EST 表达序列标签

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EST-SNP开发软件特性分析及比较

文章编号: 1000-1336(2011)06-0906-06EST-SNP 开发软件特性分析及比较李猛1 郭大龙1 刘崇怀2 张国海11河南科技大学林学院，洛阳 4710032中国农业科学院郑州果树研究所，郑州 450009摘要：利用生物信息学软件，对表达序列标签(EST)序列进行单核苷酸多态性(SNP)开发目前已较为普遍，其方法简单实用，且软件数量较多，可分为需要测序峰图的SNP 开发软件和不需要测序峰图的SNP 开发软件。

对有测序峰图的序列进行SNP 开发，操作步骤较少且结果较为精确；对无测序峰图的序列进行SNP 开发可大批量操作且成本较低。

本文针对这两类软件进行分析比较，阐述EST-SNP 开发流程，重点分析以公共数据库中EST 序列为基础的SNP 开发过程，并对其各种使用参数加以说明，旨在为EST-SNP 开发提供参考，提高效率。

关键词：SNP ；软件分析；测序峰图；EST 序列中图分类号：Q81收稿日期：2011-04-25国家自然科学基金项目(30800742)；国家葡萄产业技术体系(nycytx-30-zy-01)；河南省高等学校青年骨干教师资助计划(2010GGJS- 072)资助作者简介：李猛(1987-)，男，硕士生， E-mail ：limengak47@ ；郭大龙(1978-)，男，博士，副教授，通讯作者，E-mail ：guodalong@ ；刘崇怀(1965-)，男，博士，研究员，通讯作者，E-mail ：liuchonghuai@ ；张国海(1962-)，男，博士，教授，E-mail ：zgh_ly@单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是指基因组内DNA 某一特定核苷酸位置上的转换、颠换、插入、缺失等变化。

一般情况下，我们所指的SNP 不包括碱基的插入与缺失[1]。

SNP 作为近年来出现的第三代遗传标记，目前已广泛应用于遗传连锁图谱构建[2]、多样性分析[3]、品种鉴定[4]和重要性状的基因定位[5]等相关研究中，具有密度高、遗传稳定性强、易于实现自动化分析等特点，比以简单序列重复(simple sequence repeat, SSR)为代表的第2代分子标记效率更高，更适用于高通量的检测分析。

基于est-ssr标记鉴定枇杷品种的方法

一、引言枇杷是一种常见的中药材和水果，其品种繁多，形态特征变异较大。

鉴别枇杷品种对种植、销售及科研具有重要意义。

传统的鉴定方法主要依靠形态学特征和生物学特性，但存在主管专家有限、耗时、费力、受环境和经验等因素影响的缺点。

近年来，基于现代分子生物学方法的est-ssr标记技术已经被广泛应用于枇杷品种的鉴定，具有高效、快速、准确的优势。

二、est-ssr标记技术的原理est-ssr（expressed sequence tag-derived simple sequence repeat）标记是利用EST数据（表达序列标签）进行简单重复序列的分析，并进行标记。

est-ssr标记是一种分子标记技术，利用基因组中的微卫星序列进行检测，并通过PCR扩增技术进行鉴定。

由于EST数据是从不同组织、不同生长阶段的cDNA样本中获得的，因此est-ssr 标记具有较强的系统进化、物种特异性和表达特异性。

三、est-ssr标记技术在枇杷品种鉴定中的应用1. 枇杷品种鉴定样本的准备在进行枇杷品种鉴定之前，首先需要收集不同品种的叶片或幼芽作为样本。

为了保证est-ssr标记技术的高效性和准确性，样本的选择和处理非常重要。

样本应选择来自不同地区或不同时间的品种，避免同一地区、同一种植基地或同一批次的样本。

样本的保存和处理过程中需要注意避免DNA的污染和降解。

2. est-ssr标记技术的实验步骤est-ssr标记技术主要包括DNA提取、PCR扩增、电泳分析等步骤。

首先需要从样本中提取DNA，可以采用CTAB法或商用DNA提取试剂盒进行提取。

提取的DNA需要经过质量检测，确保其完整性和纯度。

接下来是PCR扩增反应，选择合适的est-ssr引物进行扩增，PCR扩增条件需要进行优化，以获得清晰、特异的条带。

最后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，根据PCR扩增产物大小和样品条带图谱的差异，进行品种鉴定和分析。

3. est-ssr标记技术的数据分析和结果解读通过PCR扩增和电泳分析得到样品的est-ssr标记图谱，根据条带长度和数量对不同品种进行鉴别。

EST之详细介绍

Expressed Sequence Tags（ESTs）何谓Expressed Sequence Tags（ESTs）？从一特定细胞族群之mRNA转录而成的一群cDNA，经过single-pass的定序过程，而得到的一组序列。

此一细胞族群可以是特定的组织、器官，或是处于某特定发育状态或环境的细胞。

--- A set of single-pass sequenced cDNAs from an mRNA population derived from a specified cell population (e.g. a specific tissue, organ, developmental state or environmental condition).〈2〉ESTs之发展演进快速产生大量低质量的cDNA之概念在1980年代晚期被提出，此方法所能带来的利益，在当时并未能被普遍地认同。

提倡者认为这些cDNA序列能让很多新的protein-coding gene很快地被发现。

批评者则提出反驳，认为这些cDNA 序列将会遗漏掉许多原本能在genimic DNA中被找到的重要调控要素（regulatory elements）。

最后，还是由提倡cDNA定序的人赢得了胜利。

1991年时，有609个Expressed Sequence Tags（ESTs）首度被描述，而公用数据库（public databases）中ESTs的数量，更是呈现戏剧性的成长，到了1995年中，GenBank里ESTs records 的数量已超过非ESTs records的数量；2000年六月，四百六十万的ESTs records 已占了GenBank里所有序列的百分之六十二。

一开始，ESTs的来源只有人类；现在NCBI的EST database（dbEST）已包含了超过250种生物来源的ESTs，包括小鼠（mouse）、大鼠（rat）、Caenorhabditis elegans和黄果蝇（Drosophila melanogaster）等。

EST介绍

表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是指从不同组织来源的cDNA序列。

这一概念首次由Adams等于1991年提出。

近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显著成效。

在通过mRNA差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究。

克隆全长cDNA序列的传统途径是采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库，或采用PCR的方法，这些方法由于工作量大、耗时、耗材等缺点已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。

而随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前，采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。

文本将就EST技术的应用并就其在基因全长cDNA克隆上的应用作一较为详细的介绍。

1、ESTs与基因识别EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。

因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。

Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。

虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。

Medzhitov等通过果蝇黑胃TOLL蛋白进行dbEST数据库检索，该蛋白已证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用，通过同源分析的方法，找到相应的人类同源EST（登录号为H48602），这为接下来研究人类TOLL同源蛋白的功能提供了很好的条件。

生物信息分析经常使用名词说明

生物信息分析经常使用名词说明生物信息学（bioinformatics）：综合运算机科学、信息技术和数学的理论和方式来研究生物信息的交叉学科。

包括生物学数据的研究、存档、显示、处置和模拟，基因遗传和物理图谱的处置，核苷酸和氨基酸序列分析，新基因的发觉和蛋白质结构的预测等。

基因组（genome)：是指一个物种的单倍体的染色体数量，又称染色体组。

它包括了该物种自身的所有基因。

基因（gene）：是遗传信息的物理和功能单位，包括产生一条多肽链或功能RNA所必需的全数核苷酸序列。

基因组学：（genomics)是指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱）、核酸序列测定、基因定位和基因功能分析的科学。

基因组学包括结构基因组学（structural genomics)、功能基因组学（functional genomics)、比较基因组学(Comparative genomics)宏基因组学：宏基因组是基因组学一个新兴的科学研究方向。

宏基因组学（又称元基因组学，环境基因组学，生态基因组学等），是研究直接从环境样本中提取的基因组遗传物质的学科。

传统的微生物研究依托于实验室培育，元基因组的兴起填补了无法在传统实验室中培育的微生物研究的空白。

蛋白质组学（proteomics）：说明生物体各类生物基因组在细胞中表达的全数蛋白质的表达模式及功能模式的学科。

包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和彼此作用等。

遗传图谱：指通过遗传重组所取得的基因线性排列图。

物理图谱：是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再依照重叠序列把片段连接称染色体，确信遗传标记之间的物理距离的图谱。

转录图谱：是利用EST作为标记所构建的分子遗传图谱。

基因文库：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA 或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而组成各个片段的无性繁衍系（克隆），在制备的克隆数量多到能够把某种生物的全数基因都包括在内的情形下，这一组克隆的整体就被称为某种生物的基因文库。

分子标记介绍

分⼦标记介绍分⼦标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋⽩质。

即DNA⽚段即能反映⽣物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA ⽚段；能受基因控制并且能够稳定遗传的，能代表个体或群体的遗传特征，并可被⽤作遗传分析的物质。

它能够直接反映基因组间DNA间的差异。

常⽤的分⼦标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。

RAPD、AFLP属于以PCR为基础的分⼦标记；RFLP属于以Southern为基础的分⼦标记；SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分⼦标记；EST以mRNA为基础的分⼦标记。

1 主要的分⼦标记介绍1.1 限制性⽚段长度多态性（RFLP）RFLP是应⽤Southern杂交技术检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA⽚段的⼤⼩。

所以对于引起酶切位点变异的突变如点突变或部分DNA⽚段的缺失、插⼊、倒位⽽引起酶切位点缺失或获得等均可应⽤。

此⽅法的基本步骤包括：DNA的提取、⽤限制性内切酶酶切DNA、凝胶电泳分开DNA⽚段、把DNA⽚段转移到滤膜上、利⽤放射性标记的探针显⽰特定的DNA⽚段、分析结果。

探针⼀般选择单拷贝的。

其优点为共显性标记，稳定且可重复但耗时，昂贵且需应⽤同位素。

⽤该技术可作出植物的RFLP图谱，并应⽤于植物遗传和育种研究。

杨长红等采⽤PCR-RFLP技术，对库尔勒⾹梨等19个主要梨品种的cpDNA遗传多态性进⾏研究，其利⽤10对通⽤引物对总DNA进⾏扩增，并且采⽤7种限制性内切酶对PCR产物进⾏酶切，通过软件分析得出：7对引物（cp01、cp02、cp03、cp04、cp06、cp09、cp10）能在梨属植物上扩增出1条特异性谱带，cp09／MvaI，cp03／Hin6I的酶切位点有显著差异。

根据结果分析，库尔勒⾹梨与鸭梨、砀⼭梨、苹果梨、早酥、慈梨、⾦川雪梨、锦丰、新疆句句梨的平均距离系数较⼩，与其他梨的平均距离系数较⼤。

1.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD是以8-10个碱基的随机寡聚核苷酸序列为引物，利⽤PCR技术⾮特异性扩增DNA⽚段，然后⽤凝胶电泳分开扩增⽚段，即得到⼀系列多态性DNA⽚段.染⾊后即可进⾏多态性分析。

EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签

EST (Expressed Sequence Tag）表达序列标签EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签—是从一个随机选择的cDNA 克隆，进行5’端和3’端单一次测序挑选出来获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等，平均长度为360 ±120bp。

由于cDNA文库的复杂性和测序的随机性，有时多个EST代表同一基因或基因组，将其归类形成EST 簇（EST cluster)原理：EST是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等，平均长度为360 ±120bp。

EST 来源于一定环境下一个组织总mRNA 所构建的cDNA 文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。

技术路线：首先从样品组织中提取mRNA，在逆转录酶的作用下用oligo (dT) 作为引物进行RT-PCR合成cDNA，再选择合适的载体构建cDNA 文库，对各菌株加以整理，将每一个菌株的插入片段根据载体多克隆位点设计引物进行两端一次性自动化测序，这就是EST 序列的产生过程。

应用：EST作为表达基因所在区域的分子标签因编码DNA 序列高度保守而具有自身的特殊性质，与来自非表达序列的标记（如AFLP、RAPD、SSR等）相比更可能穿越家系与种的限制，因此EST标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信息是特别有用。

同样，对于一个DNA 序列缺乏的目标物种，来源于其他物种的EST也能用于该物种有益基因的遗传作图，加速物种间相关信息的迅速转化。

具体说，EST的作用表现在：⑴用于构建基因组的遗传图谱与物理图谱；⑵作为探针用于放射性杂交; ⑶用于定位克隆；⑷借以寻找新的基因; ⑸作为分子标记；⑹用于研究生物群体多态性；⑺用于研究基因的功能；⑻有助于药物的开发、品种的改良；⑼促进基因芯片的发展等方面。

基因组学

名词解释：第一章基因组遗传图（连锁图）：指基因或DNA标记在染色体上的相对位置与遗传距离。

单位是厘摩cM （基因或DNA片段在染色体交换过程中分离的频率）。

物理图：以已知核苷酸序列的DNA片段（序列标签位点，sequence-tagged site, STS）为“路标”，以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图。

转录图：以EST（expressed sequence tag ，表达序列标签）为标记，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。

EST：通过从cDNA文库中随机挑选的克隆进行测序所获得的部分cDNA的5'或3'端序列称为表达序列标签（EST），一般长300-500 bp左右。

序列图（分子水平的物理图）：序列图是指整个人类基因组的核苷酸序列图，也是最详尽的物理图。

既包括可转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和。

基因：合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA序列，即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，还应包括为保证转录所必需的调控序列。

基因组（genome）：生物所具有的携带遗传信息的遗传物质的总和。

基因组学（genomics）：涉及基因组作图、测序和整个基因组功能分析的一门学科。

C值：单倍体基因组的DNA总量，一个特定种属具有特征C值C值矛盾（C value paradox）：指一个有机体的C值和其编码能力缺乏相关性。

单一序列：基因组中单拷贝的DNA序列。

重复序列：基因组中多拷贝的DNA序列。

复杂性（complexity）：基因组中不同序列的DNA总长。

高度重复序列（highly repetitive sequence）：重复片段的长度单位在几个到几百个碱基对（base pair，bp）之间（一般不超过200 bp），串联重复频率很高（可达106以上），高度重复后形成的这类重复顺序称为高度重复顺序。

中度重复序列（intermediate repetitive sequence ）：重复长度300～7000 bp不等，重复次数在102～105左右。

表达序列标签EST概要

表达序列标签EST概要摘要：随着EST研究的开展、深入，以及相关研究技术和分析手段的不断改进并走向成熟，EST 数据资源不断丰富，而其本身又具备独特的优势和多方面的利用价值。

本文介绍了EST序列的获取、加工、储存、分配、分析和释读的相关研究。

关键词：EST 表达序列标签聚类cDNA文库生物信息学从事对生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和释读，并综合运用数学、计算机科学和生物学工具，以达到理解数据中的生物学含义的目的。

随着人类基因组计划在世界范围内的开展，生物信息学作为一门热门交叉学科，不断地完善和发展起来作为一种强有力的工具，它在帮助我们对巨量的生物信息进行归纳和理解，从而揭示生命的奥妙的过程中发挥了重要的作用。

然而信息的爆炸增长，面对复杂和庞大的数据库，如何有效地地获取我们所需要的信息，充分利用这些已有的数据资源，加速基因克隆研究已成为一个富有挑战性的课题。

表达序列标签的广泛应用，为大规模进行基因克隆和表达分析提供了强大的动力，也为生物信息学功能的充分发挥提供了广阔的空问表达序列标签(EST，Expressed Sequence Tag)是指从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA 部分序列,代表了一个完整基因的一小部分。

Adams等人在1991年提出了EST技术，宣布了cDNA大规模测序时代的开始。

随着大规模的测序，EST数据呈指数级增长。

到了1995年中，GenBank里ESTs的数量已超过非ESTs的数量；2000年6月，将近460万的ESTs 已占了GenBank里所有序列的62%。

ESTs序列不止来源于人类，NCBI的dbEST （EST database）中已包含了超过250种生物来源的ESTs，包括小鼠、大鼠、秀丽线虫和黄果蝇等。

除此之外，也有许多商业性的机构保存了一些属于机构内部不公开的ESTs 序列。

EST序列的制备EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。

生物信息学期末考试答案

生物信息学期末考试答案Bioinformatics：生物信息学——是一门综合运用生物学、数学、物理学、信息科学以及计算机科学等诸多学科的理论方法；以互联网为媒介、数据库为载体、利用数学和计算机科学对生物学数据进行储存、检索和处理分析；并进一步挖掘和解读生物学数据。

Consensus sequence：共有序列——决定启动序列的转录活性大小。

各种原核启动序列特定区域内（通常在转录起始点上游-10及-35区域）存在共有序列；是在两个或多个同源序列的每一个位置上多数出现的核苷酸或氨基酸组成的序列。

Data mining：数据挖掘——数据挖掘一般是指从大量的数据中自动搜索隐藏于其中的有着特殊关系性的信息的过程。

数据挖掘通常是利用计算方法分析生物数据；即根据核酸序列预测蛋白质序列、结构、功能的算法等；实现对现有数据库中的数据进行发掘。

EST：(Expressed Sequence Tag)表达序列标签——是某个基因cDNA克隆测序所得的部分序列片段；长度大约为200~600bp。

Similarity：相似性——是直接的连续的数量关系；是指序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低。

Homology：同源性——是两个对象间的肯定或者否定的关系。

如两个基因在进化上是否曾具有共同祖先。

从足够的相似性能够判定二者之间的同源性。

Alignment：比对——从核酸以及氨基酸的层次去分析序列的相同点和不同点；以期能够推测它们的结构、功能以及进化上的联系。

或是指为确定两个或多个序列之间的相似性以至于同源性；而将它们按照一定的规律排列。

BLOSUM：模块替换矩阵——是指在对蛋白质数据库搜索时；采用不同的相似性分数矩阵进行检索的相似性矩阵。

以序列片段为基础；从蛋白质模块数据库BLOCKS中找出一组替换矩阵；用于解决序列的远距离相关。

在构建矩阵过程中；通过设置最小相同残基数百分比将序列片段整合在一起；以避免由于同一个残基对被重复计数而引入的任何潜在的偏差。

分子标记技术的种类

分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA 分子标记技术大致可分为三类分子标记技术大致可分为三类: : : 第一类以第一类以Southern 杂交为核心杂交为核心, , , 其代表性技术为其代表性技术为RFLP ；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD 、SSR 、AFLP 、STS 、SRAP 、TRAP 等；第三类以DNA 序列序列((mRNA 或单核苷酸多态性单核苷酸多态性))为核心，其代表性技术为EST 标记、SNP 标记等。

理想的分子标记应达到以下的要求：标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；①具有高的多态性；①具有高的多态性；②共显性遗传；②共显性遗传；②共显性遗传；③能够明确辨别等③能够明确辨别等位基因；位基因；④分布于整个基因组中；④分布于整个基因组中；④分布于整个基因组中；⑤选择中性⑤选择中性⑤选择中性((即无基因多效性即无基因多效性))；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。

目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。

其特点比较见表一。

1限制性内切酶片段长度态多态性性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP ）19741974年，年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA 突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA 片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP )。

其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同同个体基因型中内切酶位点序列不同((可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA 时，会产生长度不同的DNA 酶切片段，通过凝胶电泳将通过凝胶电泳将 DNA 片段按各自的长度分开，通过Southern 印迹法，将这些大小不同的DNA 片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，最后通过放射性自显影显示杂交带，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出即检出限制性片段长度多态性。

西洋参cDNA文库构建及表达序列标签(EST)分析

２郑州大学纳米药物研究中心，郑＃１００；３郑州大学基础医学．４０１．５院，郑＇４００）／Ｎ５０１／中国药学杂志．２０，４（０．７６７一０８３１）－６￣７０制备分枝型聚乙烯亚胺（—Ｅ）反义寡核苷酸（Ｏ）分子组ＢＰＩ／ＡＳＮ超
院，石河子８２０）／国药学杂志．２０，４（）一８～９３０３／中～ｏ８３２．８４应用细胞膜色谱法（ｌｍｅｂａｅｃｒｍｔｒｐｙＭＣ对实验ｃｌｍｒｎｏａｇａｈ，Ｃ）ｅｈｏ室合成的ｌ种取代噻唑烷酸酯类化合物进行活性筛选．细胞膜色０谱筛选条件：心肌细胞膜色谱柱（ｍ２ｍＸ５ｍ）；流动相为２０ｍ５ｍｏ・磷酸盐缓冲液，Ｈ７：柱温３ｍｌＬｐ．４７℃；流速０３Ｌ・ｉ一，．ｍｒｎａ不同波长下检测，以容量因子、保留时间等为指标，卡托普利（ｐｐｌ为阳性对照，据化合物在细胞膜色谱柱上的保留特性ｃｔｆ）ａｏｉ根
（．河子大学化学化工学院，石河子８２０：２石河子大学医学１石３０３．
分枝型聚乙烯亚胺／核苷酸组装体的制备及细胞摄取研究＝寡
Ｓｕｙｏｒｐｒｔｎｏｒｎｈｄｐｌｅｈｌｎｍｉｅｏｉｏｕｌｏｉｅｔｄｎｐｅａａｉｆｂａｃｅｏｙｔｙｅｉｎ／ｌｎｃｅｔｏｇｄ
ｔｉｚｉｉｅ－・ａｂｘｆｃｃｄｅｈｌｅｔｒｂｙｃｌｍｅｂａｅｃｒｍａｈａｏｌｎｃｒｏｙａｉｔｙｓｅｅｌｄ４・ｉｍｒｎｈｏ－

分子生物学简答题

试述乳糖操纵子的阻遏作用、诱导作用及正调控。

阻遏作用：阻遏基因lacl转录产生阻遏物单体，结合形成同源四体，即阻遏物。

它是一个抗解链蛋白，当阻遏物与操纵基因O结合时，阻止DNA形成开放结构，从而抑制RNA聚合酶的功能。

lacmRNA的转录起始受到抑制。

诱导作用：按照lac操纵子本底水平的表达，每个细胞内有几个分子的β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷透过酶。

当加入乳糖，在单个透过酶分子的作用下，少量乳糖分子进入细胞，又在单个β-半乳糖苷酶的作用下转变为诱导物异构乳糖，诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之因不能与操纵基因结合而失活，O区没有被阻遏物占据从而激发lacmRNA的合成。

调控作用：葡糖糖对lac操纵子的表达的抑制是间接的，不是葡萄糖本身而是其降解产物抑制cAMP的合成。

cAMP-CAP复合物与启动子区的结合是lacmRNA转录起始所必须的，因为该复合物结合于启动子上游，能使DNA双螺旋发生弯曲。

有利于形成稳定开放型启动子-RNA 聚合酶结构。

如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，lac操纵子处于阻遏状态，不能被诱导试述 E.coli的RNA聚合酶的结构和功能。

2个α亚基、一个β亚基、一个β’亚基和一个亚基组成的核心酶，加上一个亚基后则成为聚合酶全酶α亚基：核心酶组装、启动子识别β和β’亚基：β和β’共同形成RNA合成的催化中心因子：存在多种因子，用于识别不同的启动子试述原核生物DNA复制的特点。

1.原核只有一个起始位点。

2.原核复制起始位点可以连续开始新的复制，特别是快速繁殖的细胞。

3.原核的DNA聚合酶III复制时形成二聚体复合物。

4.原核的DNA聚合酶I具有5'-3'外切酶活性DNA解旋酶通过水解ATP 产生能量来解开双链DNA单链结合蛋白保证被解链酶解开的单链在复制完成前保持单链结构DNA拓扑异构酶消除解链造成的正超螺旋的堆积，消除阻碍解链继续进行的这种压力，使复制得以延伸真核生物hnRNA必须经过哪些加工才能成为成熟的mRNA，以用作蛋白质合成的模板？（1）、在5’端加帽，5’端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）。

EST大规模表达序列标签

大规模表达序列标签(EST)测定及分析主要内容什么是EST? EST的应用EST序列测定及分析过程实例：家猪脑组织EST分析ESTs的来源上世纪80年代，对cDNA序列进行大规模测序的想法就曾提出，但对此一直存在争论，有人认为这种方法能发现成千上万的新基因；而反对者则认为cDNA序列缺少重要的基因调控区域的信息。

90年主要内容• 什么是EST?• EST的应用• EST序列测定及分析过程• 实例：家猪脑组织EST分析ESTs的来源上世纪80年代，对cDNA序列进行大规模测序的想法就曾提出，但对此一直存在争论，有人认为这种方法能发现成千上万的新基因；而反对者则认为cDNA序列缺少重要的基因调控区域的信息。

90年代初Graig Venter 提出了EST的概念，并测定了609条人脑组织的EST，宣布了cDNA大规模测序的时代的开始(Adams et al., 1991)。

● 93年前ESTs数据收录于GenBank，EBI和DDBJ。

● 1993年NCBI(National Center of Biotechnology Information)建立了一个专门的EST数据库dbEST来保存和收集所有的EST数据。

什么是ESTs ？ESTs（Expressed Sequence tags ）是从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，从5‘末端或3‘末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自动测序，所获得的约60500bp的一段cDNA序列。

ESTs与基因识别ESTs已经被广泛的应用于基因识别，因为ESTs的数目比GenBank中其它的核苷酸序列多，研究人员更容易在EST库中搜寻到新的基因(Boguski et al., 1994).● 在同一物种中搜寻基因家族的新成员(paralogs)。

● 在不同物种间搜寻功能相同的基因(orthologs)。

● 已知基因的不同剪切模式的搜寻。

【注：不过很难确定一个新的序列是由于交替剪切产生的或是由于cDNA文库中污染了基因组DNA序列(Wolfsberg et al., 1997)】ESTs与基因图谱的绘制EST可以借助于序列标签位点(sequence-tagged sites)用于基因图谱的构建. STS本身是从人类基因组中随机选择出来的长度在200-300bp左右的经PCR检测的基因组中唯一的一段序列。

表达序列标签研究进展及其在甲壳动物中的应用概况

表达序列标签研究进展及其在甲壳动物中的应用概况摘要：随着生物信息学的发展，表达序列标签（ＥＳＴ）在分子标记开发、新基因分离鉴定、基因表达谱分析、基因组功能注释、基因电子克隆等方面具有重要作用。

简要介绍了ＥＳＴ分析的原理及其在基因识别、基因预测、物理图谱的构建、ＤＮＡ芯片制备等方面的应用概况。

综述了甲壳动物ＥＳＴ的研究现状，并对ＥＳＴ的应用前景进行了展望。

关键词：表达序列标签（ＥＳＴ）；甲壳动物；生物信息学Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ（ＥＳＴ）played ａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅiｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｎｅｗｇｅｎｅｓｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅａｎａｌｙｓｉｓ，ｇｅｎｏｍｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｎｏｔａｔｉｏｎａｎｄｓｉｌｉｃｏｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ．TｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆＥＳＴａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓiｎｇｅｎｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，ｐｈｙｓｉｃａｌｍａｐｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＤＮＡｃｈｉｐｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎwas briefly introduced．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｓｔａｔｕｓｏｆｃｒｕｓｔａｃｅａｎＥＳＴａｎｄthe ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｆＥＳＴａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｗｅｒｅａｌｓｏｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ（ＥＳＴ）；ｃｒｕｓｔａｃｅａｎ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ表达序列标签（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ，ＥＳＴ）是从一个随机选择的ｃＤＮＡ克隆进行５’端和３’端单一次测序获得的短的ｃＤＮＡ部分序列。

ei的accession number

文章标题：深度探讨EI的Accession Number一、引言在生物学和生物信息学领域中，很多研究和实验数据都需要进行存储、管理和共享。

而对于这些数据的准确记录和跟踪，常常需要使用到Accession Number。

在本文中，我们将深入探讨 EI（GenBank数据库收录的EST和GSS序列）的Accession Number，并了解它的重要性和作用。

二、什么是EI的Accession NumberEI的Accession Number是指GenBank数据库中对于EST （Expressed Sequence Tag，表达序列标签）和GSS（Genome Survey Sequence，基因组调查序列）所分配的唯一标识号码。

每一个在GenBank数据库中被记录的EST和GSS序列都拥有独一无二的Accession Number，该号码由字母和数字组成，代表着该序列在数据库中的唯一身份。

通过Accession Number，我们可以快速地找到并访问到相应的序列信息，进行进一步的研究和应用。

三、EI的Accession Number的重要性和作用1. 数据管理和归档：EI的Accession Number作为唯一标识号，可以帮助我们将每个EST和GSS序列进行精确地记录和归档，确保数据的准确性和完整性。

2. 数据共享和交流：通过Accession Number，其他研究人员可以轻松地找到并访问到我们的研究数据，促进科学研究成果的交流和共享。

3. 实验重复性和验证：在科研实验中，Accession Number可以帮助我们准确地重复和验证他人的研究成果，保证科研的可靠性和可重复性。

四、EI的Accession Number相关研究案例分析通过对GenBank数据库中EI的Accession Number进行检索，我们发现了多个与癌症相关的EST和GSS序列，这些序列都具有独特的Accession Number。

RFLP,EST,RAPD,AFLP,微卫星SSR,线粒体DNA标记

1.RFLP限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。

因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。

技术路线：不同个体DNA的提取PCR扩增目的片断酶切凝胶电泳分开DNA片段转膜Southern杂交数据分析缺点：RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制RFLP原理图示：2.RAPD原理：RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。

由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。

单一引物与反向重复序列结合。

使重复序列之间的区域得以扩增。

引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。

原理示意图：若位点2处碱基发生改变，则技术路线：选择随机引物DNA的提取PCR反应凝胶电泳图谱分析RAPD的缺点：RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。

分子生物学名词解释

1、3’-、5’- 1、viroid2、A C T G 2、PSTV3、Melting Temperature 3、prion PrP c PrP sc3、Spontaneous Mutation4、scrapie4、Transition Transversion5、allele5、Hotspot6、Modified bases7、Denaturation renaturation（annealing）1、DMD 1、shot-gun approach2、DHFR 2、linker3、Translocation 3、TdT4、5’UTR 3’UTR 4、Saccharomyces cerevisiae5、Globin 5、C.elegans6、Rubisco 6、gene amplification7、transformation1、plasmid λ-phage cosmid 1、PLoS2、GATA 2、redundancy3、Genome 3、biochip4、Genetic map（linkage map） 4、SAGE5、Genetic polymorphism 5、DD法6、SNP 6、EST7、Genetic markers 7、HDA8、SSR PAPD AFLP 8、RACE9、Genomics TRanscriptomisc Proteomics 9、mtRNA1、gene family 1、cistronMet2、Alu family 2、tRNAf3、VNTR（STR） 3、PABP4、globin 4、RRF5、cryptic satellite 5、RF6、buoyant density7、DNA fingerprinting1、U D I A 1、trans-acting factor2、Suppressor 2、cis-acting elegent3、Chaperones 3、structural genes4、Self-assembly 4、CRP5、Protein translocation 5、ReIA6、SRP 6、idling reaction7、Translocon 7、ppGpp pppGpp8、TRAM 8、alarmone9、TOM TIM TOC TIC SecYEG Sec61 9、stringent response10、Pores NPC 10、attenuation attenuator11、Proteasome 11、microRNAs12、E1、E2、E3 12、RNAi RNA silencing13、Coding strand 35 hexamer 13、siRNA RISC10 hexamer intrinsic terminator 14、lytic infectionLysis prophage lysogeny integration episome plasmidInduction of prophage immunity of phageOR、PRM、clear plaque、PR/OR、PL/ OL、tR1、tL1、cI、cro、N、PR15、Crown gall disease，Ti plasmid ，OpineNopaline plasmids，Agrobacteria，octopine plasmids，agropine plasmids Ri plasmids，Chimeric，teratoma1、3′—end and 5′—end：DNA或RNA单链带有游离3’-羟基或其磷酸酯的一段叫做3’端；DNA或RNA单链带有游离5’-羟基或其磷酸酯的一段叫做5’端。

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ESTs的聚类和拼接
聚类的目的就是将来自同一个基因或同一个转录本的具有重叠部分(over－lapping)的ESTs整合至单一的簇(cluster)中。聚类作用：产生较长的一致性序列(consensus sequence) ，用于注释。降低数据的冗余，纠正错误数据。可以用于检测选择性剪切。 ESTs聚类的数据库主要有三个： UniGene (/UniGene) TIGR Gene Indices (/tdb/tgi/) STACK (http://www.sanbi.ac.za/)
◆ 基因表达系列分析(SAGE) 基因表达系列分析是一种用于定量，高通量基因表达分
析的实验方法(Velculescu et al., 1995)。SAGE的原理就是分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约9-14 个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应的基因的表达丰度。 ◆ DNA微阵列或基因芯片的研究高密度寡核苷酸cDNA 芯片或cDNA微阵列是一种新的大规模检测基因表达的技术，具有高通量分析的优点。在许多情况下，cDNA芯片的探针来源于3'EST (Duggan et al., 1999)，所以EST序列的分析有助于芯片探针的设计。
GeneMap 98’ 定位了30,000个基于基因的STS(Deloukas et al., 1998)，而且基因图谱随着STS的定位正在不断的更新中。
ESTs应用3：
ESTs与基因预测
由于EST来源于cDNA，因此每一条EST均代表了建立时所采样品特定发育时期和生理状态下
的一个基因的部分序列。使用合适的比对参数，
不严格的和严格的聚类 (loose and stringent clustering)
◆
loose clustering ● 产生的一致性序列比较长 ● 表达基因ESTs数据的覆盖率高 ● 含有同一基因不同的转录形式，如各种选择性剪接体 ● 每一类中可能包含旁系同源基因(paralogous expressed gene)的转录本 ● 序列的保真度低
ESTs数据的不达序列；
低丰度表达基因不易获得。由于只是一轮测序结果，出错率达2%-5%；
有时有载体序列和核外mRNA来源的cDNA污染或是基因组 DNA的污染；
◆
◆ ◆
有时出现镶嵌克隆；序列的冗余，导致所需20世纪80年代初，当时的目22, 135–139】和制备差异表达基因的特异探针【PNAS. 81, 2194–2198】。差异表达的基因通过检测样本cDNA(tester)和过量的对照样本mRNA (driver)的相互杂交而得到。在检测样本cDNA (tester)和对照样本mRNA (driver)同时表达的基因会形成mRNA/cDNA 杂交分子，而检测样本特异表达的基因则保持单链状态。单链分子和双链分子通过羟磷灰石层析而分离，分离得到的单链分子是检测样本特异表达的基因。差异表达，包括用生物素标记【Nucl. Acids 14, 10027–10044】和oligo(dT)30-latex标记cDNA，以增加单双链分子的分离效率。后来，通过PCR 选择性cDNA扩增技术被应用到扣除杂交中，以克服以往扣除杂交中需要大量起始 mRNA的缺点，并可以同时提高基因克隆地效率【Nucl. Acids Res. 19, 70977104】。 ◆ 扣除技术的进一步成熟是在1996年，Gurskaya 等(1996) 和Diatchenko 等 (1996) 同时发表了关于扣除杂交的改进方法，其主要的技术方法类似，这个技术叫抑制性扣除杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）【Anal. Biochem. 240, 90–97; PNAS. 93, 6025-6230】。成
详见《分子克隆》p. 873
详见《分子克隆》p. 872
cDNA扣除杂交
开始 (Adams et al., 1991)。
ESTs应用1：
ESTs与基因识别
ESTs已经被广泛的应用于基因识别，因为ESTs的数目比
GenBank中其它的核苷酸序列多，研究人员更容易在EST库
中搜寻到新的基因(Boguski et al., 1994). ● 在同一物种中搜寻基因家族的新成员(paralogs)。 ● 在不同物种间搜寻功能相同的基因(orthologs)。 ● 已知基因的不同剪切模式的搜寻。【注：不过很难确定一个新的序列是由于交替剪切产生的或是由于cDNA文库中污染了基因组DNA序列(Wolfsberg et al., 1997)】
● 污染序列 (如核糖体RNA、细菌或其它物种的基因组DNA等)
3. 去除其中的镶嵌克隆。
4. 最后去除长度小于100bp的序列。
镶嵌克隆的识别
► Back-to-back ► ►
poly(A)+ tails.
Linker-to-linker in middle of the sequence. Blastn/Blastx search.
1. 去除低质量的序列（Phred） 2. 应用BLAST、RepeatMasker或Crossmatch遮蔽数据组中不属于表达的基因的赝象序列(artifactual sequences)。 ●载体序列(ftp:///repository/vector) ●重复序列(RepBase，)
◆
3 ’端
3’端mRNA有一20－200bp的plyA结构，同时靠近plyA又有特异性的非编码区，所以从3’端测得EST含有编码的信息较少．但研究也表明，10％的mRNA3’端有重复序列，这可以作为SSR标记；非编码区有品种的特异性，可以作为STS标记．
◆
两端测序获得更全面的信息。
序列前处理 (pre-processing)
基本过程：分别抽提待测样本(tester）和对照样本（driver)的mRNA，反转录成
cDNA，用RsaI或HaeIII酶切，以产生大小适当的平头末端cDNA片段，将tester cDNA分成均等的两份，各自接上两种接头，与过量的driver cDNA变性后退火杂交，第一次杂交后有4种产物：a是单链tester cDNA，b是自身退火的tester cDNA双链，c是tester 和 diver的异源双链，d是driver cDNA。第一次杂交的目的是实现tester单链 cDNA均一化 (normalization),即使原来有丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致，由于tester cDNA中与driver cDNA序列相似的片段大都和driver形成异源双链分子c，使tester cDNA 中的差异表达基因的目标cDNA得到大量富集，第一次杂交后，合并两份杂交产物，再加上新的变性driver单链，再次退火杂交，此时，只有第一次杂交后经均等化和扣除的单链tester cDNA和driver cDNA一起形成各种双链分子，这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA，产生了一种新的双链分子e，它的两个5’端有两个不同的接头，正由于这两上不同的接头，使其在以后的PCR中被有效地扩增。
SSH的原理与基本过程
原理：SSH的基本原理是以抑制PCR为基础的DNA扣除杂交方法。所谓抑制PCR，是
利用链内退火优于链间退火，比链间退火更稳定，从而使非目的系列片段两端反向重复系列在退火时产生类似于“锅柄”的结构，无法与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。同时，该方法运用了杂交二级动力学原理，即丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致。
大于90％的已经注释的基因都能在EST库中检测到(Bailey et al., 1998)。ESTs可以做为其它基因预测算法的补充，因为它们对预测基因的交替剪切和3‘ 非翻译区很有效。
ESTs应用4：
ESTs与SNPs
来自不同个体的冗余的ESTs可用于发现基因组中转录区域
存在的SNPs。最近的许多研究都证明对ESTs数据的分析可以发现基因相关的SNPs (Buetow et al., 1999;Garg et al., 1999; Marth et al., 1999; Picoult-Newberg et al., 1999) 。应注意区别真正的SNPs和由于测序错误( ESTs为单向测序得来，错误率可达2％)而引起的本身不存在的SNPs。解决这一问题可以通过： ● 提高ESTs分析的准确性。 ● 对所发现的SNPs进行实验验证。
表达序列标签(EST)测定及分析
• 什么是EST?
• EST的应用
• EST序列测定及分析过程
ESTs的来源
上世纪80年代，对cDNA序列进行大规模测序的想法
就曾提出，但对此一直存在争论，有人认为这种方
法能发现成千上万的新基因；而反对者则认为cDNA 序列缺少重要的基因调控区域的信息。90年代初 Graig Venter 提出了EST的概念，并测定了609条人脑组织的EST，宣布了cDNA大规模测序的时代的
SSH 技术流程
二、序列测定及数据分析
随机挑取克隆进行5’或3’端测序
序列前处理
聚类和拼接
基因注释及功能分类
后续分析
测序方向的选择
根据不同的实验目的选择不同的测序方向：
◆
5 ’端
5’上游非翻译区较短且含有较多的调控信息。一般在寻找新基因或研究基因差异表达时用5’端EST较好，大部分EST计划都是选用5’端进行测序的，而且从5’端测序有利于将EST拼接成较长的基因序列。
ESTs应用5：
ESTs与大规模分析基因表达水平
因P 为研究癌症的分子机理，美国国家癌症研究所NCI的癌症基因组解析计划(Cancer Genome Anatomy Project , CGAP)构建了很多正常的或al Gene Expression Displayer (DGED) ● cDNA xProfiler