醋酸纤维素薄膜电泳
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血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳
——第三组
陈艳 李秀清 张伟 孙金山
定义：带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极移动 的现象。
负 极
正 极
－
那 么 什 么 是 电 泳？
电泳为何能分离混合物？
迁移率（mobility)：表示单位电场强度粒子 的速度。 又叫泳动度，用 μ表示。 μ＝v/E=Q/(6πrη) 可知，在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具 有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一 定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同， 即它们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行 分离。 电泳的应用：分离各种有机物；分析某种物质的 纯度及分子量。
表面带负电荷 带正电荷的水层携带粒子向 负极移动
如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快；
如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。
电泳技术：指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 电泳技术的优点：快速，准确，重复性好。 电泳分类： 按装置的差异有：薄膜电泳，垂直板电泳，平板电泳，垂直圆 盘电泳和毛细管电泳 按支持介质有： １ 醋酸纤维素薄膜电泳：分辨率高，成本低，灵敏度高，应用 广泛。 ２ 琼脂糖凝胶电泳：操作简单，分辨率高，重复性好，结果可 定量分析，电泳后易洗脱。 ３ 聚丙烯酰胺凝胶电泳；灵敏度高，对pH和温度变化较温度， 应用广。 ４ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有聚丙烯酰胺凝胶电泳的所有 优点。 ５ 等电聚焦电泳。 ６ 双向电泳：具有极高的灵敏度和分辨率。
２、浸膜
在膜条无光泽面距一端１ .５cm处用铅笔轻划点样线，浸入电
极缓冲液中，至完全浸透为止（≧２０min)。用镊子取出薄膜， 点样线向上平放于干净滤纸上，用滤纸轻轻地按压，吸去薄膜上 多余的液体。
３、点样
取少量待测血清均匀涂布在玻璃片上，用宽１cm的平整的塑
料软片末端取少许样品，垂直轻印到薄膜点样线上，形成一条 细窄而均匀的直线。（注：点样量不宜过多）此步是实验的关 键。以印章法加样时，点样量不宜过多，动作应轻，稳，用力 不能太重。
（Tris三羟甲基氨基甲烷）
染色液：称取0.5g氨基黑，甲醇50ml，冰醋
酸10ml，蒸馏水加至100ml。
漂洗液： 取甲醇 45ml ，冰乙酸 5ml 和蒸馏水
50ml，混匀置塞试剂瓶内贮存。
实验操作
１、准备 将电极缓冲液加入电泳槽的电极室内， 使正，负极室的液面等高，调节电泳支架宽度正好 适合醋酸纤维素薄膜的长度。用４层纱布或滤纸做 盐桥，一端浸入缓冲液中，一端搭在支架上。
短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行 复染。
７、每次电泳时应交换电极，使两侧电泳槽内缓冲液的正负
离子相互交换，使缓冲液的pH维持在一定水平。
电泳失败的原因
①电泳图不整齐（点样不均匀，温度过高等） ②各组分分离效果不佳（点样过多，电流过低 等） ③染色后蛋白区带中间着色浅（染色试剂不足 等）
蛋 白 质
1 2 3 4
实验目的 实验原理 实验步骤
注意事项
实验目的
掌握电泳的基本原理，了解电泳仪， 电泳槽的基本结构和功能。
熟悉电泳的基本过程与定量方法。 熟悉血清电泳在临床诊断中的作用。
实验原理
1. 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支 持物的电泳方法。 2. 血清中各种蛋白质的等电点在 pH4.88 ～ 7.50 之 间，在pH8.6的缓冲溶液中均带负电荷，在电场 中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电点不 同，所以带电荷量也不同。此外各种蛋白质的 分子大小各有差异，因此在同一电场中泳动的 速度不同。分子小而带电荷多者，泳动较快； 反之，则较慢。
７、定量 将干燥的薄膜电泳图谱入自动扫描光密度
注意事项
1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去。 3 、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜
影响分离效果。
4 、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或
过少。
5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端。 6 、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太
缓冲液pH=8.6
pI＜pH
血清蛋白均带负电荷,在电场中向正极移动 在醋酸纤维素薄膜分为五条带。电泳迁移率最大的是白蛋 白，其后为α1球蛋白，α2球蛋白，β球蛋白和γ球蛋白
+
白蛋 白(A)
α 1
α β
2
γ
实验器材
电泳仪，电泳槽，滤纸，醋酸纤维素薄膜 脱色摇床，染缸，点样器
试剂
４ x 电极缓冲液： 1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.6)
Βιβλιοθήκη Baidu清蛋白电泳结果的临床意义
可能相关疾病 骨髓瘤 白蛋白
α 1 球蛋 α 2 球 蛋 β 球 蛋 γ 球 蛋 白 白 白 白
↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓
肾病综合症
肾炎 肝硬化
↓ ↓（显著） ↓ ↓
急性肝坏死
传染性肝炎 急性感染初期
慢性炎症 / 感染 后期
低球蛋白血症
１样品性质
影 响 电 泳 分 离 效 果 的 因 素
迁移率与电荷量成正比，与相对分子质量成反比。
２电场强度
电压越高，速度越快。但高电压 介质温度升高 样品扩散 和对流速度增加 分辨率降低。低电压会延长电压时间，但 可以减少产热。所以，实验中我们要选择合适的电压，同时要冷 却降温。
３缓冲液的性质
缓冲液的ｐH决定了生物的解离程度。对于蛋白质和氨基酸来说，我们知 道溶液的pH离等电点越远,，所带的净电荷越多，迁移速度越快。因此选 择一个合适的pＨ，使各种蛋白质所带的净电荷数量差异越大，以利于分 离。缓冲液要求性能稳定，不易电解。 同时，缓冲液的离子强度会对自身缓冲能力有影响。过高，缓冲能力差， 过高则会阻碍分子的迁移，使样品速度减慢。
血清中几种主要蛋白组分：
血清蛋白质 白蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白 等电点 4.８８ 5.0６ 5.06 5.12 6.85～7. ５０ 分子量 69,000 200,000 300,000 90,000～ 150,000 156,000～ 950,000 占总蛋白的 ％ 57～72 2～ 5 4～ 9 6.5～12 12～2９
原理
影响电泳迁移率的因素：
1 、 内在因素：蛋白所带净电荷的性质和所带电
荷的多少、蛋白的大小和形状 2、外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的 离 子强度和电渗现象
等电点（pI)
以生物大分子为例
COOH＋
COOH＋
COOH
Pr
OH－
Pr
OH－
Pr
NH3+
NH2
NH3+
pH>pI
pH=pI
pH<pI
。
步骤
６、染色 取下薄膜直接浸于氨基黑 10B 染色 液中，染色５～ 10min 。然后在漂洗液中漂去剩余染 料，直至背景无色为止。回收漂洗液。。 仪内，记录仪上自动绘出蛋白质组分曲线图。每一个 峰代表一种蛋白质组分。若使用具有电子计算机附件 的自动扫描光密度仪，可通过相关软件的分析，直接 。 获得每条区带蛋白质的百分含量。
蛋白质的染色方法
1. 2. 3. 氨基黑10B ：蓝色酸性染料，可与蛋白质结合 形成青色结合物。灵敏度为考马斯亮蓝R-250 的20%。 考马斯亮蓝R-250:可通过非共价键与蛋白质结 合，适用于微量SDS-蛋白质染色。 银染 染色机制与摄影过程中Ａg离子的还原 相似，灵敏度比考马斯高100倍。常用于凝胶 低电泳中极微量蛋白质的染色。
５温度
。
热不利于电泳 热蒸发缓冲液，影响缓冲液的离子强度，甚至导致样品
变质。 热会增加样品的扩散 为了减少热对实验的影响，可控制电泳或电流，也可安 装冷却完散热装置。
电渗作用
：
电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。
以纸电泳为例:
正极 负极
－－－－－－－－ ＋＋＋＋＋＋＋＋
临床意义: 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上 常用于分析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上 诊断肝、肾等疾病参考。
意义
肝炎:白蛋白,a1-球蛋白,a2-球蛋白,β-
球蛋白下降,γ-球蛋白升高 肝硬化 : 白蛋白 ,a1- 球蛋白 ,a2- 球蛋白 下降明显, γ-球蛋白极度升高 肾病综合症:白蛋白降低,α2和β球蛋白 升高
步骤
４、平衡 将膜条无光泽向下置于电泳槽支架上
，点样端靠近负极。薄膜两端要紧贴滤纸，（点 样线不要压在滤纸上）中间平直悬空，加盖密封 ，平衡５min。
５ 、电泳
将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上 （点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上 (见下图 ) 。 要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。连接好电泳 仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度 0.5mA/cm膜宽度，通电50min后，调节旋钮使电流为零，关 闭电泳仪切断电源。
４支持介质
理想的介质：具有网状结构，不带电荷，对分离物质无 吸附作用的惰性材料。 网状结构：提高电泳分辨率 电渗：降低分辨率。导致电渗的原因是支持介质表面存 在带电基团。 吸附：降低电泳分辨率。（常用支持介质中，高纯度的 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶的吸附最小，醋酸纤维素薄膜 次之，滤纸最大
——第三组
陈艳 李秀清 张伟 孙金山
定义：带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极移动 的现象。
负 极
正 极
－
那 么 什 么 是 电 泳？
电泳为何能分离混合物？
迁移率（mobility)：表示单位电场强度粒子 的速度。 又叫泳动度，用 μ表示。 μ＝v/E=Q/(6πrη) 可知，在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具 有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一 定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同， 即它们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行 分离。 电泳的应用：分离各种有机物；分析某种物质的 纯度及分子量。
表面带负电荷 带正电荷的水层携带粒子向 负极移动
如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快；
如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。
电泳技术：指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 电泳技术的优点：快速，准确，重复性好。 电泳分类： 按装置的差异有：薄膜电泳，垂直板电泳，平板电泳，垂直圆 盘电泳和毛细管电泳 按支持介质有： １ 醋酸纤维素薄膜电泳：分辨率高，成本低，灵敏度高，应用 广泛。 ２ 琼脂糖凝胶电泳：操作简单，分辨率高，重复性好，结果可 定量分析，电泳后易洗脱。 ３ 聚丙烯酰胺凝胶电泳；灵敏度高，对pH和温度变化较温度， 应用广。 ４ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有聚丙烯酰胺凝胶电泳的所有 优点。 ５ 等电聚焦电泳。 ６ 双向电泳：具有极高的灵敏度和分辨率。
２、浸膜
在膜条无光泽面距一端１ .５cm处用铅笔轻划点样线，浸入电
极缓冲液中，至完全浸透为止（≧２０min)。用镊子取出薄膜， 点样线向上平放于干净滤纸上，用滤纸轻轻地按压，吸去薄膜上 多余的液体。
３、点样
取少量待测血清均匀涂布在玻璃片上，用宽１cm的平整的塑
料软片末端取少许样品，垂直轻印到薄膜点样线上，形成一条 细窄而均匀的直线。（注：点样量不宜过多）此步是实验的关 键。以印章法加样时，点样量不宜过多，动作应轻，稳，用力 不能太重。
（Tris三羟甲基氨基甲烷）
染色液：称取0.5g氨基黑，甲醇50ml，冰醋
酸10ml，蒸馏水加至100ml。
漂洗液： 取甲醇 45ml ，冰乙酸 5ml 和蒸馏水
50ml，混匀置塞试剂瓶内贮存。
实验操作
１、准备 将电极缓冲液加入电泳槽的电极室内， 使正，负极室的液面等高，调节电泳支架宽度正好 适合醋酸纤维素薄膜的长度。用４层纱布或滤纸做 盐桥，一端浸入缓冲液中，一端搭在支架上。
短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行 复染。
７、每次电泳时应交换电极，使两侧电泳槽内缓冲液的正负
离子相互交换，使缓冲液的pH维持在一定水平。
电泳失败的原因
①电泳图不整齐（点样不均匀，温度过高等） ②各组分分离效果不佳（点样过多，电流过低 等） ③染色后蛋白区带中间着色浅（染色试剂不足 等）
蛋 白 质
1 2 3 4
实验目的 实验原理 实验步骤
注意事项
实验目的
掌握电泳的基本原理，了解电泳仪， 电泳槽的基本结构和功能。
熟悉电泳的基本过程与定量方法。 熟悉血清电泳在临床诊断中的作用。
实验原理
1. 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支 持物的电泳方法。 2. 血清中各种蛋白质的等电点在 pH4.88 ～ 7.50 之 间，在pH8.6的缓冲溶液中均带负电荷，在电场 中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电点不 同，所以带电荷量也不同。此外各种蛋白质的 分子大小各有差异，因此在同一电场中泳动的 速度不同。分子小而带电荷多者，泳动较快； 反之，则较慢。
７、定量 将干燥的薄膜电泳图谱入自动扫描光密度
注意事项
1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去。 3 、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜
影响分离效果。
4 、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或
过少。
5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端。 6 、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太
缓冲液pH=8.6
pI＜pH
血清蛋白均带负电荷,在电场中向正极移动 在醋酸纤维素薄膜分为五条带。电泳迁移率最大的是白蛋 白，其后为α1球蛋白，α2球蛋白，β球蛋白和γ球蛋白
+
白蛋 白(A)
α 1
α β
2
γ
实验器材
电泳仪，电泳槽，滤纸，醋酸纤维素薄膜 脱色摇床，染缸，点样器
试剂
４ x 电极缓冲液： 1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.6)
Βιβλιοθήκη Baidu清蛋白电泳结果的临床意义
可能相关疾病 骨髓瘤 白蛋白
α 1 球蛋 α 2 球 蛋 β 球 蛋 γ 球 蛋 白 白 白 白
↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓
肾病综合症
肾炎 肝硬化
↓ ↓（显著） ↓ ↓
急性肝坏死
传染性肝炎 急性感染初期
慢性炎症 / 感染 后期
低球蛋白血症
１样品性质
影 响 电 泳 分 离 效 果 的 因 素
迁移率与电荷量成正比，与相对分子质量成反比。
２电场强度
电压越高，速度越快。但高电压 介质温度升高 样品扩散 和对流速度增加 分辨率降低。低电压会延长电压时间，但 可以减少产热。所以，实验中我们要选择合适的电压，同时要冷 却降温。
３缓冲液的性质
缓冲液的ｐH决定了生物的解离程度。对于蛋白质和氨基酸来说，我们知 道溶液的pH离等电点越远,，所带的净电荷越多，迁移速度越快。因此选 择一个合适的pＨ，使各种蛋白质所带的净电荷数量差异越大，以利于分 离。缓冲液要求性能稳定，不易电解。 同时，缓冲液的离子强度会对自身缓冲能力有影响。过高，缓冲能力差， 过高则会阻碍分子的迁移，使样品速度减慢。
血清中几种主要蛋白组分：
血清蛋白质 白蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白 等电点 4.８８ 5.0６ 5.06 5.12 6.85～7. ５０ 分子量 69,000 200,000 300,000 90,000～ 150,000 156,000～ 950,000 占总蛋白的 ％ 57～72 2～ 5 4～ 9 6.5～12 12～2９
原理
影响电泳迁移率的因素：
1 、 内在因素：蛋白所带净电荷的性质和所带电
荷的多少、蛋白的大小和形状 2、外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的 离 子强度和电渗现象
等电点（pI)
以生物大分子为例
COOH＋
COOH＋
COOH
Pr
OH－
Pr
OH－
Pr
NH3+
NH2
NH3+
pH>pI
pH=pI
pH<pI
。
步骤
６、染色 取下薄膜直接浸于氨基黑 10B 染色 液中，染色５～ 10min 。然后在漂洗液中漂去剩余染 料，直至背景无色为止。回收漂洗液。。 仪内，记录仪上自动绘出蛋白质组分曲线图。每一个 峰代表一种蛋白质组分。若使用具有电子计算机附件 的自动扫描光密度仪，可通过相关软件的分析，直接 。 获得每条区带蛋白质的百分含量。
蛋白质的染色方法
1. 2. 3. 氨基黑10B ：蓝色酸性染料，可与蛋白质结合 形成青色结合物。灵敏度为考马斯亮蓝R-250 的20%。 考马斯亮蓝R-250:可通过非共价键与蛋白质结 合，适用于微量SDS-蛋白质染色。 银染 染色机制与摄影过程中Ａg离子的还原 相似，灵敏度比考马斯高100倍。常用于凝胶 低电泳中极微量蛋白质的染色。
５温度
。
热不利于电泳 热蒸发缓冲液，影响缓冲液的离子强度，甚至导致样品
变质。 热会增加样品的扩散 为了减少热对实验的影响，可控制电泳或电流，也可安 装冷却完散热装置。
电渗作用
：
电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。
以纸电泳为例:
正极 负极
－－－－－－－－ ＋＋＋＋＋＋＋＋
临床意义: 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上 常用于分析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上 诊断肝、肾等疾病参考。
意义
肝炎:白蛋白,a1-球蛋白,a2-球蛋白,β-
球蛋白下降,γ-球蛋白升高 肝硬化 : 白蛋白 ,a1- 球蛋白 ,a2- 球蛋白 下降明显, γ-球蛋白极度升高 肾病综合症:白蛋白降低,α2和β球蛋白 升高
步骤
４、平衡 将膜条无光泽向下置于电泳槽支架上
，点样端靠近负极。薄膜两端要紧贴滤纸，（点 样线不要压在滤纸上）中间平直悬空，加盖密封 ，平衡５min。
５ 、电泳
将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上 （点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上 (见下图 ) 。 要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。连接好电泳 仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度 0.5mA/cm膜宽度，通电50min后，调节旋钮使电流为零，关 闭电泳仪切断电源。
４支持介质
理想的介质：具有网状结构，不带电荷，对分离物质无 吸附作用的惰性材料。 网状结构：提高电泳分辨率 电渗：降低分辨率。导致电渗的原因是支持介质表面存 在带电基团。 吸附：降低电泳分辨率。（常用支持介质中，高纯度的 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶的吸附最小，醋酸纤维素薄膜 次之，滤纸最大