基因工程乙肝疫苗的制备
重组乙肝疫苗的制备工艺流程
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在进行重组乙肝疫苗的制备之前，需要进行一系列的准备工作。
基因工程乙肝疫苗ppt课件
答敏感性不同，所以有的人打疫
苗容易产生抗体，而部分人不会
产生抗体。乙肝疫苗第一针后大
概有30%左右的人产生抗体，而
第二针后有50%～70%左右，第
三针后90%左右产生抗体。
打乙肝疫苗前的注意事项有以下几点
•
•
1、有支气管哮喘和血清病的人、对青霉素等药物过敏者和过敏性荨麻疹
患者不能接种乙肝疫苗
•
2、成年人接种乙肝疫苗最好注射在上臂三角肌处，此处的接种成功率最
应用前景
• 基因工程乙肝疫苗较之于血液乙肝疫苗主要区别之一在于它生产来源 不同。它有着许多血源乙肝疫苗不可比拟的优势。
•
自1985年以来，我国一直采用接种血源乙肝疫苗预防乙肝，血源
乙肝疫苗对控制我国乙肝大面积流行曾起了很大作用，但是，由于血
源乙肝疫苗需用乙肝病毒表面抗原携带者的血浆为原、乙肝患者和乙肝病毒携带者不需要接种乙肝疫苗
•
4、非正常出生的婴儿(包括剖腹产)和出生后体质较差的婴儿最好推迟接种
时间
•
5、发烧患者和先天性免疫疾病患者或某些重症患者，应根据医院判断是
什么是基因工程乙肝疫苗？
• 基因工程乙肝疫苗（酵母重组）是一种乙肝 表面抗原（HbsAg）亚单位疫苗，它是采用 现代生物技术将乙肝病毒表达表面抗原的基 因进行质粒构建，克隆进入酵母菌中，通过 培养这种重组酵母菌来表达乙肝表面抗原亚 单位。这种乙肝表面抗原亚单位具有原料易 得、产量大、安全、高效等特点。美国默克 公司研究的此产品最早获美国FDA批准。国 内生产此产品技术均从其引进。
应用学科
免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科 ）；免疫预防（三级学科）
• 发展概况
重组酵母乙肝疫苗首先在美国默克公司研 制成功，并于1986年被美国FDA批准通过。 1991年，我国自行研制的第一个基因工程 疫苗—哺乳动物细胞生产乙肝疫苗获准生 产。我国当前已能大规模生产乙型肝炎表 面抗原重组疫苗，分别称酵母重组和CHO（ 中国仓鼠卵巢细胞）重组疫苗，免疫效果 比同剂量的血源疫苗优良，并且十分安全 ，可以放心使用。
乙肝疫苗生物制品产品制备工艺流程
乙肝疫苗生物制品产品制备工艺流程英文回答：Production Process of Hepatitis B Vaccine Biologics.The production process of hepatitis B vaccine biologics involves several key steps to ensure the safety, efficacy, and quality of the final product.1. Cell Culture:Yeast cells (Saccharomyces cerevisiae) are used to produce the hepatitis B surface antigen (HBsAg), which is the main component of the vaccine.The yeast cells are genetically engineered to express the HBsAg protein.The cells are cultured in a bioreactor under controlled conditions to optimize HBsAg production.2. Purification:The culture broth containing HBsAg is harvested and purified through various steps, such as:Centrifugation to remove impurities.Ultrafiltration to concentrate the HBsAg.Chromatography to separate HBsAg from other proteins.3. Inactivation (for Inactivated Vaccines):For inactivated vaccines, the purified HBsAg is chemically inactivated using formaldehyde.Inactivation ensures that the virus is not capable of causing infection while retaining its immunogenic properties.4. Adjuvantion (Optional):Adjuvants can be added to enhance the immuneresponse to the vaccine.Common adjuvants used in hepatitis B vaccinesinclude aluminum hydroxide or AS04.5. Formulation:The purified HBsAg or inactivated HBsAg isformulated into the final vaccine product.Other components, such as preservatives, stabilizers, and buffers, are added to maintain the stability andefficacy of the vaccine.6. Filling and Packaging:The formulated vaccine is filled into sterile vials, prefilled syringes, or other appropriate containers.The containers are sealed and labeled with product information.7. Quality Control:Extensive quality control tests are performed throughout the production process to ensure that the vaccine meets the required standards of safety and potency.Tests include sterility testing, potency assays, and evaluation of physical and chemical properties.中文回答：乙肝疫苗生物制品生产工艺流程。
重组cho细胞乙肝疫苗生产流程
重组cho细胞乙肝疫苗生产流程英文回答：Recombinant hepatitis B vaccine production process involves several steps. First, a genetically engineered yeast cell line is used to produce the hepatitis B surface antigen (HBsAg), which is the main component of the vaccine. The yeast cells are modified to express the gene encoding HBsAg, and then they are grown in large fermentation tanks under controlled conditions.During the fermentation process, the yeast cellsmultiply and produce HBsAg. The culture is then harvested, and the cells are removed by centrifugation or filtration. The resulting HBsAg-containing solution is purified using various techniques such as chromatography andultrafiltration to remove impurities and other cellular components.Once purified, the HBsAg is formulated into the finalvaccine product. This may involve the addition of adjuvants, preservatives, and stabilizers to enhance the vaccine's effectiveness and shelf life. The final vaccine product is then filled into vials or syringes, and undergoes quality control testing to ensure its safety, potency, and purity.The production process of recombinant hepatitis B vaccine is highly regulated and follows strict quality control measures to ensure the safety and efficacy of the vaccine. The entire process, from the initial genetic engineering of the yeast cells to the final formulation and packaging of the vaccine, is carried out in a controlledand sterile environment to prevent contamination and maintain product integrity.中文回答：重组乙肝疫苗的生产流程涉及多个步骤。
乙肝疫苗 生物制造工艺
乙肝疫苗生物制造工艺乙肝疫苗，这可是个守护健康的小卫士呢。
那它是怎么被制造出来的呀？这就像是一场奇妙的生物魔法之旅。
咱先从原材料说起吧。
制造乙肝疫苗的原材料，就好比是盖房子的砖头和水泥，非常关键。
科学家们得精心挑选合适的酵母或者其他载体，这载体就像是一个小小的工厂，要在里面生产出我们需要的乙肝疫苗成分。
你想啊，如果载体选不好，就像盖房子的砖头质量差，那这房子能结实吗？这疫苗能好用吗？肯定不行呀。
在这个小小的“生物工厂”里，要把乙肝病毒的某个部分基因导入进去。
这个基因就像是一张设计图纸，告诉这个“小工厂”该怎么生产出和乙肝病毒相关的特定蛋白质。
这蛋白质可重要啦，它是乙肝疫苗的核心部分呢。
就像我们做菜，这蛋白质就是主菜，其他的配料都是为了让这个主菜更好地发挥作用。
然后呢，这个“小工厂”就开始按照基因这张“图纸”进行生产啦。
这个过程可复杂着呢，就像是一个超级精密的仪器在运作。
要给这个“小工厂”提供合适的温度、营养物质等条件，就像我们人要吃饭睡觉才能好好工作一样。
如果条件不合适，那这个“小工厂”可能就会出故障，生产出来的蛋白质就可能不合格。
这就像我们做饭的时候火候不对，菜就不好吃了一样。
生产出来的蛋白质还不能直接就变成疫苗。
还得经过一系列的提纯和加工。
这就好比是从一堆矿石里提炼出金子一样。
要把那些杂质去掉，只留下纯净的、有效的蛋白质。
这个过程需要高科技的手段，就像淘金者需要特殊的工具一样。
要是提纯不好，杂质太多，那这疫苗打到身体里可就麻烦了，就像吃了不干净的东西会肚子疼一样。
在把蛋白质提纯之后，还要进行一些处理，让它变得更加稳定，能够在储存和运输的过程中保持活性。
这就像是给珍贵的东西包上一层保护膜一样。
如果没有这层保护膜，这疫苗在还没用到人身上的时候就坏掉了，那之前的努力不就白费了吗？最后，这些处理好的蛋白质就被制成了乙肝疫苗。
这些疫苗被装进小瓶子里，就像一个个等待出征的小战士，它们的使命就是进入我们的身体，让我们的身体认识乙肝病毒，然后产生抵抗乙肝病毒的能力。
乙肝疫苗的研究进展
乙肝疫苗的研究进展引言乙肝病毒是一种全球性的公共卫生问题，影响着全世界范围内的大量人口。
乙肝病毒感染会导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌等疾病，对个人健康和社会经济都产生了巨大的影响。
乙肝疫苗的研制和应用对于预防乙肝病毒感染具有重要意义，本文将围绕乙肝疫苗的研究进展进行综述。
研究现状自乙肝疫苗研制成功以来，疫苗的制备方法、接种时间、接种次数等方面都得到了不断的改进和优化。
目前，乙肝疫苗主要分为血源性疫苗和基因工程疫苗两大类。
血源性疫苗是通过收集乙型肝炎患者血清中的表面抗原（HBsAg）制备而成的，而基因工程疫苗则是通过基因工程技术将表面抗原的基因克隆到酵母或中国仓鼠卵巢细胞中表达制备而成的。
在接种时间方面，一般认为乙肝疫苗的接种应在婴儿出生后尽快进行，最好是在出生后24小时内。
同时，根据研究发现，对于乙肝表面抗原阳性母亲的新生儿，在出生后24小时内接种乙肝疫苗可以更好地保护婴儿免受乙肝病毒的感染。
在接种次数方面，根据现有资料，婴儿接种3针乙肝疫苗后，大多数接种者可以产生有效的保护性抗体，但也有部分接种者抗体水平较低，因此，对于易感人群，尤其是乙肝表面抗原阳性母亲的新生儿，建议在一定的时间间隔后进行补种。
研究方法乙肝疫苗的研究方法主要包括实验设计、数据收集和统计分析等。
在实验设计方面，研究者通常采用随机对照试验的方法，将受试者随机分为实验组和对照组，分别给予不同剂量的乙肝疫苗和安慰剂，并观察其效果和不良反应。
在数据收集方面，通过收集受试者的基本情况、血清学检测和病毒学检测等相关数据，了解疫苗的效果和安全性。
在统计分析方面，利用统计学原理对数据进行处理和分析，计算疫苗的保护率、抗体阳性率、抗体滴度等指标，以评估疫苗的有效性和安全性。
研究结论通过大量的研究和实验，乙肝疫苗在预防乙肝病毒感染方面显示出显著的效果。
根据现有资料，乙肝疫苗可以有效地预防婴儿和儿童感染乙肝病毒，并能够有效地降低肝硬化和肝细胞癌等疾病的发生率。
基因工程乙肝疫苗的制备
基因工程乙肝疫苗的制备【摘要】基因工程乙肝疫苗是通过构建含有乙肝表面抗原的重组质粒转染酵母细胞，制备乙肝病毒表面的有效蛋白。
本文主要介绍基因工程疫苗--重组酵母乙肝疫苗制备的基本原理和工艺流程，以及乙肝疫苗的纯度分析方法。
【关键词】 乙肝疫苗 重组质粒 工艺流程1.基因工程乙肝疫苗产生背景疫苗是人类目前可以彻底消灭某一疾病的唯一武器，接种疫苗被认为是最有效、最经济的疾病预防手段。
《发展中国家消灭乙型肝炎免疫接种计划实施指南》中指出：“世界上四分之三的人口生活在中或高乙肝流行区，因此，唯一的策略就是有效地减少乙肝的流行，最终消灭乙肝······”世界卫生组织肝炎专家及计划免疫全球咨询组认为：控制全球乙型肝炎及减少死亡的策略是开展大规模的婴儿及学龄前儿童的乙肝疫苗接种。
我国卫生部制定的目标是从92年开始在全国逐步推行乙型肝炎（HB ）计划免疫。
92年全国共生产血源疫苗1500万人份，尚不能满足新生儿接种需要，如考虑其他人群，缺口更大。
为了实现HB 计划目标，进一步为控制全球HB 做出贡献，我们必须大规模提高HB 疫苗的产量和进一步提高质量。
血源HB 疫苗原料为无症状带毒者的HBsAg 阳性血浆。
血源价格昂贵，供应量有限，采集困难。
因此血源疫苗的产量和成本受到原料的限制。
利用基因工程重组微生物细胞表达HBsAg 生产HB 疫苗的技术，原料易得，价廉，适宜进行大规模生产，有可能大幅度降低成本。
2.使用重组酵母的原因和重组酵母构建2.1使用重组酵母的原因使用重组酵母进行乙肝疫苗的大规模生产，有如下几点原因：（1）.酵母对培养基的要求低，价廉易得。
（2）.酵母细胞生长快，故生产率高。
（3）.动物细胞生长慢，容易染菌，对操作要求严。
（4）.酵母系统容易放大，动物细胞系统放大难。
2.2重组酵母构建HBV 只有3200bp ，为双链的DNA,是一个相当小的病毒。
生物技术制药乙肝疫苗制备ppt课件
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分离纯化
无菌过滤
离子交换层析
氢氧化铝共沉淀
凝胶层析
无菌过滤
超滤
硫氰酸盐处理
微滤
疏水层析
细胞破碎
微滤
超滤
硅胶吸附
பைடு நூலகம்
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细胞破碎 微滤 超滤
乙肝疫苗的制备
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乙型病毒性肝炎
乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒 （HBV）引起的、以肝脏炎性病变 为主，并可引起多器官损害的一种 疾病。乙肝广泛流行于世界各国， 主要侵犯儿童及青壮年，少数患者 可转化为肝硬化或肝癌。因此，它
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乙肝疫苗的概念
乙肝疫苗是用于预防乙肝的特 殊药物。疫苗接种后，可刺激 免疫系统产生保护性抗体，这 种抗体存在于人的体液之中， 乙肝病毒一旦出现，抗体会立
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无菌过滤
氢氧化铝共沉淀
纯化后的抗原再与氢氧化铝共 沉淀，在共沉淀时，抗原吸附 在氢氧化铝上。
分装
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疫苗纯度的测定
乙肝疫苗是通过肌肉注射的方式进 入人体系统，为了降低疫苗内杂质 含量对人体产生的不良影响，必须 进行疫苗的纯度检测。
对重组酵母乙肝疫苗，现有的 HPLC检测系统DTT应结构式用0.1mol/L DTT （DTT即DL-Dithiothreitol，中文名
母细胞，以扩DNA 增
重组分子。
筛选和鉴定经转化处理
的酵母细胞，获得外源
检 基检因测高正效确表表达达的基目因的工产物 检
程菌 的酵母（检）
0.0
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基因工程药物——乙肝疫苗
一、什么是基因工程药物
• 基因工程药物是先确定对某种疾病有预防 和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白 质合成过程的基因取出来，经过一系列基 因操作，最后将该基因放入可以大量生产 的受体细胞中去，这些受体细胞包括细菌、 酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细 胞，在受体细胞不断繁殖过程中，大规模 生产具有预防和治疗这些疾病的蛋白质， 即基因疫苗或药物。 在医学和兽医学中应 用正逐步推广。
3、乙肝疫苗的药理作用、临床应用、不良反应
药理作用
临床应用
• • 目前临床上应用的乙肝疫苗主要有以下几种： （1）血源性乙肝疫苗：此疫苗是用无症状的HBsAg携带者的血液制成，故称血源性乙肝疫 苗。它的制备步骤大致是：采用高滴度HBsAg阳性携带者血液，分离出血浆并除去其中有感 染的HBV颗粒后，再将HBsAg予以浓缩与纯化，充分灭活，以消灭其中可能存在的一切已知病 毒和消除HBsAg表面可能存在的全部宿主蛋白，然后添加佐剂及防腐剂而成。为确保疫苗的 安全，每一阶段均取样做无菌试验、热源试验及动物安全试验等，以检查疫苗中有无其他病 原体及血液中的抗原物质。此种疫苗的免疫原性与安全性均已获得解决，但尚有一些缺点： ① 为防止可能存在的某些病原体在制备过程中逃避灭活，采用了严格、复杂且费时的物理与 化学方法纯化HBsAg抗原与灭活措施，使制备成本提高而疫苗产量不高；②随着乙肝疫苗长 HBsAg 期而广泛的使用，无症状HBsAg携带的数目势必逐渐 减少，最终将难以再用他们的血液制备 疫苗。 （2）基因工程疫苗：利用基因工程研制重组DNA乙肝疫苗，曾先后研制过大肠杆菌系统、 啤酒酵母细胞系统、哺乳动物细胞系统和牛痘病毒系统的重组乙肝疫苗。目前多用酵母基因 的重组疫苗。其具有良好的免疫原性，免疫应答特点与血源性乙肝疫苗基本相似，且多无严 重的不良反应。尽管它含酵母蛋白不超过1%，但对其产生变态反应的担忧尚未完全排除。 （3）含前S蛋白的乙肝疫苗：目前临床上应用的血源性疫苗与基因工程疫苗，均只含 HBsAg蛋白，当证实S蛋白能增强HBsAg的免疫应答后，又注意到单纯只含HBsAg蛋白的疫苗对 血液透析病人与新生儿免疫效果较差时，遂生产出添加前S蛋白的酵母源性重组乙肝疫苗， 它确能明显地增强免疫应答。
乙肝疫苗产生作用的原理
乙肝疫苗产生作用的原理乙肝疫苗是用于预防乙型肝炎的一种疫苗，其原理是通过引入乙肝病毒的表面抗原，激发人体的免疫系统产生特异性的免疫反应，从而使人体获得对乙肝病毒的保护。
乙肝疫苗的产生作用的原理主要包括：病毒提取、抗原制备、免疫应答等多个方面。
首先，在乙肝疫苗的制备过程中，乙肝病毒的表面抗原是必不可少的。
这些表面抗原主要有乙肝病毒的表面蛋白HBsAg，它是乙肝病毒的外壳蛋白，也是免疫系统辨识病毒的主要目标。
这些表面抗原可以通过多种方法从乙肝病毒颗粒中提取出来，或通过基因工程手段在细胞中合成，制备成疫苗的活性成分。
其次，在接种乙肝疫苗后，疫苗中的表面抗原会进入人体，激活免疫系统的应答过程。
这一过程主要分为两个阶段：识别和应答。
首先，免疫系统中的特异性细胞，如树突状细胞和B淋巴细胞，会识别疫苗中的表面抗原，将其转化为抗原呈递细胞。
这些抗原呈递细胞会将抗原结合到自身的表面分子上，并将其呈递给其他免疫细胞，如T淋巴细胞。
接着，T淋巴细胞通过与抗原结合，激活并扩增，进一步引发免疫应答。
这些T淋巴细胞会分化为多种类型细胞，包括CD4+辅助T细胞和CD8+细胞。
CD4+辅助T细胞会分泌细胞因子，调控其他免疫细胞的活性，促进B细胞产生抗体。
CD8+细胞则具有杀伤感染的细胞的能力，可以通过识别并击杀感染乙肝病毒的人体细胞。
最后，免疫系统对乙肝病毒产生特异性的免疫反应。
在接种乙肝疫苗后，免疫系统会对乙肝病毒的表面抗原产生特异性的抗体反应。
这些抗体主要为IgG类抗体，可以与乙肝病毒结合，阻止病毒进入和侵染人体细胞。
此外，免疫系统还会生成细胞免疫应答，即通过杀伤感染乙肝病毒的细胞来清除病毒。
这些特异性的免疫反应为乙肝病毒感染提供了保护，预防了乙型肝炎的发生和发展。
总的来说，乙肝疫苗产生作用的原理主要包括病毒提取、抗原制备和免疫应答等方面。
通过引入乙肝病毒的表面抗原，激活免疫系统的应答，产生特异性的抗体和细胞免疫反应，从而保护人体免受乙型肝炎的感染和发病。
基因工程方法生产乙肝疫苗
基因工程方法生产乙肝疫苗乙肝病毒的感染可导致慢性肝脏疾病甚至肝癌的发生。
[1] 我国乙肝感染率为60%，乙肝表面抗原携带率约为10%，有约1.2亿人携带乙肝病毒。
[2] 疫苗接种是预防乙肝的主要途径。
国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。
第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。
[3] 但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗。
[4]1982年, Valenzuela等人在国际上首次成功运用基因手段构建重组质粒，在酵母中表达出乙肝病毒表面抗原。
[7] 1986年，美国批准了酵母来源基因工程方法生产的乙肝疫苗投放市场。
[5] 本文主要内容是简要总结运用基因工程方法，以酵母为载体生产乙肝疫苗的流程。
乙肝病毒中决定乙肝病毒抗原性的蛋白是乙型肝炎病毒(HBV)包膜蛋白，主要包括：乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，前S1抗原和前S2抗原。
乙肝病毒包膜相关蛋白的编码基因位于HBV基因组的S区。
S区基因有三个起始密码子和同一个终止子，从不同的起始密码子开始转录，可得到三种不同的包膜蛋白。
小蛋白（SHB,即主表面蛋白,S蛋白）包括表面抗原HBsAg（p24为非糖基化形式，gp27为糖基化形式），由226个氨基酸组成；中蛋白（MHB）除了具有S蛋白的226个氨基酸，N端多出55个氨基酸残基（前S2蛋白）；大蛋白（LHB）除了具有S蛋白和前S2蛋白还具有前S1蛋白。
在完整的乙肝病毒Dane毒粒中，小蛋白、中蛋白与大蛋白通过各自S蛋白之间的二硫键共价连接，外包脂膜形成完整颗粒。
由于三种蛋白中均包括S蛋白区域，故含有HBsAg的疫苗可以在机体中引发针对乙肝病毒的免疫反应。
[2]基因工程技术生产乙肝疫苗首先要选择表达HBsAg的载体系统。
在之前的研究中发现，若选用细菌为基因表达载体，即使使用强启动子，也不能得到大量具有免疫原性的基因表达产物。
医学专题乙肝疫苗的生产工艺34126
疏水柱层析
介质： Butyl S Sepharose FF
加入适量硫酸铵，调节电导率与柱层析平衡液电导率相等
按照平衡柱床、上样吸附、平衡液洗柱、降低硫酸铵浓度解析 (jiě xī)、清柱再生程序层析
阴离子交换柱层析
介质：DEAE Sepharose FF
HBsAg活性蛋白(dànbái)经Sephadex G-25柱脱盐换液，使缓冲盐系 统的PH、离子强度和IEC平衡液一致 按照平衡柱床、丄样吸附、氯化钠浓度梯度分段洗脱、清柱再生 程序层析
第十一页，共十二页。
内容 总结 (nèiróng)
乙肝疫苗的制备。编码乙型肝炎表面抗原的基因的获取。一般的目的基因的获取方法 有：。①具有准确的转录后修饰(xiūshì)功能 ,表达的糖基化药 物蛋白在分子结构、理化特性 和生物学功能方面最 接近于天然蛋白分子。细胞破碎→固液分离→浓缩与初步纯化→高度 纯化→成品加工。为了使疫苗的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。与其他疫苗同时接 种亦未出现相互干扰作用
在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂以防抗原被分解。
微滤 超滤
细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。粗细胞裂解物
用0.2um中空纤维(xiānwéi)柱进行微滤。抗原和大部分 低分子量宿主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被 膜拦截。
滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子 量宿主细胞内含物通过滤膜除去。
第八页，共十二页。
• 生产工艺中采用世界一流的发酵罐，通过全自动控 制，提供酵母菌最优生长条件，发酵后经过细胞破 碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附、洗脱等工序， 再经过疏水层析，可使产品抗原蛋白纯度达99%以 上
• 所有工艺设备可自动清洗、自动灭菌，有效地减少 了种种(zhǒngzhǒng)人为因素的干扰，确保生产稳定和质 量一致性。
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基因工程乙肝疫苗的制备【摘要】基因工程乙肝疫苗是通过构建含有乙肝表面抗原的重组质粒转染酵母细胞，制备乙肝病毒表面的有效蛋白。
本文主要介绍基因工程疫苗--重组酵母乙肝疫苗制备的基本原理和工艺流程，以及乙肝疫苗的纯度分析方法。
【关键词】 乙肝疫苗 重组质粒 工艺流程1.基因工程乙肝疫苗产生背景疫苗是人类目前可以彻底消灭某一疾病的唯一武器，接种疫苗被认为是最有效、最经济的疾病预防手段。
《发展中国家消灭乙型肝炎免疫接种计划实施指南》中指出：“世界上四分之三的人口生活在中或高乙肝流行区，因此，唯一的策略就是有效地减少乙肝的流行，最终消灭乙肝······”世界卫生组织肝炎专家及计划免疫全球咨询组认为：控制全球乙型肝炎及减少死亡的策略是开展大规模的婴儿及学龄前儿童的乙肝疫苗接种。
我国卫生部制定的目标是从92年开始在全国逐步推行乙型肝炎（HB ）计划免疫。
92年全国共生产血源疫苗1500万人份，尚不能满足新生儿接种需要，如考虑其他人群，缺口更大。
为了实现HB 计划目标，进一步为控制全球HB 做出贡献，我们必须大规模提高HB 疫苗的产量和进一步提高质量。
血源HB 疫苗原料为无症状带毒者的HBsAg 阳性血浆。
血源价格昂贵，供应量有限，采集困难。
因此血源疫苗的产量和成本受到原料的限制。
利用基因工程重组微生物细胞表达HBsAg 生产HB 疫苗的技术，原料易得，价廉，适宜进行大规模生产，有可能大幅度降低成本。
2.使用重组酵母的原因和重组酵母构建2.1使用重组酵母的原因使用重组酵母进行乙肝疫苗的大规模生产，有如下几点原因：（1）.酵母对培养基的要求低，价廉易得。
（2）.酵母细胞生长快，故生产率高。
（3）.动物细胞生长慢，容易染菌，对操作要求严。
（4）.酵母系统容易放大，动物细胞系统放大难。
2.2重组酵母构建HBV 只有3200bp ，为双链的DNA,是一个相当小的病毒。
其基因组共有四个ORF ，编码以下一些蛋白：Core 蛋白和pre-core 蛋白，Pol 蛋白，X 蛋白，以及S 蛋白（L 、M 、S ）。
故重组酵母可用以下方法：（1）.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化学合成法直接合成目的基因或者通过鸟枪法克隆目的基因。
用识别相同黏性末端的限制性内切酶将外源DNA 和质粒分子切开。
（切）（2）.用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上，构成DNA重组分子。
（接）（3）.借组细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。
（转）（4）.短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。
（增）（5）.筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的基因工程菌。
（检）3.酵母表达的HBsAg之特性重组酵母表达的HBsAg在没有化学处理的条件下自发地构成平均直径为22nm的球形颗粒。
这些颗粒含有未糖基化的HBsAg多肽和主要由酵母特有的磷脂构成的脂基。
其氨基酸的构成、羟基和氨基酸末端序列分析、质谱仪分析的肽谱等表明，重组酵母忠实地表达和生产了HBsAg。
酵母生产的HBsAg在细胞内以颗粒形式存在，其中的亚单位通过非共价键不紧密地结合在一起。
在细胞外它转变成第二种形式，即单个多肽通过二硫键结合成二聚体，最后二聚体之间形成二硫键，得到二硫键交联的颗粒。
它在表观上、化学性质和免疫性等方面都与血源HBsAg类似。
HBsAg比大部分生物分子要大，但比细胞要小，很适宜用膜分离方法纯化。
HBsAg表现出很强的疏水性，可用硫酸铵或聚乙二醇进行分步沉淀，或用疏水层析纯化。
HBsAg含有大量的二硫键，是其对热稳定的主要原因。
在制备血源疫苗时，可运用长时间保温法以灭活HBV。
但在制备重组HBsAg时没有必要。
可选用更加温和的条件。
HBsAg对蛋白酶的抵抗力很强，可在pH为2的时候耐胰蛋白酶的处理。
HBsAg因其脂含量高，密度比一般蛋白低。
利用其密度特性，可进行梯度离心分离。
4.疫苗的工作原理任何疾病的疫苗都遵循以下免疫原理：（1）.将疫苗注射到人体内，疫苗通常含有已经死亡或者弱化的病毒。
而乙肝疫苗就是一类没有感染能力的病毒蛋白，能引起机体的特异性反应。
（2）.免疫系统识别出体内的外来物质（病毒和细菌），这些外来物质也被称之为抗原。
（3）.一旦发现抗原，免疫系统就分泌出被称为抗体的蛋白质。
这些蛋白质在血液中流动，将抗原杀死以消灭身体感染的病毒（或者与病毒蛋白质特异性结合，使之失去生物活性）。
抗体是由淋巴细胞制造的。
这些细胞也被称为B细胞，它的主要功能是产生能够特异性与抗原结合的抗体。
（4）.人体会储存这些抗体，淋巴细胞也会有记忆这种特殊抗原的功能。
所以再次染病时，它们会及时消灭此种疾病的病毒，然而抗体的针对性很强，所以曾经接种过乙肝疫苗的人，面对其他疾病时仍旧会感染（值得注意的是：当人体感染真正的病毒时，抗体会不停繁殖，直到病毒最终被消灭。
而疫苗会提供数量恰到好处的抗原，以帮助人体完成识别病毒和免疫反应的过程，从而使人体能够对这种病毒免疫）。
5.疫苗制备工艺5.1.菌种制备和发酵用成功构造的基因工程菌进行扩大培养，经过逐级放大至发酵罐。
发酵过程应该具有下列特点：原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机和无机氮源；能容易进行大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产；生物反应过程是以生命体的自动调节方式进行的，多个反应像一个反应一样，在单一设备中进行；生产过程中，通常常温进行，操作温和，不考虑防爆问题；能够高度选择性的进行复杂化合物在特定部分的反应，如氧化、还原、官能团导入；生产过程中考虑防止杂菌的污染。
发酵过程中，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生长和维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡。
可添加诱导剂如乳糖到发酵液中去以诱导可调节启动子的表达。
有人对重组酵母表达的HBsAg 的影响进行过研究，发现在碳源中降低葡萄糖浓度，补充甘油和蔗糖能较明显地改善比活值和HBsAg 的相对浓度。
将发酵前期、中期和后期温度分别控制在27℃、33℃、25℃；发酵从pH4.5开始，逐步上升到pH6；以及维持溶氧浓度在最适水平（70%饱和度），都可以提高重组质粒的稳定性和HBsAg 在发酵液中的积累。
当然，需要根据不同菌种发酵的最适条件、培养基异同、当地条件等各种因素适当对以上数据进行微调，以保证发酵的顺利高效进行。
5.2.分离纯化和纯度测定工艺虽然我们已经有从人血中分离纯化HBsAg 的丰富经验，但由于重组酵母表达的抗原是在细胞内，存在的量相当小，仅占酵母蛋白、核酸和脂的5%不到，酵母细胞和培养基的成分与血浆有很大不同，为了从重组酵母中得到高纯度的抗原，有必要研究、探索新的纯化工艺。
对于血源性乙肝疫苗分离纯化的重点是除去活性污染物或使其失活，对于基因工程乙肝疫苗而言是去除细胞和培养基成分。
下图表示文献报道的国外工业化生产重组酵母乙肝疫苗的工艺路线，可作为技术开发的参考。
工艺1：发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，然后细胞通过高压匀浆机破碎，释放出抗原。
酵母的细胞壁较厚，比大肠杆菌难破碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压力，通过针形阀突然降压到零，使细胞破碎。
在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂以防抗原被分解。
细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。
粗细胞裂解物用0.2um 中空纤维柱进行微滤。
抗原和大部分低分子量宿主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被膜拦截。
滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子量宿主细胞内含物通过滤膜除去。
残留的表面活性剂通过吸附在一种聚苯乙烯小珠上除去。
再用硅胶吸附抗原，用热硼酸缓冲液洗脱。
纯化最后一步是用丁基琼脂糖进行疏水层析。
纯化后的抗原用硫氰酸盐处理以完成二硫键的交联。
纯化后的抗原再与氢氧化铝共沉淀，在共沉淀时，抗原吸附在氢氧化铝上。
除了上述一种工艺外，某些文献中还提到如下两种：工艺2：工艺3：三种工艺大致相同，不同之处在于：工艺2在细胞破碎之后经过二步沉淀和离心除去大部分杂质和所有细胞碎片，然后通过超滤浓缩。
用阴离子交换层析去除DNA 是该工艺的一个关键步骤。
工艺3用吐温80处理破碎细胞，细胞碎片通过离心除去，上清超滤浓缩，用体积排阻层析和离子交换纯化以除去核酸，并进一步做氯化銫梯度等密度离心，然后脱盐。
因HBsAg 的体积大，适宜采用体积排阻层析纯化。
但如果用于大规模生产的话，层析住体积会很大，要求在纯化工艺的最后阶段，对产品进行浓缩，以减小其体积。
用免疫层析也可以分离酵母源HBsAg 。
柱中的抗体是从羊血中纯化来的。
用人血HBsAg 免疫羊，将羊的IgG 通过一根含有血源HBsAg 的亲和层析柱纯化抗HBsAg 抗体。
这种方法，即用一种抗原制备抗体，再用此抗体纯化另一种不同来源的抗原，可保证最后的亲和层析柱不会含有酵母杂质的抗体。
5.3.疫苗纯度的测定乙肝疫苗是通过肌肉注射的方式进入人体系统，为了降低疫苗内杂质含量对人体产生的不良影响，必须进行疫苗的纯度检测。
乙肝疫苗表面抗原的纯度检定是疫苗质量控制的关键手段之一。
目前分析测定重组乙型肝炎疫苗纯度的HPLC 常用方法是应用TSK-G5000PW 分子筛。
中国药品生物制品检定所疫苗二室曾报道应用该系统对Merck 酿酒酵母重组乙肝疫苗和CHO 细胞重组乙肝疫苗进行纯度分析，可获得良好的分离效果。
对重组汉逊酵母乙肝疫苗，现有的HPLC 检测系统应用0.1mol/L DTT 与1:50吐温80等量混合处理后能有效地检测不同类型重组乙肝疫苗表面抗原的纯度。
5.4疫苗的保存疫苗的稳定性较差，一般在2~8℃下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。
在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。
为了使疫苗的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。
这样，疫苗的有效期往往可延长1倍或以上，在室温下其效价的损失亦较慢。
冻干要点是：（1）冷冻，即将疫苗冷冻至共熔点以下。
（2）真空升华，即在真空状态下降水分直接由固态升华为气态。
（3）升温缓慢，即升温的过程尽量缓慢，不使疫苗在任何时间下有融解的情况发生。
（4）冻干好的疫苗应在真空或充氮气后密封保存，使其残余水分保持在3%以下。
这样的疫苗能保持良好的稳定性。
6.结语国内已规模化生产预防用基因乙肝疫苗—重组乙型肝炎疫苗，免疫性强、安全性好、母婴传播阻断率高。
自主研制的国家一类新药治疗性乙肝DNA疫苗已进入临床研究，这是国内首次批准用于人体的DNA疫苗试验；第一个具有完全自主知识产权的治疗用合成肽乙肝疫苗也已经正式进入临床试验阶段。
全国肝炎治疗用药市场规模约200亿元，乙肝疫苗市场容量可维持在4000万人份左右，基因工程乙肝疫苗具有广阔的前景。