附子总生物碱含量测定方法比较

附子总生物碱含量测定方法比较

何　军1,2,祝　林1,奉建芳1

(1.上海医药工业研究院药物制剂部,上海200437;2.四川大学华西药学院,四川成都610041)

摘要:目的　比较滴定法和紫外分光光度(UV )法在测定附子总生物碱中差异,探讨适宜附子总生物碱的含量测定方法。方法　用两种方法测定相同样品,比较测定结果差异,并考察操作步骤对测定结果的影响。结果　两种不同的测定方法对附子总生物碱含量测定结果有较大的影响,滴定法的加样回收率为97.7%,而

UV 法为75.6%,滴定法测定结果更准确。水分及萃取静置时间对UV 法测定结果有一定影响。结论　附子

总生物碱含量测定以滴定法(药典法)为宜,紫外分光光度法用于其测定有待于进一步改进。 关键词:附子;附子总生物碱;含量测定

中图分类号:R 284.2 文献标识码:A 文章编号:100422199(2003)0620020203

中药川乌、草乌、附子等其主要有效成分为总生物碱,虽然含量较低[1],但因药理作用强、有一定的毒性,常作为中药的制剂质量控制的指标。2000版中国药典中有关总生物碱的含量测定方法为滴定法[2],文献中多采用紫外分光光度法[3,4],但哪一种方法更灵敏、准确和具有更好的重现性,文献中并未见报道。本文以附子提取物作为样品,对这两种方法用于测定附子总生物碱的含量进行比较研究,为含该类成分的中药制剂的质量控制提供实验依据。1　仪器、材料与试剂

仪器:7512G W 分光光度计(安捷伦科技上海分

析仪器有限公司)。

材料:乌头碱对照品(中国药品生物制品检定所,批号:072029807)。制附子(上海雷允上中药饮片厂)。所用试剂均为分析纯。2　实验方法与结果2.1　样品溶液制备

取制附子药材适量,粉碎成中粉,加85%的乙醇溶液加热回流2次。醇提液经回收乙醇、浓缩、调pH 、

过滤后得提取液。提取液经大孔吸附树脂分离纯化,收集80%醇洗脱液,经减压浓缩与药材量相当后所得溶液作为样品溶液。

2.2　滴定(药典)法测定附子总生物碱含量精密量

取样品液20.0m l 蒸干,残渣以少量水溶解,置分液漏斗中,以氨水调pH =10～11,氯仿萃取5次(10,10,10,8,8m l ),合并氯仿液,回收氯仿,水浴挥干,残渣用乙醇5.0m l 溶解,精密加入硫酸滴定液(0.01m o l L )15m l 、水15m l 与甲基红指示液3滴,用氢氧化钠滴定液(0.02m o l L )滴定至黄色,

读取消耗的N aO H 溶液的量,计算总生物碱的含量

[每1m l 硫酸滴定液(0.01m o l L )相当于12.9m g 的乌头碱(C 34H 47NO 11)]。

2.2　紫外分光光度(U V )法测定附子总生物碱含量[4]

2.2.1　对照品溶液制备　精密称取12.0m g 乌头

碱对照品于50m l 的容量瓶中,加1m o l L 盐酸溶液数滴,溶解,加等量1m o l L N aO H 溶液,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,即得浓度为0.24m g m l 的对照品溶液。

2.2.2　标准曲线的制备　精密量取乌头碱对照品

液0、0.35、0.40、0.50、0.80、1.00m l ,分别置于分液漏斗中,各加蒸馏水3.00、2.65、2.60、2.50、2.20、2.00m l ,加溴麝香草酚蓝指示液2.0m l ,邻苯

二甲酸氢钾2氢氧化钠(pH =6)缓冲液5.0m l ,加氯仿10m l ,振摇3m in ,静置1h ,分取氯仿液,并加入

0.5g 无水硫酸钠,放置0.5h ,以第一份为空白,于410nm 处测定吸收度,计算回归方程,A =0.0035

M -0.0869,r =0.9999,乌头碱含量在84～240Λg 范围内线性关系良好。

2.2.3　样品测定方法　取上柱洗脱液5.0m l 蒸

干,残渣以少量水溶解,置分液漏斗中,以氨水调pH

=10～11,氯仿萃取5次(10,10,10,8,8m l ),合并氯仿液,回收氯仿,水浴挥干,残渣用少量1m o l L 盐酸溶解后,加入等量的1m o l LN aO H 溶液,用蒸馏水定容至25m l ,摇匀。精密吸取2.00m l ,按标准曲线项下测定总生物碱含量。结果见表2。2.3　两种测定方法含量测定结果的比较

取同一样品溶液,分别用上述两种测定方法各

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测定样品三份。结果见表1。

表1　两种方法样品溶液中附子总生物碱含量结果

方法样品含量测定结果(m g m l)R SD(◊)P

滴定法0.6577±0.00681.02<0.01 UV法0.2903±0.02157.40

结果表明,两种不同测定方法所测得的结果相差很大(P<0.01),且滴定法重现性要优于U V法。

2.4　两种测定方法加样回收率测定结果　取上述测定含量的样品溶液6份,每份10m l,分别加入乌头碱对照品溶液10m l,按两种不同的测定方法操作各测定样品3份并计算回收率。结果见表2。

表2　测定方法的加样回收率

方法样品中附子总生物碱

含量(m g)

加入乌头碱

的量(m g)

测得附子总生物碱量(m g)

123

加样回收率(%)

123

平均加样回收率

(%)

滴定法6.5772.4008.8288.9319.00693.898.1101.297.7 UV法2.9032.4004.8734.4994.78282.166.578.375.6

结果表明,滴定法用于测定附子总生物碱的含量,具有较高的回收率,符合药典的有关规定。而U V法的回收率较低,准确性较差。

2.5　U V法测定附子总生物碱含量的影响因素

2.5.1　水分对含量测定的影响　考察用无水硫酸钠除去水分对结果测定的影响,按样品测定方法操作一份,另一份除不采用无水硫酸钠脱水的步骤外,其余按样品测定方法操作。结果见表3。

表3　两种方法附子总生物碱测定结果

方法吸收度(A)

未加入硫酸钠A值不稳定,无法读取

加入硫酸钠0.262

2.5.2　萃取静置时间对含量测定的影响　量取同一样品液4份,每份5m l,按样品测定方法测定,萃取静置时间分别为30、45、60、90m in,结果见表4。表4　萃取静置时间对测定结果的影响

时间(m in)吸收度(A)

30吸收度值波动太大,无法读取

45吸收度值有波动

600.224

900.304

2.5.3　萃取步骤对含量测定的影响　取同一样品液6份,每份5.0m l,三份按2.2.3项下测定,记为方法①;另外三份按以下方法进行测定,记为方法②:取上柱洗脱液5.0m l蒸干,残渣用少量1m o l L 盐酸溶解后,加入等量的1m o l LN aO H溶液,用蒸馏水定容至25m l,摇匀。精密吸取2.00m l,按标准曲线项下测定总生物碱含量。结果见下表5。

表5　方法 和 测定结果

方法样品含量测定结果(m g m l)R SD(◊)P

①0.2568±0.025710.02<0.01

②0.4204±0.03107.37

从表5可以看出,方法①和方法②测定的结果差异较大,方法②测定结果偏高,说明残渣用氯仿萃取中,生物碱损失较多,这可能主要是因样品在萃取中易产生乳化,导致测定结果有较大的差异。

3　讨论

上述试验结果显示,对于同一样品,采用滴定法和紫外分光光度法进行附子总生物碱的含量测定,结果差异明显(相差近两倍)。从测定结果上看,滴定法准确性、稳定性要优于紫外分光光度法,但滴定法灵敏度较低,测定所需样品量多,而紫外测定操作步骤繁琐,测定结果重现性较差。造成紫外分光光度法测定附子总生物碱准确性与稳定性差的原因可能有:①分光光度法测定对象以酯型生物碱为主,而不是附子所含生物碱的全部;②测定操作步骤较多,使测定的成分在操作过程中有所损失;③影响测定的因素较多,重现性不好,平行操作的两份样品,结果可以相差很大。实验中,我们还考察了影响紫外测定的各种因素,发现微量水分的存在、萃取静置的时间短可导致吸收值读数不稳定,因此,紫外测定中须用无水硫酸钠脱去微量水分,且放置时间应不少于30 m in,紫外测定中的萃取静置时间应不少于1h。鉴于此,笔者建议,对于附子总生物碱的测定,应用滴定法较为适宜,如果仅限于测定附子中的酯型生物碱,则可采用分光光度法,但要注意严格操作。

参考文献

[1]　郑虎占,董泽宏,佘　靖.中药现代化研究与应用(三卷)[J].北

京:学苑出版社,1998.2568.

[2]　国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京:化学工业出版社,

2000.29.

[3]　邹恩济.那鲁注射液中草乌总碱的酸性染料比色测定法[J].中

草药,1986,17(12):9.

[4]　陈其华,范丽霞.中成药中乌头总碱的酸性染料比色测定法

[J].中国中药杂志,1991,16(8):476.

[5]　杨　桦,邓晓静,易　红.大孔吸附树脂用于川草乌中总生物碱

的分离提取[J].中成药,2000,22(8):536.

(收稿日期:2003209230)

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