基因工程实验指导书2资料
实验指导书-基因工程
生命科学学院《基因工程》实验指导书适用专业生物技术、生物科学二OO 七年八月前言该指导书以基因工程的研究程序为主线，综合了目的基因的分离、克隆，载体的构建等方面的实验内容，在注重专业性和可操作性的前提下突出先进性和系统性。
通过本课程的学习和实践，使学生对基因工程的全过程有系统、明确的认识，达到熟识、理解并掌握DNA 重组实验原理和操作方法，提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为从事生物技术及其相关领域的科学研究工作打下基础。
实验设置内容包括：目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化（设计性实验），农杆菌介导的植物遗传转化（综合性实验），转化植物的表型分析及鉴定等内容（综合性实验）。
本课程的目的是培养高年级本科生及研究生进行基因操作的能力。
教学中，要求调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备，让学生和教师共同讨论理论和实验问题，指导学生分析总结实验结果。
本书可作为高等院校生物技术、生物科学等生命科学各有关专业本科生《基因工程原理与应用》的配套实验教材。
目录1、实验一：目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化···································32、实验二：农杆菌介导的植物遗传转化·······································································83、实验三：转化植物的表型分析及鉴定·······································································104、实验报告基本内容要求····························································································125、实验报告格式··········································································································13实验一目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化实验学时：7实验类型：综合实验要求：必修一、实验目的在学习分子生物学课程，并熟练掌握分子生物学实验操作技能的基础上，综合运用PCR、细菌感受台细胞制备、转化等手段，完成DNA体外扩增、扩增片段的连接、转化全过程，使同学掌握基因扩增和载体的基本方法和思路，培养独立设计实验并进行操作的能力，为从事基因工程相关研究奠定基础。
基因工程试验指导
《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。
在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。
二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。
转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。
同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。
三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。
含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。
基因工程实验-biochemlab
实验二 基因组总ＤＮＡ提取
一、实验目的
掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。
生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。
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五、思考题
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如果实验对照组本不该长菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种想象？
01
实验目的
02
掌握重组质粒的转化方法
03
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实验六 重组质粒的转化
转化是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。
化学转化法 利用Cacl2处理感受态受体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90s，热休克后，是受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够蛋白质，以便能在含抗生素的平板上生长菌落。
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ＤＮＡ重组、转化 ＭＨＣ与pMD18-T连接 DH5a感受态细胞制备
转化、平板涂布、培养
筛选与鉴定 抗生素抗性筛选 挑单菌落培养 提取质粒 质粒酶切、电泳检测
2.微量移液器的使用
将微量移液器按钮轻轻压在第一挡 垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。 等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过 平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、 提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过 然后按吸头弹射器除去吸头
基因工程实验技术操作手册
基因工程实验技术操作手册一、实验前准备在进行基因工程实验前，需要做好以下准备工作：1. 实验室环境准备：确保实验室设备完好，工作台面干净整洁，通风良好。
2. 实验材料准备：准备所需的试剂、培养基、细胞培养物等实验材料，并按照要求进行储存和标识。
3. 实验仪器准备：检查并确保实验所需的仪器设备正常运作，如PCR仪、电泳仪等。
4. 个人防护准备：佩戴实验室必备的个人防护用品，如实验手套、实验服、护目镜等。
二、实验步骤1. DNA提取a. 准备待提取的生物样本，如细菌、植物组织等。
b. 使用DNA提取试剂盒按照说明书进行提取步骤，如细胞破碎、蛋白质沉淀等。
c. 最后得到纯净的DNA样品，可用于后续的实验操作。
2. PCR扩增a. 准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物、酶和缓冲液等。
b. 将反应体系加入PCR仪中，设置好扩增程序和参数。
c. 进行PCR扩增反应，得到所需的目标DNA片段。
3. DNA连接a. 准备连接试剂盒，包括连接酶、连接缓冲液等。
b. 将目标DNA片段和连接载体按照比例混合，加入连接试剂中。
c. 进行连接反应，使目标DNA片段与载体DNA连接成一个完整的质粒。
4. 转化a. 准备感受态细胞，如大肠杆菌等。
b. 将连接后的质粒DNA加入感受态细胞中，进行热激转化或电转化。
c. 将转化后的细胞涂布在含有适当抗生素的培养基上，培养过夜。
5. 筛选与鉴定a. 从培养基中挑取菌落，进行PCR扩增或酶切检测，筛选含有目标基因的菌落。
b. 对筛选出的菌落进行测序，验证目标基因的正确性。
c. 进一步进行功能鉴定，如蛋白表达、酶活性等实验。
三、实验注意事项1. 操作时要严格遵守实验室安全操作规程，注意个人防护和废弃物处理。
2. 实验材料的储存和标识要清晰明确，防止混淆和污染。
3. 仪器设备的操作要正确，遵循使用说明书，避免操作失误和设备损坏。
4. 实验步骤中的温度、时间等参数要按照要求进行调整和控制，确保实验结果的准确性。
基因工程实习指导书-0801081
基因工程实习指导书适用专业：生物技术周数：2周学分：2 编写人：陈英审定人：1实习目的植物遗传转化(genetic transformation)是指将外源基因导入植物细胞，获得转基因植物的技术。
自1983年第一株转基因烟草问世以来，二十多年来，转基因技术已得到长足的发展。
植物遗传转化方法是植物遗传转化的重要环节，迄今为止已建立了多种植物遗传转化体系和转基因技术。
归纳起来，包括农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电击法、显微注射法等，其中农杆菌介导法是目前双子叶植物转基因最常用的方法。
通过本实习，学生进一步学习植物遗传转化的基本原理，了解植物遗传转化与检测的流程，掌握多种以根癌农杆菌位介导的植物遗传转化方法和技术。
2实习内容实验一拟南芥花序浸润转化拟南芥是自花授粉植物，具有高度纯合、植株小、生长周期短（从发芽到开花不超过6周）、结籽多和生活能力强的优势。
用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。
所以拟南芥是进行遗传学研究的极好材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”。
一、实验目的通过本实验，进一步学习农杆菌介导植物遗传转化的基本原理，掌握拟南芥花序浸润法遗传转化的流程。
二、实验原理农杆菌介导的基因转化利用的是一种能够实现DNA转移和整合的天然系统，即根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒。
Ti质粒经过改造，使之带有T-DNA的左右边界序列，左右边界序列间是多克隆位点，便于目的基因的插入。
将构建好的质粒转入农杆菌，然后再转入植物，目的基因通过T-DNA序列与植物受体细胞染色体DNA同源序列进行同源重组而整合。
通过选择标记筛选及分子检测，既可获得转基因植株。
三、实验材料拟南芥四、仪器设备1）剪刀、培养皿、三角烧瓶（高压灭菌，烘干）2）50ml离心管、2ml离心管、1ml枪头、200μl枪头（高压灭菌，烘干）3）超净工作台、摇床、离心机。
五、实验步骤1. 拟南芥种植：把种子悬浮在0.05% 琼脂糖中，黑暗中，4℃，放置3天，打破休眠。
基因工程实验手册
《本科实验教学》基因工程实验指导贵州大学农业生物工程研究院2015年4月实验一DNA片断的连接、转化及酶切鉴定一、实验原理：实验所用载体为Promega公司T载体pGEM®-T Easy Vector，特点为在载体中存在两个T末端。
使用LA Taq进行扩增得到的大部分PCR产物3’端附有一个“A”碱基。
T4噬菌体DNA连接酶可在体外使外源DNA片段和线状质粒载体之间形成新的3'，5'磷酸二酯键。
PCR胶回收产物游离A末端与载体的T末端可互补配对并在连接酶作用下连接形成重组质粒。
转化指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA分子导入受体细胞体内，使法），其原理之获得新的遗传特性的一种方法。
大肠杆菌转化常用化学法（CaCl2溶液致敏处理，就可以成为高是培养至对数生长期的细菌在0℃经过低渗CaCl2效的感受态细胞，这种感受态细胞与质粒混匀置于0℃30min，混合物中的DNA 形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，再经42℃短时热激处理，促使质粒进入细胞实现转化，利用质粒上的遗传选择标记在LB平板上进行初步筛选转化菌落。
蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补，抗生素基因等（本实验中使用的T载体pGEM®-T Easy Vector本身具有Amp抗性）。
现在使用的许多载体都有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。
因此，宿主和质粒编码的片段虽没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样，β-半乳糖苷酶基因在缺失近操纵区段的宿主细胞与带有完整近操纵区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
基因工程实验指导书
实验项目重组质粒DNA的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳检测实验项目类型：综合性所属课程名称：《基因工程》实验计划学时：8学时一、实验目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。
学会用酶切法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。
二、实验原理1、提取质粒原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。
在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。
尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
2、质粒DNA的酶切鉴定原理利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。
再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。
三、实验材料与仪器1、仪器超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
2、试剂pGEM-T-AT8载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液(溶液II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。
EcoR I，Xba I，Sac I ，Xho I，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲四、操作步骤1、实验准备氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20︒C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200μL 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121︒C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd water至100ml），70%乙醇（-20︒C 保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /mL RNase A （RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121︒C 30min）。
基因工程实验操作作业指导书
基因工程实验操作作业指导书前言：在进行基因工程实验操作之前，请确保已经具备相应的实验知识和技能，并遵守实验室的安全规定。
本实验操作指导书将详细介绍基因工程实验的步骤和注意事项，以确保实验顺利进行。
一、实验前准备1.确认实验的目的和所需材料：确定需要进行的基因工程实验目标，并准备所需的各种试剂、细胞培养物和实验器材。
2.实验室安全措施：穿戴实验室要求的个人防护装备，遵守实验室的规章制度。
确保实验室电源和排风系统正常运行。
二、实验步骤1.基因克隆a) DNA提取：从源生物体中提取DNA样本，利用适当的提取方法将DNA纯化并获得高质量的DNA。
b) PCR扩增：设计引物，进行PCR扩增反应，使目标基因扩增到所需的浓度。
c) 酶切：使用限制性内切酶对目标基因和载体进行酶切，创建黏性末端适配体。
d) 连接：将目标基因与载体连接，形成重组DNA。
e) 转化：将重组DNA转化到适宜的宿主细胞中，使其能够被宿主细胞内的酶复制和表达。
2.细胞培养a) 培养基准备：根据实验需求制备适宜的培养基。
b) 细胞传代：将宿主细胞进行传代，以保持活性和生长状态。
c) 质粒提取：从转化后的细菌中提取质粒DNA，作为后续实验的样本。
d) 菌液预处理：将细菌培养物进行适当的处理，如离心、洗涤等。
3.基因表达a) 表达培养条件控制：设置适宜的温度、培养时间和培养基成分，以获得高效的基因表达。
b) 转录与翻译：利用适当的启动子和加入适量的诱导剂，实现基因转录和翻译。
c) 蛋白质纯化：根据需要，对表达的蛋白质进行纯化，确保其纯度和活性。
4.实验结果分析a) 凝胶电泳：使用凝胶电泳分析方法，判断基因工程实验的成功与否。
b) 荧光检测：通过荧光标记的方法检测基因表达程度。
c) 其他分析方法：根据实验目的及需求，选择适当的分析方法进行结果分析。
三、实验操作注意事项1.实验室安全：佩戴手套、实验外套、护目镜等个人防护装备，避免实验材料和试剂对人体造成伤害。
基因工程实验指导
1） 化学法(热击法)；使用化学试剂（如 CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将 载体 DNA 分子导入受体细胞；
2） 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载 体 DNA 分子导入受体细胞。
进入细胞的 DNA 分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗 传性状。将经过转化的细胞在选择培养基中培养，即可筛选出转化体(transformant)，即带 有异源 DNA 分子的受体细胞。
a互补现象：许多载体都带有一个 LacZ基因的调控序列和头 146 个氨基酸的编码信息， 编码 a互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型 b半乳糖苷酶实现互补（ a互补）。当这种 载体转入可编码 b－半乳糖苷酶 C 端部分序列的宿主细胞后，在异丙基bD 硫代半乳糖苷 （IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可 以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为 a互补现象。
3
实验二 转化子的筛选及初步鉴定
1 实验目的 学习掌握 a互补的原理，掌握根据蓝/白斑选择重组克隆的方法。
2 实验原理 2.1 重组子的筛选
载体与目的片段连接后，连接混合物中除了目的重组 DNA 外，还含有以下成分： 1． 未连接的载体分子 2． 未连接的 DNA 片段 3． 载体的自连产物 4． 含有错误插入片段的重组 DNA 分子
虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于 连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。
鉴定重组子的方法常用的有 a互补，小规模制备质粒 DNA 进行酶切分析、PCR 以及 杂交筛选等。最常用的方法是小规模制备质粒 DNA 进行酶切分析，对于带有 LacZ 基因的 载体还可以结合 a互补现象来筛选鉴定。
基因工程实验课(2) 生化实验PPT技术文档
0.7
20000—1000
1.4
6000—300
3-18
聚丙烯酰胺凝胶电泳
优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。
琼脂糖凝胶电泳：1000—50000bp
聚丙烯酰胺凝胶电泳：1—1000bp
聚丙烯酰胺凝胶浓度 （%）
4.0 10.0 20.0
分离DNA片断大小 （bp）
1000—100 500—25 50—1
基因工程实验课（2）
康康、吉坤美、钱民先、徐亚菲
基因工程流程
第一次课程： 1. 质粒的转化 2. 重组菌的筛选 3. 挑取单克隆培养
第二次课程： 1. 质粒的提取 2. 质粒的浓度测定 3. 质粒的电泳 4. 质粒的酶切
基因工程实验报告重要数据
1. 挑单克隆后进行液体培养的培养物； 2. RFP重组菌液在IPTG/Amp LB平板上画图案； 3. 质粒转实验化中涂平板后的培养结果； 4. 琼糖脂凝胶电泳图谱； 5. DNA浓度测定表。
牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；
3-9
表1：酶切反应体系
酶切反应体系
组分
体积
RFP质粒 (~500 ng) 10 x buffer K EcoRI BamHI H2O
5 l 2 l 1.5 l 1.5 l 10 l
充分混匀，37℃1~2小时，加入2.5 l 10x Loading buffer 终止酶切，进行1 % Agarose电泳检测。
琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。
浓度高凝胶的分辨力 空隙大小决定其分辨分子大小的能力。
空隙小，分辨率高： 小分子较易通过，而大分子难通过；
空隙大，分辨率低： 大小分子几乎以同等速率通过。
琼脂糖的浓度（%） 分离DNA的片断大小（bp）
基因工程2ppt课件
Bam H I 375 B anl 474
B anl 488 Sphl 565 S all,A ccl,H in cll 6 5 0
tet r X m alll 938 N rul 975
B spM I 1063
3000 ori
B sm l 1353 S ty l 1369 Aval 1424 B all 1445
➢ 在基因导入受体时：将目 的片段转移到受体细胞中
5.
细菌人工染色体(克隆/表达)；
并进行使之表达——转化 6. 酵母人工染色体(克隆/表达)； 载体或表达载体。
7. Ti质粒及其衍生载体(转化)。
.
载体的要求:
作为载体，应该具有以下一些性能：A、复制：具 有能在受体细胞中复制的复制起点，基因工程的目的 是要得到基因的无性繁殖系，并且要求得到最大量的 某一基因或基因产物，因此一般要求用属于松弛型的 质粒作为载体。细菌质粒ColE1是一种常用的载体； B、选择性标记：一般情况下，所要扩增的基因不便 于选择，所以作为载体要求具有选择标记。ColE1对 于大肠肝菌素E1的免疫性却不是一个理想的标记。R 质粒具有最适宜于作为选择性标记的多种抗性基因， 但不很安全；
ColE1 6.5kb
松弛型
EcoRI
PstI
HincII
B
a
m A
H p
rI
pSF2124 11.33kb
EcoRI EcoRI
EcoRI HindIII
BamHI
pMB9 5.4kb
S T
a c
lr
I
转 Apr至 pMB9
HincII
P
s
t A
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基因工程》课程实验指导书
《基因工程》课程实验指导书生物技术专业黄淑坚黄良宗编写佛山科学技术学院2005年12月目录前言 (Ⅱ)实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR） (1)实验二DNA目的片段的回收与DNA的体外连接 (7)实验三重组DNA的转化 (10)实验四重组DNA的鉴定 (13)实验五外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 (16)实验六表达产物的检测与分析——SDS-PAGE (18)附录 (22)参考文献 (34)前言基因工程学是以生物化学、分子生物学和分子遗传学等学科为基础而发展起来的一门新兴技术学科，自DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展，并广泛应用于医学、农业、工业、水产、环保等行业。
本实验指导书在在方法上，力求可行性、实用性，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。
由于基因工程的发展异常迅速，加之编写人员水平有限，难免有疏漏与错误，敬请各位师生批评指正。
编者2005年12月实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）一、目的和要求了解反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）基本原理和实验应用，掌握RT-PCR 反应的基本技术。
二、实验内容RT-PCR扩增猪流感病毒M2基因部分片段。
三、仪器、设备和实验准备1、仪器恒温水浴槽、移液枪、EP管、PCR管、超净工作台、PCR仪、电泳仪。
2、试剂反转录酶、RNA酶抑制剂（RNase Inhibitor）、流感病毒RNA、随机引物、流感病毒M2基因PCR引物、dNTP、Taq酶。
3、实验准备用RNA抽提试剂盒抽提猪流感病毒RNA。
四、实验原理RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。
基因工程实验指导
《分子生物学大（综合）实验》实验指导不同生长期仿刺参性腺组织中基因差异性表达的研究幼参的性腺颜色一般为灰褐色，而成熟期，雌性生殖腺为橘红色，雄性为乳白色或浅乳黄色。
一、TRIZOL试剂盒提取RNA取新鲜健康的体长为3-5 cm 的幼参与12-15 cm 的成熟参，用无菌海水清洗其体表，置于无菌大培养皿上。
解剖刺参，取出其性腺。
以幼参的性腺提取物为对照组，成熟刺参的性腺提取物为试验组。
1 匀浆每50~100mg组织，加1ml的TRIZOL。
将样品放在干净已灭菌的研钵中，倒入液氮，迅速研磨样品，在研钵中直接加入TRIZOL。
样品的体积不要超过TRIZOL试剂体积的10%。
再用Tip头吸到EP管中。
2 离心匀浆后，2~8℃，12 000r/min，离心10 min。
取上清，去沉淀。
若上清顶层有一层脂肪，应去除。
将上清液移到干净的EP管中，添加氯仿，相分离。
3分离上清液在15~30℃下温育5 min，彻底去除核蛋白复合物。
每1ml的TRIZOL试剂加0.2ml 的氯仿，盖紧EP管盖。
用手剧烈震荡15sec，15~30℃下温育2~3 min。
2~8℃下，不超过12 000r/min, 离心15 min。
离心后，复合物分离出从下到上依次为：一较低的红色区、酚氯仿相、一个分界面和无色上清水相。
RNA保留在无色上清水相中，水相体积大约是用于匀浆的TRIZOL试剂体积的60%。
4 RNA沉淀将上清液移到干净的EP管中，通过混合异丙醇使RNA沉淀。
在匀浆初始使用的TRIZOL 试剂量，每1ml的TRIZOL，加入0.5ml的异丙醇。
混匀以沉淀RNA。
15~30℃下温育10 min。
2~8℃下，不超过12 000 r/min，离心10 min。
RNA沉淀在离心前不可见，离心后形成一胶状颗粒，粘附在管的侧面和底部5 RNA的洗涤去掉上清，用75%乙醇洗沉淀。
每1ml的TRIZOL（开始时），加入1ml 75%的乙醇，混匀样品，7 500 r/min，2~8℃，离心5 min。
基因工程实验报告资料
实验报告实验项目名称：基因工程综合实验所属课程名称：基因工程原理班级：12生物工程3班学号：201230620312姓名：李杰锋指导老师：徐学锋目录0.摘要 (1)1.前言 (1)2.实验材料和仪器 (2)2.1 实验材料 (2)2.2 实验仪器 (2)3.实验试剂 (2)3.1DNA提取所需试剂 (2)3.2 PCR实验所需试剂 (2)3.3 双酶切实验所需试剂 (2)4.实验步骤 (3)4.1 质粒DNA提取 (3)4.2 聚合酶链式反应（PCR） (3)4.3 质粒DNA的双酶切分析 (4)4.4 琼脂糖凝胶制备 (4)5.实验结果与分析 (5)5.1质粒DNA提取所得凝胶电泳结果 (5)5.2 PCR扩增实验结果 (5)5.3质粒DNA的双酶切分析结果 (6)摘要：本实验包括质粒DNA的提取、DNA的凝胶电泳、质粒DNA中靶基因的酶切分析及质粒DNA中重组进的靶DNA序列的PCR扩增。
通过本综合实验，进一步理解质粒DNA的提取原理、凝胶电泳中DNA分离的机理、限制性内切酶的工作原理及PCR是如何实现DNA扩增的，也掌握了DNA的提取技术、凝胶电泳技术、DNA酶切分析技术及靶基因的体外快速扩增技术，进而了解实验中出现的现象并学会分析与解决实验中出现的有关问题。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA或RNA的地方。
关键词：凝胶电泳限制线内切酶DNA质粒1 前言本次实验对象为含有重组了1kb DNA片段的PET32.a表达质粒。
该表达质粒中长度约6kb。
首先采用离心破碎法破碎细胞，再使用碱裂解法提取质粒DNA。
基因工程_2
转基因大肠杆菌 (能分泌胰岛素)
培育转基因大肠杆菌的关键步骤：
1.ONE
胰岛素基 因从人体 细胞内提 取出来
2.TWO
胰岛素基 因与运载 体DNA连 接
3.THREE
胰岛素基因 导入受体 (大肠杆菌) 细胞
基因的“剪刀” 基因的“针线” 基因的运载体
二、基因操作的工具
1、 基因的“剪刀”——限制性核酸内切酶
1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3）具有某些标记基因，便于进行筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。
质粒可作为有何特点？
1、细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的 小型环状DNA分子；
2、质粒的存在对宿主细胞无影响； 3、质粒的复制只能在宿主细胞内完成。
基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经 济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化 诊断新技术。
基因治疗——用正常的基因取代或修补病人细
胞中有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的
1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺 乏症的4岁女孩进行基因治疗。这个4岁女孩由 于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天 性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。 他们将这个女孩的白血球进行基因改造，使有 缺陷的基因被健康的基因替代，然后把含正常 白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中。 在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗， 同时也接受酶治疗。后来，她的免疫功能日趋 健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活， 并进入普通小学上学。
⑵ 环境污染治理： 基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分
解多种污染环境的物质。
通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类， 用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解 石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化 汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。
基因工程实验报告
基因工程实验报告指导老师：* * *学号：2007083*****姓名：* * *班级：07生物技术班海南师范大学生命科学学院07级2010-10-25实验一植物总DNA的提取、纯化实验目的：掌握从植物的组织（细胞）中提取DNA的方法实验原理：十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物。
在高盐浓度条件下，核酸以稳定形式与去污剂CTAB络合于溶液中，当降低溶液浓度到一定程度时，CTAB与核酸的复合物从溶液中沉淀下来，通过离心就可将该复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB溶于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB溶于乙醇中。
仪器、材料与试剂主要仪器：水浴锅、离心机、研钵、涡旋仪主要试剂和材料：CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）裂解液：2%CTAB（W/V）、20 mmol EDTA(pH8.0)、100 mmol Tris-HCl (pH8.0)、1.4 mol NaCl氯仿：异戊醇（24：1）。
异丙醇，无水乙醇。
TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA实验步骤1. 取2g左右的嫩叶子放入预冷的研磨中，第一次加入较多的液氮，开始先慢慢磨开后研磨中待液氮量较少时快速磨动，如发现液氮挥发完迅速加入液氮（加入时动作要轻，防止粉末溅起），重复两次。
2. 将粉末加入预冷1.5mlEP管中（约1/3）后，加入事先700ul65℃水浴的2%CTAB和30ul室温β-巯基乙醇（剧毒），轻轻摇动混匀。
放入65℃水中水浴40min，每10min取出震荡使沉淀散开。
3. 取出后冷却至室温，加入氯仿/异戊醇（24：1，V/V）至满管（加药品千万注意别让药品污染桌面及手上，有必要可带面罩），剧烈震荡后12000rpm离心10min，取上清加入500µl 氯仿/异戊醇12000rpm 离心10min。
4. 取上清至预冷600µl 异丙醇和20µl 3M KAc中置于-20℃冰箱中15-20min。
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实验一、质粒DN A勺提取实验二、细菌基因组的提取实验三DNA的限制性内切酶解及电泳实验四、PCR基因扩增及电泳实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验一、质粒DNA勺提取质粒是一种双链的共价闭合环状的DNA分子,是细胞染色体外能够稳定遗传的因子。
在基因克隆的实验中，要把一个有用的外源基因通过重组DN敍术,送进生物细胞中去繁殖和表达。
实现携带外源基因进入受体细胞的工具被称为载体，细菌质粒是基因工程中常用的载体之一。
作为基因工程的载体需具备下列条件：（1）是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；3）载体DNAS上有一至数个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入;（4）载体具有选择的遗传标记,如抗氨苄青霉素基因（Amp,抗新霉素基因（Neo R）等,以此判断载体是否进入受体细胞，并据此将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来细菌质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型和松驰控制型。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，与染色体复制相关联，每个细胞只含有一个或几个质粒分子，如ColEI 质粒（含有产生大肠杆菌毒素EI基因）,PBR322就是ColEI衍生的质粒。
后者在整个细胞周期中随时可以复制,具多拷贝,一般在120个以上。
本实验分离纯化的质粒为PQE30为高拷贝质粒。
通过本实验学习了解质粒DNA勺特点,掌握碱性SDSfe速法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA.、实验原理所有分离质粒DNA勺方法都含有以下3个步骤:①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA勺纯化。
本实验以碱性SD缺速法小量制备PQE3质粒。
碱裂解法对于以前应用的所有的大肠杆菌均卓有成效。
该方法的特点是，加溶菌酶可破坏菌体细胞壁（小量制备可省略不用溶菌酶）,去污剂SD测使细胞壁裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNAE 性，但闭环质粒DNAI由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。
当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和）,质粒DN链迅速得到准确配置,重新形成完全天然的超螺旋分子。
细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀法或氯化铯一溴化乙锭梯度平衡法。
环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时,称之为共价闭合环状DNA(CCCDNA这样的DNAI常呈现超螺旋SC勾型；如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNAQCDNA此即0C勾型；若质粒DNA5过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子(LDNA),通称L构型。
质粒DNAM一般在106〜107之间,常以kb表示(Ikb双链DNA=6.6X 105),如质粒pUC1的Mr为1.8 X 106(2.69kb)。
在琼脂糖凝胶电泳中,不同构型的同一种质粒DNA尽管M相同,仍具有不同的电泳迁移率,其中走在最前沿的是scDNA,其后依次为LDNA和ocDNA仪器、材料与试剂(一)仪器1.恒温培养箱2.恒温摇床3.台式离心机4.高压灭菌锅(二)材料1.葡萄糖2.三羟甲基氨基甲烷(Tris)3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.氢氧化钠5.十二烷基硫酸钠(SDS)6.乙酸钾7.冰乙酸8.氯仿9.乙醇10. RNA 酶 11. 氨苄青霉素 12. 蔗糖 13. 溴酚蓝 14. 酚 15. 8—羟基喹琳 16. 「巯基乙醇 17. 盐酸(HCI)18. 含pUC1质粒的大肠杆菌 19. 吸头、小指管(三) 试剂 1. 溶液I三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris-HCL(pH8.0)2溶液II0.4mol/LNaOH,2%SDS 用前等体积混合 3. 溶液山5mol/L 乙酸钾 60 mL28.5 mL4. TE 缓冲液l0 mmol/L Tris-HCI1 mmol/L EDTA( pH8.0) 5 70%乙醇(放-20 C 冰箱中,用后即放回) 6. 、膜RNA#将RNAI 溶于 10mmol/LTris-HCI(pH7.5)、15mmol/LNaC 中,配成 10mg/mLl 勺浓度，于 100C 加热15min,缓慢冷却至室温,保存于-20 C 。
50 mmol/L葡萄糖5 mmol/L 10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)冰乙酸11.5 mL7.终止液:40%蔗糖、0.25%溴酚兰8.酚。
实验步骤1.将2m含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中，接入上述的含pQE3质粒的大肠杆菌，37C振荡培养过夜。
2.取1.5mL培养物倒入微量离心管中10000r/min离心2min.3.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4.将细菌沉淀悬浮于100卩L溶液I中，充分混匀室温放置10min。
5.加200卩L溶液11（新鲜配制），盖紧管口，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6.加入150 uL溶液山（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上15 min。
7.12000r/min离心15min将上清转移到另一离心管中。
8.向上清中加人等体积酚：氯仿（1:1）（去蛋白）,反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9.向上清加入2倍体积乙醇,混匀后室温放置5〜10min. 12000r/min，离心5min.倒去上清液,把离合管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
10.加入20卩TE缓冲液,使DNAS全溶解,-4 C保存。
四实验安排本实验一天内可做完。
实验结果可结合下一个实验一起观察。
五、讨论1.细胞的裂解作用是分离质粒DN康验操作的关键步骤。
通常是加入溶菌酶或SD睐促使大肠杆菌细胞裂解的。
如果寄主细胞没有完全裂解，就会显著降低质粒DNA勺回收率。
理想的状况是使每一个细胞都充分破裂到能使质粒DNA顺利溢出，而又没有污染过多的染色体分子。
2.提取过程中，除规定的实验条件外，应尽量保持低温，避免过酸过碱，操作中手法要温和，防止机械剪切，尽可能避免脱氧核糖核酸酶对质粒DNA勺降解和破坏。
3.采用酚/氯仿去除蛋白的效果较单独使用酚或氯仿好。
一般来讲，要将蛋白质尽量除干净，需多次抽提，本实验虽只抽提一次，已能达到实验要求。
注意在吸取上层水相时勿吸入下层有机相混于其中。
4.乙醇沉淀质粒DNA是最常用的沉淀方法,通常采用冷乙醇（无水乙醇贮于-20 C）,沉淀条件为-20 C、1h。
因本实验为微量快速,室温下数分钟DNA卩可沉淀,虽然DNA量少，但纯度相对高（因为低温长时间杂质也一并沉淀下来）,有利于以后的酶切及电泳结果。
沉淀方法也可用异丙醇,只需0.54倍体积常温下即可将DNA完全沉淀出来,这对于大体积的质粒DN航淀十分有效。
但缺点是常将盐等亦同时沉淀出来,因此需要用70聽醇很好地洗涤。
一般来讲广泛应用的沉淀试剂还是乙醇。
实验三DNA的限制性内切酶解及电泳（参考酶使用说明书）一、实验原理DNA的限制性内切酶酶切技术是分子克隆和基因操作中最为基本和重要的方法之一。
限制性核酸内切酶，简称限制性内切酶、限制酶或内切酶，是一类能识别双链DN分子中特异核苷酸序列的DN AK解酶,主要存在于原核细胞中。
限制性内切酶有I、n、m、三类,其中第II类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶，其基本特性如下：专一性地识别并切割特定的核苷酸序列,例如:EcoRI酶的识别与切割序列为：5'……GAATTC …3'3'……CTTAAG …5'2.识别的核苷酸数目多为4〜6bp长度范围，少数酶能识别更长的碱基序列，如8〜13bP。
3.识别序列大多数为二重对称,或称为回文序列。
少数酶酶切后产生带平末端的DN姑段，如HpaII、Alu I和PvuII等，但大多数酶切割产生的片段具有凸出的粘性末端，如EcoRI酶切后产生5F-P粘性末端,而PstI则产生3'-0H粘性末端。
4.有的不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割位点也相同，这些酶称为同裂酶或异源同工酶，例如Hpall和MspI。
有的限制性内切酶识别位点不同，但对DNAn割后能产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶，如BamHI BglII、Mbol、XhoII等。
5.限制性内切酶一般都以镁离子为唯一的辅助因子，并要求有一定的盐离子浓度、酸碱度和温度条件。
限制性内切酶主要用于基因组DNA勺片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。
根据酶切目的和要求不同，可采用单酶切、双酶切和部分酶切等不同的方法。
根据酶切反应的体积不同，又可分为小量酶切反应和大量酶切反应等。
一般情况下，小量酶切反应用于质粒等的酶切鉴定，体积为20卩L,大量酶切反应用于制备目的基因片段,体积为50〜100卩L。
本实验安排的是EcoRI对质粒DNA勺小量酶切、Hind m 和Sall 对质粒DNA勺双酶切以及Sau3AI对真核细胞基因组DNA勺部分酶切。
仪器、材料与试剂（一）仪器高速离心机，冷冻离心机，水浴锅,稳压电泳仪，电泳槽,手提式紫外检测仪，紫外检测仪，EP管, 吸嘴,微量进样器,烧杯,量筒,塑料手套,慑子,剪刀,三角瓶。
（二）试剂（1）EcoRI限制性内切酶（附10X酶切缓冲液）。
⑵HindHI 限制性内切酶（附10X酶切缓冲液）。
⑶Nrul限制性内切酶（附10X酶切缓冲液）。
⑷Sau 3AI限制性内切酶（附10X酶切缓冲液）。
（5）:DNA勺Hindlll酶切样品，作为相对分子质量标准。
（6）无菌水：量取50mLt蒸水于100ml三角瓶中,1.034 X 105Pa灭菌20mino分装于几只灭菌过的EP管中,贮存-20 C备用。
（7） 0.2%溴酚蓝、50淞糖上样缓冲液。
（8） 1mg/mL 溴化乙锭溶液。
（9） 电泳缓冲液。
（10） 琼脂糖。
（三）材料纯化的PCMV-M 质粒DNA实验步骤（参考酶使用说明书）（一） P CMV-M 质粒DNA 勺EcoRI 小量酶解1. 在无菌Ep 管中用微量进样器依次加入下列试剂无菌水EcoRI10X 缓冲液 P BR32质粒 DNAEcoRI 限制性内切酶 总体积 2. 离心2s,收集并混匀反应液。
3.37 r 水浴 1.5 〜2h 。
4. 取出Ep 管,吸取1〜2卩L 进行电泳分析，以DNA HindIII 酶切标准相对分子质量为对照，电泳 鉴定DNA#解效果。
如酶解不完全，可继续37C 水浴,或加入适量限制性内切酶后继续反应。