生物化学实验ppt课件

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实验原理
维生素C又名抗坏血酸，是水溶性维生素，具有很强的 还原性，在碱性和微酸性环境中，能还原2，6-二氯酚 靛酚成无色的还原型2，6-二氯酚靛酚，同时自身被氧 化成脱氢抗坏血酸。
氧化型的2，6-二氯酚靛酚在中性或碱性溶液中呈蓝色， 当用2，6-二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时， 在抗坏血酸尚未全部被氧化时，滴下的2，6-二氯酚靛 酚立即呈现无色，当溶液从无色转变成微红色时，即表 示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化，此时即为滴定终 点，可以算出被检物质中抗坏血酸的含量。
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(二) 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶垂直板状电泳 利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物。聚丙烯酰胺
凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺单体 和少量交联剂在催化剂、加速剂的作用下发生聚 合反应而制得的，利用电泳和分子筛的双重作用 分离物质，分辨力较高。血清蛋白在纸上电泳可 分为5~7个组分，而在聚丙烯酰胺电泳上可分出 12~25个组分。
生物化学实验
任课教师：李遂焰
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实验一
总糖的测定——蒽酮比色法
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实验要求
掌握蒽酮比色定糖法的原理和方法 掌握72型分光光度计的原理和操作方法 学习通过制作标准曲线测定未知物含量的方
法
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实验原理
糖类在较高温度下经浓无机酸作用脱水产生 糠醛或糠醛衍生物，可与蒽酮缩合成蓝绿色 化合物，颜色深浅与糖量成正比。
本法多用于测定糖原含量，也可用于测定葡 萄糖含量。
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实验内容与结果
1、制作葡萄糖标准曲线 2、测定样品含糖量 计算100克小麦面粉中总糖含量
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实验二
氨基酸的分离鉴定——纸层析法
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实验要求
学习分配层析法的原理 掌握氨基酸纸上层析的操作技术（包括点样、
平衡、展层、显色及鉴定）
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实验原理
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实验内容与结果
1、提取维生素C
2、用2，6-二氯酚靛酚钠溶液滴定标准维 生素C，计算1毫升2，6—二氯酚靛酚溶液 相当于抗坏血酸多少毫克。
3、用2，6-二氯酚靛酚钠溶液滴定样品维 生素C，计算100克样品所含维生素C的毫 克数。
蛋白而白蛋白不被沉淀，离心后白蛋白主要集中在上清液中， 而球蛋白主要在沉淀中。将球蛋白沉淀溶于少量水中，装于 透析袋，透析除去硫酸铵。脱盐后的蛋白质溶液，在0.0175 摩尔/升pH6.3磷酸缓冲液条件下加到DEAE—纤维素柱上，在 此pH下，DEAE—纤维素带正电荷，能吸附带负电荷的白蛋白、 α-及β-球蛋白，仅γ—球蛋白不能吸附而直接流出。
算各氨基酸的Rf 值。
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实验三
蛋白质的等电点测定及沉淀反应
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实验要求
了解蛋白质的两性解离性质 学习测定蛋白质等电点的一种方法 通过实验加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的
认识 区分可逆沉淀反应及不可逆沉淀反应并了解
其实用意义 了解蛋白质变性及沉淀的关系
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一、蛋白质的等电点测定
原理： 蛋白质是两性电解质，其解离状态和程度受溶液的
蛋白质的沉淀反应可分为两类：
1）可逆沉淀反应：如盐析作用，等电点沉淀蛋白质等。 提纯蛋白质时，常用此类反应。
2）不可逆沉淀反应：如重金属盐、生物碱试剂、过酸、
过碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白
质发生不可逆沉淀而析出。
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操作 1．蛋白质的盐析作用 2．重金属沉淀蛋白质 3．有机酸沉淀蛋白质 4．有机溶剂沉淀蛋白质 5．生物碱试剂沉淀蛋白质
色沉淀即有蛋白质析出。合并蛋白质含量高的洗脱
液，以备鉴定。
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（二） 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶垂直板状电泳 1．凝胶板的制备：板状电泳槽按要求夹好、固定，
用1%琼脂封边，并按比例配制凝胶，灌入凝胶板。 2．样品的准备：样品中加入样品稀释液，内含溴
酚兰为示踪染料。 3．电泳：将上电泳槽的电极接电泳仪的负极，下
纸层析法是以滤纸作支持物，纸纤维上的羟 基具有亲水性，能吸附一层水作固定相，而 与水不相混合的有机溶剂作流动相，因此利 用分配层析原理，不同物质在两相间有不同 的分配系数而在纸上移动的距离不同，即被 分开。
本实验分离的是混合氨基酸样品，层析之后 用茚三酮试剂显色。
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实验内容与结果
1、点样 2、展层 3、显色 用铅笔描出显色斑点的形状，测其距离并计
电泳槽接正极，调节电压为150伏，电泳约1小时。 4．剥胶 5．固定、染色、脱色
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实验结果
将分离纯化的蛋白质收集，经电泳分离并与 标准蛋白质作对照，绘出电泳图谱。
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实验五
维生素C的定量测定 ——2，6-二 氯 酚 靛 酚 法
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实验要求
学习定量测定维生素C的原理和方法。 掌握微量滴定法的基本操作技术。
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实验内容
百度文库
（一） 血清γ—球蛋白的分离纯化
1．硫酸铵盐析 ：注意应缓慢滴入饱和硫酸铵溶液 并边加边摇，避免局部浓度过高。
2．透析脱盐：用纳氏试剂检查水中NH4+，直至硫酸 铵全部透析完毕。
3．DEAE—纤维素柱层析：装柱、平衡柱床、上样、 洗脱收集。
4．检查洗脱液中蛋白质：磺基水杨酸检查，出现白
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实验四
血清γ—球蛋白的分离、纯化及鉴定
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实验要求
初步学会分离、纯化蛋白质的常用方法并了 解其原理。
学习盐析、层析基本原理及实验技术。 掌握电泳基本原理，熟悉操作方法，了解影
响电泳的因素。
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实验原理
（一）血清γ—球蛋白的分离 血清蛋白质先用盐析初步分离。半饱和硫酸铵可沉淀血清球
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二、蛋白质的沉淀反应
原理：
蛋白质是一类高分子化合物，分子大小已达胶体颗粒 范围（1~100毫微米）,因此蛋白质在水溶液中具有胶 体的性质。维持蛋白质胶体稳定的因素有两个：一是 胶体颗粒所带的电荷，一是与介质水形成的水化膜。 这种稳定性是有条件的、相对的，在一定物理化学因 素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而 丧失稳定因素，从溶液中析出，这种作用称为蛋白质 的沉淀反应。
酸碱度影响。在等电点（pI）时，蛋白质的理化性 质有变化，可利用性质的变化测定蛋白质pI。常用 的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。本实验借 观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电 点。 操作： 用醋酸和醋酸钠配制成各种不同pH值的缓冲液。向 诸缓冲液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液 的pH值即为酪蛋白的等电点。