现代生物技术综合实验
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一、实验目的
1、学习利用紫外分光光度法鉴定DNA质量
2、采用Ⅱ型限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通 过琼脂糖凝胶电泳分析酶切效果。
二、实验原理
DNA吸收光谱峰在260 nm处，测定此波长下DNA溶液的 OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50 µg/mL，据此 可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质吸收 峰在280 nm处，在测定DNA含量时，通过计算OD260/OD280 值，可了解所测DNA的纯度，如该值为1.8～2.0时，DNA纯 度高。
2、酶切反应
酶切反应液的配制:
Xba I
1μl
10×M buffer 2μl
0.1%BSA
2μl
DNA
5μl (根据质粒浓度来确定用量)
ddH2O
10μl
酶切反应条件：37℃水浴2～3小时。
3、电泳检测
反应结束后，向反应液中加入2.5μl 10×loading buffer，混匀，用以停止酶切反应，所有22.5μl样品均 点在同一个点样孔中。电泳条件：120V, 20分钟左右。
已知Ⅱ型限制性核酸内切酶能专一识别碱基序列，并在该 处切断双链DNA，形成一定长度和序列的DNA片段。酶切 反应需Mg2+等金属离子以及一定浓度的盐离子，不同内切酶 对盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量 过高（﹥5%），会使酶的识别位点发生改变，产生星活性。 绝大多数酶的反应温度37℃。
现代生物技术综合实验
实验要求
两人一组，独立实验 每次实验完成均要求写实验报告及思考题 不得旷课，特殊情况可补实验 每次实验安排2人配制琼脂糖凝胶
本课程考核
前6个实验共计50分（实验报告和思考题） （本部分成绩也是《基因工程》的平时成绩）
综合实验（包括设计报告）共计50分
实验一 质粒DNA的制备与质量鉴定
28.5 mL H2O； 饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、酚/氯仿（1:1，V/V） TE缓冲液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，
含RNA酶（RNaseA）: 20 µg/ml 醋酸钠（pH5.2）、70%乙醇、无水乙醇
四、实验步骤
1) 吸取1.4 ml菌液至1.5 ml离心管中。 2) 离心(8 000r/min，1min)，弃上清液（根据菌液浓度判
断是否需要重复1~2次）。 3) 加入150 µL 溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。 4) 加入200 µL溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透
明状。此步骤在5分钟内完成。 5) 加入150 µL预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直
至出现白色絮状沉淀，冰浴5min。 6) 离心(14 000r/min，5min)，移取上清液于另一干净离心
13)加20~30µL TE缓冲液使DNA完全溶解，室温放置 10min，降解RNA杂质，少量用于琼脂糖凝胶质量检 测，剩余质粒-20℃保存备用。
14) 1%琼脂糖凝胶配制：称取1g琼脂糖粉末，加入100ml 0.5倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入5µL溴化 乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。
பைடு நூலகம்
三、实验材料： 实验一提取的质粒DNA 四、试剂
限制性核酸内切酶Xba I；缓冲液10×M Buffer； 0.1%BSA; 0.5×TBE Buffer；1%琼脂糖
五、实验步骤
1、DNA的测定
空白测定(Blank)：吸取200 µl TE缓冲液至比色杯，进行空 白测定。
DNA测定(Sample)：取质粒DNA 1 µl至一干净的离心管， 加入199 µl TE缓冲液稀释混匀，所有溶液加入到干净的比 色杯中，测定260 nm及280 nm的光吸收值；计录DNA浓度 及OD260/OD280比值。
三、实验材料与主要试剂
实验材料： 含pEGFP质粒的大肠杆菌DH5α
主要试剂：
溶液I：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA， 25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4 mg/L
溶液II： 0.2 mol/L NaOH溶液（内含1% SDS）,现配现用 溶液III（pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸，
一、实验目的
学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质 粒DNA的提取方法。
二、实验原理
在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结 构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小， 且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互 补链也不会完全分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒 DNA 又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色 体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成 不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA 及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的 RNA则留在上清液中，再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋 白质，混杂的RNA可用RNA酶(RNAase)消除。
15) 每位同学各取5µL质粒DNA加入1µL 6×loading buffer，混匀，进行点样。
16)电泳条件：120v，40 min；电泳完成后，胶块通过凝
胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。
五、实验结果
观察并分析电泳图片
六、实验报告
按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
实验二 质粒DNA的片断化及分离
管。
7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）， 振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，5min)，溶液将出 现分层。
8) 移取上层水相溶液（约450~500µL）于另一干净离心管， 加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min， 5min)，溶液将出现分层。
9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的 醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30min。
10) 离心(14 000r/min，10min，4℃)，倒掉上清液。
11) 加0.5 ml 预冷的70% 酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离 心5 min，倒掉上清液。
12)真空抽干或室温自然干燥.
六、实验结果
观察并分析电泳图片。
七、实验报告
1、学习利用紫外分光光度法鉴定DNA质量
2、采用Ⅱ型限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通 过琼脂糖凝胶电泳分析酶切效果。
二、实验原理
DNA吸收光谱峰在260 nm处，测定此波长下DNA溶液的 OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50 µg/mL，据此 可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质吸收 峰在280 nm处，在测定DNA含量时，通过计算OD260/OD280 值，可了解所测DNA的纯度，如该值为1.8～2.0时，DNA纯 度高。
2、酶切反应
酶切反应液的配制:
Xba I
1μl
10×M buffer 2μl
0.1%BSA
2μl
DNA
5μl (根据质粒浓度来确定用量)
ddH2O
10μl
酶切反应条件：37℃水浴2～3小时。
3、电泳检测
反应结束后，向反应液中加入2.5μl 10×loading buffer，混匀，用以停止酶切反应，所有22.5μl样品均 点在同一个点样孔中。电泳条件：120V, 20分钟左右。
已知Ⅱ型限制性核酸内切酶能专一识别碱基序列，并在该 处切断双链DNA，形成一定长度和序列的DNA片段。酶切 反应需Mg2+等金属离子以及一定浓度的盐离子，不同内切酶 对盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量 过高（﹥5%），会使酶的识别位点发生改变，产生星活性。 绝大多数酶的反应温度37℃。
现代生物技术综合实验
实验要求
两人一组，独立实验 每次实验完成均要求写实验报告及思考题 不得旷课，特殊情况可补实验 每次实验安排2人配制琼脂糖凝胶
本课程考核
前6个实验共计50分（实验报告和思考题） （本部分成绩也是《基因工程》的平时成绩）
综合实验（包括设计报告）共计50分
实验一 质粒DNA的制备与质量鉴定
28.5 mL H2O； 饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、酚/氯仿（1:1，V/V） TE缓冲液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，
含RNA酶（RNaseA）: 20 µg/ml 醋酸钠（pH5.2）、70%乙醇、无水乙醇
四、实验步骤
1) 吸取1.4 ml菌液至1.5 ml离心管中。 2) 离心(8 000r/min，1min)，弃上清液（根据菌液浓度判
断是否需要重复1~2次）。 3) 加入150 µL 溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。 4) 加入200 µL溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透
明状。此步骤在5分钟内完成。 5) 加入150 µL预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直
至出现白色絮状沉淀，冰浴5min。 6) 离心(14 000r/min，5min)，移取上清液于另一干净离心
13)加20~30µL TE缓冲液使DNA完全溶解，室温放置 10min，降解RNA杂质，少量用于琼脂糖凝胶质量检 测，剩余质粒-20℃保存备用。
14) 1%琼脂糖凝胶配制：称取1g琼脂糖粉末，加入100ml 0.5倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入5µL溴化 乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。
பைடு நூலகம்
三、实验材料： 实验一提取的质粒DNA 四、试剂
限制性核酸内切酶Xba I；缓冲液10×M Buffer； 0.1%BSA; 0.5×TBE Buffer；1%琼脂糖
五、实验步骤
1、DNA的测定
空白测定(Blank)：吸取200 µl TE缓冲液至比色杯，进行空 白测定。
DNA测定(Sample)：取质粒DNA 1 µl至一干净的离心管， 加入199 µl TE缓冲液稀释混匀，所有溶液加入到干净的比 色杯中，测定260 nm及280 nm的光吸收值；计录DNA浓度 及OD260/OD280比值。
三、实验材料与主要试剂
实验材料： 含pEGFP质粒的大肠杆菌DH5α
主要试剂：
溶液I：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA， 25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4 mg/L
溶液II： 0.2 mol/L NaOH溶液（内含1% SDS）,现配现用 溶液III（pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸，
一、实验目的
学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质 粒DNA的提取方法。
二、实验原理
在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结 构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小， 且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互 补链也不会完全分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒 DNA 又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色 体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成 不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA 及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的 RNA则留在上清液中，再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋 白质，混杂的RNA可用RNA酶(RNAase)消除。
15) 每位同学各取5µL质粒DNA加入1µL 6×loading buffer，混匀，进行点样。
16)电泳条件：120v，40 min；电泳完成后，胶块通过凝
胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。
五、实验结果
观察并分析电泳图片
六、实验报告
按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
实验二 质粒DNA的片断化及分离
管。
7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）， 振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，5min)，溶液将出 现分层。
8) 移取上层水相溶液（约450~500µL）于另一干净离心管， 加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min， 5min)，溶液将出现分层。
9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的 醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30min。
10) 离心(14 000r/min，10min，4℃)，倒掉上清液。
11) 加0.5 ml 预冷的70% 酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离 心5 min，倒掉上清液。
12)真空抽干或室温自然干燥.
六、实验结果
观察并分析电泳图片。
七、实验报告