糖苷酶及其抑制剂的研究

糖苷酶及其抑制剂的研

究

Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998

糖苷酶及其抑制剂的研究

摘要：糖苷酶是生命体正常运转的关键性酶，糖苷酶抑制剂

可抑制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，因此对一些

糖代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值。本

文研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶、β－葡萄糖苷酶以及蔗

糖酶的抑制剂。重点研究了β－半乳糖苷酶的分子结构和活性

基团，并从结构出发筛选其抑制剂，发现此酶的抑制剂种类

较少且抑制活性较低。本实验采用混合交叉筛选法筛选了多

种金属离子和氨基酸对β－半乳糖苷酶的抑制作用，同时也筛

选了天然产物和合成化合物。

关键词：糖苷酶β－半乳糖苷酶β－葡萄糖苷酶蔗糖酶抑制剂的筛选混合交叉法

1、前言

糖苷酶和糖基转移酶不仅参与了体内碳水化合物的消化，而且是糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪酶，它对糖蛋白中寡糖链的形成极为重要；糖链的组成与结构是糖蛋白特异生物功能的识别

部位，因此糖苷酶活性对糖蛋白生物合成有关键作用，而后者又涉

及到免疫反应、神经细胞的分化、肿瘤的转移以及病毒和细菌的感染. 因此, 糖苷酶不仅是生命体正常运转的关键性酶,同时又是许多疾病的相关酶. 与病毒感染、癌症及一系列新陈代谢紊乱性疾病如

糖尿病、肥胖病有关。由于糖苷酶重要的生物学意义，糖苷酶抑制

剂的研究也引起了人们的极大兴趣。

糖苷酶抑制剂即是可抑制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，抑制淀粉、麦芽糖、蔗糖转变成单糖；影响糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪；所以糖苷酶抑制剂不但对一些糖代谢紊乱性

疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值[1] ，而且可作为抗AIDS病毒[2]、抗鼠白血病毒[3]的潜在治疗试剂。

本论文重点研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶

β－半乳糖苷酶（β－galactosidase）又称β－D－半乳糖苷水解酶，（β－D－galactosid- -e galacto-hydrolase ,EC.3.2.1.23）,商品名为乳糖酶（Lactase），它广泛存在于豆类及其他各种动植物体内和微生物中。它能够催化β－半乳糖苷化合物中的β－半乳糖苷键发生水解，还具有转半乳糖苷的作用。由于它具有糖苷键结构特

异性，可作为乳糖降解和双糖合成催化剂[4,5]，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基.引起血型转化等生理功能[6,7]而受到人们广

泛关注，成为生物化学和酶催化化学的重要研究课题。

β－半乳糖苷酶的应用有着长远的历史，最初在食品工业中用来降解乳糖含量以满足乳糖不适症患者的需要，然而随着生物技术的发展，它越来越应用于基因工程、蛋白质工程和疾病诊断方面。

将β - 半乳糖苷酶与人体胞外淀粉状蛋白前体融合形成融合蛋白, 可作为Alzheimer 病的免疫源, 并进一步制备其单克隆抗体[8]。还有报道将β - 半乳糖苷酶作为一种辅蛋白, 用作猫白血病毒gp70 的疫苗[9]。

在诊断方面, 将抗菌性HIV 病毒基因与β - 半乳糖苷酶基因LacZ重组后作为定量HIV利用循环的早期抑制作用, 并预测化合物抗HIV的活性工具。同时，近年来β－半乳糖苷酶基因被越来越频繁的用于转基因治疗方面，β－半乳糖苷酶基因作为报告基因，通过检测β－半乳糖苷酶的表达情况，研究转基因治疗[10]。

在环境检测方面, 大肠杆菌的β - 半乳糖苷酶活性检测可快速分析浴场和渔场地区水体受排泄物污染程度。

由于β－半乳糖苷酶的广泛应用和重要的临床价值，人们对此酶的基因进行了深入的研究，通过众多学者的努力，目前β－半乳糖苷酶基因库已基本建立并将日趋完善。但是，对于此酶的抑制剂研究还很少，目前文献中所报道的研究酶和抑制剂相互作用的方法，基本上是用单一的竞争性或非竞争性抑制剂与酶作用，通过动力学研究或用现代仪器分析技术进行表征，获得有关

酶的结构或催化机制的信息。本实验就从酶的结构出发，探讨研究并大量筛选其抑制剂。

Overall views of the β-galactosidase active site

Figure1. Stereoview of a surface representation of the tetramer in which each subunit

is shown in a different color. Two lactose molecules (shown in white) are shown binding in the active site pockets. The deepest parts of the active sites are not visible in the figure. The other two active sites are on the “back” side of the tetramer.

Figure2. Closer stereoview of a single active site. Protein atoms are colored by domain with domain 1 in blue, domain 2 in cyan, domain 3 in yellow, and domain 5 in red (there are no atoms from domain 4). Solvent molecules and metals are in white. The yellow balls are metal ligands

which are protein atoms. The semitransparent surface was calculated using protein atoms plus solvent atoms with B < 25 ?2. Two ligands are shown: lactose (green) binds in the “shallow” mode while galactono- lactone (red) binds in the “deeper” mode.

通过对酶的分子结构和活性基团的分析，发现其蛋白质原子中有金属配体，因此研究了金属离子和氨基酸对此酶的抑制活性。

2.实验部分

1、混合交叉法筛选金属离子和氨基酸等生物小分子

cooperation effect of Amino acids and Metals

从上表可以看出，金属离子和氨基酸有协同抑制活性，但抑制效果较小，当单独的金属离子有激活作用时（如Mg），协同多种氨基酸反而表现有抑制活性，可以初步判断比较好的是Co和Ala的协同效果。

2、天然产物化合物的筛选