凯氏定氮法测定食品中蛋白质
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玻珠数粒
45度角
18
中新口腔
（2）蒸馏
将消化液全部转移 到100ml容量瓶中
通入蒸汽开始蒸馏
取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反 应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻 璃塞，向小玻璃杯内加入10ml40%NaOH, 提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反应室， 立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加 水使之密封。
小结
中新口腔
24
中新口腔
自动凯氏定氮仪法
在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯 氏定氮仪法，具有安全、高效、准确的优点。
仪器：
消化炉
自动蒸 馏装置
25
中新口腔
1、原理及适用范围 2、特点：
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶， 红外线加热的消化炉。
（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟 可消化完毕。
（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定， 自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录， 12分钟完成1个样。
26
中新口腔
双缩脲法（分光光度法）
1.原理——双缩脲反应
碱性条件下、双缩脲与硫酸铜作用生成紫红色配 合物的反应。
KOH、
肽键（-CO-NH-）与双缩C石脲u酸S结O钾构4钠、相配酒似置、能呈现此
• 凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应 的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。
1.原理
1
2
3
样品与浓硫酸和催 化剂一同加热消化， 使蛋白质分解，其 中碳和氢被氧化为
二氧化碳和水逸出
样品中的有机氮 转化为氨与硫酸 结合成硫酸铵
加碱蒸馏，使氨 蒸出，用硼酸吸 收后再以标准盐
酸溶液滴定
中新口腔
2.实验步骤
加入NaOH溶液后颜色 为深蓝色或褐色
冷凝管下口浸入 硼酸溶液中
加10ml硼酸溶液和 混合指示剂2～3d
19
中新口腔
吸收液变蓝色后继 续蒸馏5分钟，将冷 凝管尖端提离液面 再蒸馏1min，用蒸 馏水冲洗冷凝管尖 端，取下接收瓶， 关闭电源
20
中新口腔
（3）滴定
取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸或硫 酸标准溶液滴定至终点。
硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10），用酸滴定不影响 指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用 硫酸、盐酸溶液也可用作吸收剂。
中新口腔
各步骤操作细节图解：
样品消化→蒸馏→滴定 （1）样品消化
盖上小漏斗
瓶口不能对着人
先小火炭化，无泡沫 后，加大火力，液体 变蓝绿透明，继续加
热微沸30分钟
样品+0.4g硫酸 铜+6g硫酸钾 消+化20终m点l浓硫酸+
课程名称 授课时间 本次内容
教学目标
重点 难点 能力Baidu Nhomakorabea练方式方法
食品理化检测技术 2016.4.15
授课班级 授课时数
营养1431 2
食品中蛋白质含量测定
教具
多媒体
能力（技能）目标
知识目标
1. 2.
能安装 的消化 装置。
凯 、
氏 蒸
定 馏
氮 吸
法 收
1. 2.
能根据结 品标准。
果
判
定
食
3.
了解蛋白质测定意义
维持酸碱平衡、 水平衡
维持物质的代 谢及运转
营养指标、 食品生产工艺 指标。
中新口腔
常见食物中蛋白质的含量
螺旋藻
牛肉
5
中新口腔
常见食物氮系数
氮系数：蛋白质含氮量的倒数，常用6.25表示。
6
中新口腔
蛋白质测定方法
方法 凯氏定氮法 双缩脲法
Folin－酚试 剂法
紫外吸收法
考马斯亮蓝法
时间
应用范围
优缺点
滴定前
滴定终点
同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。21
中新口腔
实验注意事项—消化
（1）不时转动凯氏烧瓶、缓和沸腾消化 （2）消化至呈透明后，继续消化30分钟，一般消化
时间约4小时 （3）可加如少量辛醇、硅油做消泡剂 （4）样品不易澄清时可冷却后加入30%过氧化氢2-
3ml
22
中新口腔
掌握常量凯氏定氮法测定蛋白 质方法 了解试验中各种试剂作用
蛋白质测定原理、步骤
蒸馏、吸收装置的安装
讲解、问答、互动
教学环节时间安排 课外任务 参考资料
复习：5min；讲解、互动：75min 小结：5min；看书巩固知识点：5min
对比微量和常量凯氏定
氮法实验试剂、步骤的 课堂考勤
47
区别
《食品分析与检验技术》《食品理化检测技中术新》口腔
中新口腔
第二步——蒸馏
(NH4)2SO4+2NaOH→NH3+Na2SO4+2H2O
中新口腔
注意事项：
氢氧化钠需过量、若不够，会生成
01
H2S,H2S是强酸，会使溶液颜色变红
02
防止样液中氨气逸出。
中新口腔
(3）吸收与滴定
吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸溶液 滴定：盐酸标准溶液，
2NH 3 4H 3BO3 (NH 4)2B4O7 5H 2O (NH 4)2B4O7 5H 2O 2HCl 2NH 4Cl 4H 3BO3
30
中新口腔
燃烧法
中新口腔
消化 蒸馏 吸收、滴定 计算
中新口腔
第一步：样品消化
样品与浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水并 破坏有机物，C、H氧化为二氧化碳、水逸出，蛋白 质分解为氨、与硫酸结合生成硫酸铵、留在溶液中
消化
对原子的前处理，使被测物质进入 溶液中，使不溶变为可溶、有机物分解 为可溶性无机物
中新口腔
（1）消化
总反应式：
8-10h 20-30min 40-60min
5-10min 5-15min
0.2-1.0mg氮 1-10mg氮
<5mg氮
50-100mg蛋 白质 0～0.1mg/mL
时间长
灵敏度低、快 速检测
灵敏度高、耗 时长、试剂配 制困难
层析柱流出物 检测 较好，标准曲 线有轻微非线 性
7
中新口腔
二、凯氏定氮法测定蛋白质（粗蛋白）
凯氏定氮法 测定食品中蛋白质
中新口腔
一、概述
蛋白质是以氨基酸为最小构成单元的大分子的
含氮化合物，它是由20种氨基酸通过酰氨键以
一定方式结合，并具有一定的空间结构。
3
中新口腔
生理功能及在食品中的作用
生命的物质基 础
遗传信息的表 达方式
人及动物需要从 食品得到蛋白质 及其分解产物， 来构成自身的蛋 白质
消化过程中试剂作用
• 硫酸钾：提高溶液沸点、加快反应进程；
K2SO4 H2SO4 2KHSO4
• 硫酸铜（蓝绿色）：催化作用
褐色
2CuSO4 Cu2SO4 SO2 O2 C 2CuSO4 Cu2SO4 SO2 CO2 Cu2SO4 2H 2SO4 2CuSO4 2H 2O S 02
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%）
11
中新口腔
消化装置 “自动回流消化仪”
中新口腔
定氮消化的不同状态
消泡 碳化
澄清
RCH2(NH2)COOH+H2SO4→CO2+H2O+SO2+ (NH4）2SO中4新口腔
（3）向上述7支试管中分别加入1ml四氯化碳后、用
碱性酒石酸铜溶液稀释至50ml，最振终摇测、定静溶止1h； 液中不能有沉
（4）取上清液在2000r/min离心5淀min、560nm测定吸
光度，绘制标准曲线。
中新口腔
3.样品测定
样品含量需在40-100mg内。
4.结果计算（mg/100g）
X m 100 m1
反应。
560nm处、由颜色深浅判定蛋白质含量多少。
27
中新口腔
标准曲线
• 标准曲线（standard curve）是指通过测定一系列 已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的性
质的数值曲线。
R>0.999 方可使用
中新口腔
2.标准曲线绘制
（1）配置一定浓度（10mg/ml）的蛋白质标准溶液；
（2）分别量取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、 10ml蛋白质标准液于7支50ml比色管中；
45度角
18
中新口腔
（2）蒸馏
将消化液全部转移 到100ml容量瓶中
通入蒸汽开始蒸馏
取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反 应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻 璃塞，向小玻璃杯内加入10ml40%NaOH, 提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反应室， 立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加 水使之密封。
小结
中新口腔
24
中新口腔
自动凯氏定氮仪法
在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯 氏定氮仪法，具有安全、高效、准确的优点。
仪器：
消化炉
自动蒸 馏装置
25
中新口腔
1、原理及适用范围 2、特点：
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶， 红外线加热的消化炉。
（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟 可消化完毕。
（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定， 自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录， 12分钟完成1个样。
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双缩脲法（分光光度法）
1.原理——双缩脲反应
碱性条件下、双缩脲与硫酸铜作用生成紫红色配 合物的反应。
KOH、
肽键（-CO-NH-）与双缩C石脲u酸S结O钾构4钠、相配酒似置、能呈现此
• 凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应 的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。
1.原理
1
2
3
样品与浓硫酸和催 化剂一同加热消化， 使蛋白质分解，其 中碳和氢被氧化为
二氧化碳和水逸出
样品中的有机氮 转化为氨与硫酸 结合成硫酸铵
加碱蒸馏，使氨 蒸出，用硼酸吸 收后再以标准盐
酸溶液滴定
中新口腔
2.实验步骤
加入NaOH溶液后颜色 为深蓝色或褐色
冷凝管下口浸入 硼酸溶液中
加10ml硼酸溶液和 混合指示剂2～3d
19
中新口腔
吸收液变蓝色后继 续蒸馏5分钟，将冷 凝管尖端提离液面 再蒸馏1min，用蒸 馏水冲洗冷凝管尖 端，取下接收瓶， 关闭电源
20
中新口腔
（3）滴定
取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸或硫 酸标准溶液滴定至终点。
硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10），用酸滴定不影响 指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用 硫酸、盐酸溶液也可用作吸收剂。
中新口腔
各步骤操作细节图解：
样品消化→蒸馏→滴定 （1）样品消化
盖上小漏斗
瓶口不能对着人
先小火炭化，无泡沫 后，加大火力，液体 变蓝绿透明，继续加
热微沸30分钟
样品+0.4g硫酸 铜+6g硫酸钾 消+化20终m点l浓硫酸+
课程名称 授课时间 本次内容
教学目标
重点 难点 能力Baidu Nhomakorabea练方式方法
食品理化检测技术 2016.4.15
授课班级 授课时数
营养1431 2
食品中蛋白质含量测定
教具
多媒体
能力（技能）目标
知识目标
1. 2.
能安装 的消化 装置。
凯 、
氏 蒸
定 馏
氮 吸
法 收
1. 2.
能根据结 品标准。
果
判
定
食
3.
了解蛋白质测定意义
维持酸碱平衡、 水平衡
维持物质的代 谢及运转
营养指标、 食品生产工艺 指标。
中新口腔
常见食物中蛋白质的含量
螺旋藻
牛肉
5
中新口腔
常见食物氮系数
氮系数：蛋白质含氮量的倒数，常用6.25表示。
6
中新口腔
蛋白质测定方法
方法 凯氏定氮法 双缩脲法
Folin－酚试 剂法
紫外吸收法
考马斯亮蓝法
时间
应用范围
优缺点
滴定前
滴定终点
同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。21
中新口腔
实验注意事项—消化
（1）不时转动凯氏烧瓶、缓和沸腾消化 （2）消化至呈透明后，继续消化30分钟，一般消化
时间约4小时 （3）可加如少量辛醇、硅油做消泡剂 （4）样品不易澄清时可冷却后加入30%过氧化氢2-
3ml
22
中新口腔
掌握常量凯氏定氮法测定蛋白 质方法 了解试验中各种试剂作用
蛋白质测定原理、步骤
蒸馏、吸收装置的安装
讲解、问答、互动
教学环节时间安排 课外任务 参考资料
复习：5min；讲解、互动：75min 小结：5min；看书巩固知识点：5min
对比微量和常量凯氏定
氮法实验试剂、步骤的 课堂考勤
47
区别
《食品分析与检验技术》《食品理化检测技中术新》口腔
中新口腔
第二步——蒸馏
(NH4)2SO4+2NaOH→NH3+Na2SO4+2H2O
中新口腔
注意事项：
氢氧化钠需过量、若不够，会生成
01
H2S,H2S是强酸，会使溶液颜色变红
02
防止样液中氨气逸出。
中新口腔
(3）吸收与滴定
吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸溶液 滴定：盐酸标准溶液，
2NH 3 4H 3BO3 (NH 4)2B4O7 5H 2O (NH 4)2B4O7 5H 2O 2HCl 2NH 4Cl 4H 3BO3
30
中新口腔
燃烧法
中新口腔
消化 蒸馏 吸收、滴定 计算
中新口腔
第一步：样品消化
样品与浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水并 破坏有机物，C、H氧化为二氧化碳、水逸出，蛋白 质分解为氨、与硫酸结合生成硫酸铵、留在溶液中
消化
对原子的前处理，使被测物质进入 溶液中，使不溶变为可溶、有机物分解 为可溶性无机物
中新口腔
（1）消化
总反应式：
8-10h 20-30min 40-60min
5-10min 5-15min
0.2-1.0mg氮 1-10mg氮
<5mg氮
50-100mg蛋 白质 0～0.1mg/mL
时间长
灵敏度低、快 速检测
灵敏度高、耗 时长、试剂配 制困难
层析柱流出物 检测 较好，标准曲 线有轻微非线 性
7
中新口腔
二、凯氏定氮法测定蛋白质（粗蛋白）
凯氏定氮法 测定食品中蛋白质
中新口腔
一、概述
蛋白质是以氨基酸为最小构成单元的大分子的
含氮化合物，它是由20种氨基酸通过酰氨键以
一定方式结合，并具有一定的空间结构。
3
中新口腔
生理功能及在食品中的作用
生命的物质基 础
遗传信息的表 达方式
人及动物需要从 食品得到蛋白质 及其分解产物， 来构成自身的蛋 白质
消化过程中试剂作用
• 硫酸钾：提高溶液沸点、加快反应进程；
K2SO4 H2SO4 2KHSO4
• 硫酸铜（蓝绿色）：催化作用
褐色
2CuSO4 Cu2SO4 SO2 O2 C 2CuSO4 Cu2SO4 SO2 CO2 Cu2SO4 2H 2SO4 2CuSO4 2H 2O S 02
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%）
11
中新口腔
消化装置 “自动回流消化仪”
中新口腔
定氮消化的不同状态
消泡 碳化
澄清
RCH2(NH2)COOH+H2SO4→CO2+H2O+SO2+ (NH4）2SO中4新口腔
（3）向上述7支试管中分别加入1ml四氯化碳后、用
碱性酒石酸铜溶液稀释至50ml，最振终摇测、定静溶止1h； 液中不能有沉
（4）取上清液在2000r/min离心5淀min、560nm测定吸
光度，绘制标准曲线。
中新口腔
3.样品测定
样品含量需在40-100mg内。
4.结果计算（mg/100g）
X m 100 m1
反应。
560nm处、由颜色深浅判定蛋白质含量多少。
27
中新口腔
标准曲线
• 标准曲线（standard curve）是指通过测定一系列 已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的性
质的数值曲线。
R>0.999 方可使用
中新口腔
2.标准曲线绘制
（1）配置一定浓度（10mg/ml）的蛋白质标准溶液；
（2）分别量取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、 10ml蛋白质标准液于7支50ml比色管中；