
侵染 转化 转基因植物
（二） 将目的基因导入动物细胞
1 基因工程培育转基因动物最常用、最有效的 方法——显微注射技术
基因表达载体构建
4 从苏云金芽孢杆菌细胞DNA分子中提取得到 Bt毒蛋白基因能否直接进入普通棉细胞中？ 如果把目的基因人工注射到普通棉细胞中， 那么该基因在棉细胞中会稳定存在，复制和表 达吗？
5 假如你是一个基因工程操作者，若使目的基因 进入棉细胞，并能在棉细胞中遗传和表达，你 应当采取什么办法？你能说出其中的理由吗 ？
（1）将含有目的基因的表达载体提纯； （2）从雌性动物体内取出受精卵细胞。 （3）用显微注射仪把目的基因注射到受精卵细胞； （4）把含有目的基因的受精卵移植到雌性动物子
宫或输卵管发育成具备新性状的动物。 2 实例
世界上第一例体型比普通小鼠大1.8 倍的转 基因“超级小鼠”就是用显微注射技术获得成
（三） 将目的基因导入微生物细胞
2 目的基因导入受体细胞遵循的基本原理是什么？ 通常借鉴细菌或病毒侵染细胞和寄生之途径。ຫໍສະໝຸດ （一）将目的基因导入植物细胞
质粒图谱大全之欧阳索引创编
（转载）欧阳家百（2021.03.07）一.九种表达载体Pllp-OmpA,pllp-STII,pMBP-P,pMBP-C,pET-GST,pET-Trx,pET-His,pET-CKS,pET-DsbA 二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39 band40bProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplu sCompetentCellsProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41 and42ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems4 3.1and44ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNA ProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurifi cationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAP pGEX-2TpGEX-2TKpGEX-4T-1 pGEX-4T-2 pGEX-4T-3 pGEX-5X-1 pGEX-5X-2 pGEX-5X-3 pGEX-6P-1 pGEX-6P-2 pGEX-6P-3五.PTYBsystem PTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-) pCDNA3.1( ) pPICZalphaA pGAPZαA PYES2.0pBI121pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
基因工程载体植物基因工程优秀课件
载体的概念
载体（vector) • 基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩
增和表达的工具称为载体。
目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持 高效表达，在很大程度上决定于载体 。
载体的功能
载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 为外源基因提供整合能力
载体的要求
质粒
受体细胞 E.coli
结构 环状
插入片断 ＜ 8kb
举例 pUC18/19 , pBR322等
λ噬菌体载体 丝状噬菌体及噬菌粒载体
E.coli E.coli
线状 环状
粘粒载体载体
E.coli
环状
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)载体
YAC (Yeast Artificial chromosome )载体
遗传物质 + 载体
为什么要用到载体？
Байду номын сангаас
重组的DNA分子
引入细胞或生物体内
复制与表达
稳定地遗传给下代
基因工程流程图
为什么需要载体？ 1）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区 （encoding region)和终止子（terminator)的基因，or 组成 基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的； 2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。
EMBL系列， λ gt系列 M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
pBeloBAC11
pYAC4
pCXLamIntWT, pCXLamIntR and pCXLamIntROK SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
质谱定性分析及谱图解析..共103页
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
质谱定性分析及谱图解析..
21、没有人陪你走一辈子，所以你要 适应孤 独，没 有人会 帮你一 辈子， 所以你 变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
pMD18-19 T 载体图谱
852 ~ 1466
Ampr
1626 ~ 2486
【pMD19-T Vector相关位点说明】
Cloning site
431
BcaBEST Sequencing Primer M13-47 binding site 347 ~ 370
BcaBEST Sequencing Primer RV-M binding site 478 ~ 500
Digested by EcoR V
...gtcgacgatT . . . c ag c t g c t a
atctctaga... T t a g ag a t c t . . .
(T-Cloning Site)
■ 制品内容
pMD18-T or pMD19-T Vector (50 ng/µl) Control Insert (50 ng/µl) Ligation Mix*
BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M
GAGCGGATAACAATTTCACACAGG lacZ
Hind III
Hinc II Sse8387 I Acc I
Sph I Pst I Sal I EcoR V
Xba I
BamH I
Xma I Sma I Kpn I
Sac I
EcoR I
1 µl
dH2O
3 µl
2）加入5 µl（等量）的 Ligation Mix。 3）16℃反应30分钟。
注）① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反 应效率稍微降低。
② 5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率 稍微降低。
4）全量（10 µl）加入至100 µl JM109感受态细胞中 冰中放置30分钟。