定点突变
pcr定点突变技术原理
pcr定点突变技术原理
PCR定点突变技术是指基于聚合酶链反应技术和脱氧核糖核酸（DNA）技术，通过检测特定位点的特定DNA序列，以及该特定位点在
基因突变中发生变化的方法。
该技术通过引入多个PCR扩增特定序列，并在PCR产物中检测突变位点。
整个PCR定点突变分析流程包括：DNA
提取、PCR扩增、筛选、突变检测、数据分析等步骤。
第一步，先从患
者的脱氧核糖核酸（DNA）样本中取出要检测特定位点的特定DNA序列；第二步，涉及倍性引物的PCR扩增得到的DNA复制物，称为弧菌状病
毒（HCV）；第三步，以线性化步骤将弧菌状病毒和分子材料分离出来，生成紫外可见化质粒，只保留差异片段；第四步，读取所有特征模式，以获得有效的特征模式，以及发现相关的突变和多态性；第五步，通
过对所有样本进行数据挖掘来识别单项显著突变，以确定检测突变位
点的实验结果。
PCR定点突变技术是一种快速、准确的技术，使得迅速检测基因变
异和检测新发现的个体基因变异变得可能，完成病原菌或其他物质的
突变检测，为基因治疗、基因疾病的诊断和治疗，基因改造有重要的
应用前景。
定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变是指在基因组中特定的位置发生的变异事件。
这些定点
突变可以是单个碱基的替代、插入或删除，也可以是染色体片段的重排和
结构变化。
基因定点突变是遗传学和分子生物学研究中的重要技术，具有
广泛的应用前景。
在基因定点突变的研究中，常用的方法包括基于随机突变和基于定点
突变的方法。
一、基于随机突变的方法：
1.化学诱变：通过化学物质如亚硫酸乙基甲酯(EMS)或N-亚硝基-N-
乙基脲(ENU)等诱导基因组范围内的突变。
这些突变通过对群体进行筛选
和筛选，从而找到目标基因的突变。
2.辐射突变：用射线如X射线、γ射线，或放射性物质如乙烯基腈，等辐射处理生物体，以诱导其基因组上的随机突变。
基于随机突变的方法广泛应用于物种、疾病、发育和进化等研究中。
它们可以帮助揭示基因功能的重要性和与特定物种和表型相关的基因。
二、基于定点突变的方法：
1.基因敲除/敲入：通过合成受损的DNA片段或外源DNA片段，将其
导入到目标基因中，从而造成其功能异常或置换为新的基因序列。
这种方
法可用于明确或验证基因的功能，并探索特定突变的表型影响。
定点突变
1.1.1基因定点突变简介（INTRODUCTION）定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR）►搭桥法（重叠PCR）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
搭桥法定点突变PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE）1.两对引物的Tm值都应相当。
两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2.对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’完全互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’部分互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’部分互补一对中间位置的点突变引物设计3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。
基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
定点突变
1.1.1基因定点突变简介（INTRODUCTION）定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR）►搭桥法（重叠PCR）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
搭桥法定点突变PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE）1.两对引物的Tm值都应相当。
两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2.对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
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基因的定点突变的原理
基因的定点突变的原理基因的定点突变是指在DNA序列中的特定位置发生的突变，即碱基序列的改变。
这种突变发生在特定的位置，通常是基因编码区域，会引起氨基酸序列的改变，从而对蛋白质的功能产生影响。
定点突变的原理主要涉及以下几个方面：1. 突变的起源：定点突变可以是自发发生的，也可以是由外部因素引起的。
自发突变通常是由DNA复制过程中的错误引起的，包括碱基替换、插入或缺失等变异。
而外部因素如辐射、化学物质等也可能引起DNA损伤并导致定点突变。
2. 碱基替代：定点突变最常见的形式是碱基替代，即一个碱基被另一个碱基替代。
这种替代可能是同义突变，即替代后的密码子依然编码相同的氨基酸。
也可能是错义突变，即替代后的密码子编码不同的氨基酸，从而改变蛋白质的结构和功能。
3. 密码子的改变：在定点突变时，被替代的碱基往往位于密码子序列中的特定位置。
这种替代可能导致密码子的改变，从而改变蛋白质的翻译过程。
例如，突变可能导致起始密码子的改变，影响蛋白质的翻译起始，或者导致终止密码子的改变，影响蛋白质的翻译终止。
4. 功能影响：定点突变引起的氨基酸序列的改变可能会影响蛋白质的结构和功能。
如果突变发生在蛋白质的活性位点或功能域内，可能会影响蛋白质的结合能力、催化能力或信号转导等功能。
这种影响可能是有益的，例如产生对环境更有优势的适应性变异，也可能是有害的，例如导致疾病的发生。
总之，定点突变是指DNA序列特定位置发生的突变，可能是自发发生的或由外部因素引起的。
突变可以是碱基替代，导致密码子的改变，进而影响蛋白质的结构和功能。
这些突变的结果可能是有益的适应性变异，也可能是有害的疾病突变。
定点突变技术
操作：设计引物，分别PCR，前两次PCR 反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后无需 纯化,直接将胶条切下置于EP管中, 80℃冷冻10min,然后将胶条离心后分 别取上清液作为模板进行第三次PCR,以 获得全长的突变目的基因
PCR介导的定点突变法其优点是操作较简 单，突变的成功率可达100%。但它亦 有两个缺点:①后续工作较复杂，PCR扩 增产物通常需要连接到载体分子上，然
寡核有酸引物介导的定点突变 法其优点是保真度比PCR突变法 高，经过改进后使该方法突变少 成功率大大提高，缺点是操作过 程环节复杂制。
盒式突变法具有简单易行、突变效率高 等优点，还可以在一对限制酶切位点内 一次突变多个位点。缺点是合成多条引 物的成本较高。另外，在一般情况下， 在靶DNA片段的两侧往往难以满足存在 一对限制性酶切位点的要求，限 制了该 方法的广泛应用。然而一旦具备了这样 的条件该方法则为首选。
定点突变技术
刘微
基因的定点突变技术
点突变的技术有很多种，常见的有： ㈠寡核苷酸介导的定点突变技术
（M13噬菌体法） ㈡ 盒式诱变 ㈢PCR点突变技术
1.引物PCR定点诱变法 2.重组PCR定点诱变法 3.重叠延伸PCR技术
寡核苷酸引物诱变技术 （M13噬菌体）
噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在噬菌体 粒子中其基因组为单链，侵入宿主细胞以后， 通过复制以双链形式存在。将待研究的基因 插入载体M13，制得单链模板，人工合成一 段寡核苷酸（其中含一个或几个非配对碱基） 作为引物，合成相应的互补链，用T4连接酶 连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双 链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类 型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。
重组PCR定点诱变2
操作：设计引物，分别PCR， 从两个PCR反 应管中各取出3μl PCR反应产物,混匀后用 CaCl2转化法转化至感受态大肠杆菌中。涂 平板后,从转化的细菌菌落中随机挑选若干,筛 选。
点突变
定点突变定点突变原理图定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
意义体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。
蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红定点突变移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
单点突变对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。
准备突变的质粒必须是从常规E.coli 中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。
设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。
定点突变
周赞虎等人采用快速PCR定点突变方法成功地对 hCu,Zn-SOD进行了基因改良，即将hCu,Zn-SOD 基因中非活性中心的Cys111密码子突变为Ala密码 子，以提高其稳定性。 朱大兴等人对该试剂盒试验规程进行了改良， 利用实验室的常规试剂进行定点突变，并指出PCR 突变反应产物能被琼脂糖电泳检测到是非常重要的， 因为这样有利于分析试验成败的原因。 周兴等人以定点突变方法对325RLDRD32基序 的带电荷氨基酸进行突变，并构建R325D、R328A、 R328D、R328Q和D329N五个突变体。
1988年，ein首次将其用于植物转基因研究，克服了当时农杆菌 介导的转基因方法的受体种类和基因型的限制，开创了植物转基 因方法的新领域。McCabeetal利用基因枪法转化大豆幼胚和成 熟胚的下胚轴获得了转基因再生植株。 1990年，From示etal利用基因枪法成功转化T玉米胚性愈伤组织 。同年Fine:andMcmullen(1990)用陆地棉柯字310的胚性悬浮系 进行的基因枪转化。获得了10个再生植株，较农杆菌介导的遗传 转化，所用的再生时间较短(5个月)。其后，MeCabeandM inell 报道T基因型独立的基因枪转化方法。 1994年，Hieital通过使用农杆菌侵染诱导剂乙酞丁香酮(AS)以及 构建巧rG和巧rB高效表达的超双元载体，高效成功地转化了水稻 。利用该转基因系统，Ishidaetal(1996)、Tingayetal(1997)和 Chengetal(1997)相继获得了玉米、大麦和小麦的转基因植株。
八、参考文献
1.定点突变技术的研究进展
2.植物基因定点突变与定点置换技术及其在植物遗传改良中的应用
3，基因定点突变技术简介
谢谢观赏
七、应用前景
《基因的定点突变》课件
基因定点突变的意义
基因定点突变有助于深入了解基因的 结构和功能，揭示生命活动的本质和 规律。
通过基因定点突变技术，可以实现对 特定基因的精确调控，为疾病治疗、 新药研发、生物育种等领域提供有力 支持。
基因定点突变的分类
筛选方法包括抗生素筛选、PCR鉴定 等，根据实验需求选择合适的方法。
04 基因定点突变的实验结果分析
突变基因的鉴定
01
02
03
突变基因的识别
通过DNA测序技术，对突 变基因进行精确的识别和 定位。
突变类型的分类
根据突变碱基的数量，将 突变基因分为点突变、插 入和删除突变等类型。
突变位点的统计
统计突变位点的分布和频 率，分析突变热点和区域 。
根据突变的方式，基因定点突变可分为碱基替换突变和插入/ 缺失突变。
根据突变的目的，基因定点突变可分为正向突变和反向突变 。正向突变是指将野生型基因突变为功能变异型基因，而反 向突变是指将功能变异型基因突变为野生型基因。
02 基因定点突变的方法
逆转录酶法
总结词
逆转录酶法是一种利用逆转录酶将RNA转化为cDNA的方法，适用于基因的定 点突变。
03
引物长度一般在1530bp之间，以保证足够 的特异性。
04
引物设计还需考虑突变 后可能的遗传信息改变 ，如密码子改变等。
合成突变基因
在成功设计引物后， 需通过DNA合成仪 合成突变基因。
合成后的突变基因需 进行质量检测，确保 其准确性。
合成过程中需确保突 变位点的准确性，避 免其他位点的突变。
锌指核酸酶法
总结词
酶的定点突变技术名词解释
酶的定点突变技术名词解释酶是一类生物催化剂，它们在细胞中发挥着关键的代谢调控和生物转化作用。
酶的活性和特异性使其成为许多生物学和工业化学反应的理想工具。
然而，酶的天然特性往往限制了它们在特定反应中的应用。
为了克服这些限制，科学家们发展了定点突变技术，通过改变酶的氨基酸序列，创造新的催化性质和生物活性。
定点突变是指通过人工改变特定氨基酸残基的DNA序列，从而改变蛋白质的结构和功能。
具体来说，酶的定点突变技术主要包括以下几个步骤：第一步是选择目标酶和目标位点。
目标酶通常是与特定反应相关的酶，目标位点则是位于酶的氨基酸序列上的某个位置。
第二步是设计突变体的DNA序列。
这一步骤需要根据目标位点的氨基酸残基，计划突变成新的氨基酸残基。
在设计DNA序列时，需要考虑到新的氨基酸残基是否具有所需的功能和稳定性。
第三步是合成改造DNA序列。
一旦设计好突变体的DNA序列，科学家们可以利用现代生物学技术进行合成。
合成DNA序列的方法包括化学合成和基因克隆。
第四步是转化突变体DNA到宿主细胞中。
这一步骤通常采用基因转导或转化技术，将改造后的DNA序列导入到酵母、细菌或其他宿主细胞中。
第五步是筛选和分离突变体。
转化后，科学家们需要筛选出突变体细胞，并通过分离技术将突变体分离出来。
常用的筛选方法包括基因构建、蛋白质表达和酶活性分析。
最后，通过酶活性和生物学性质的分析，科学家们可以评估这些突变体的性能。
这些性能评估结果有助于科学家们理解酶的结构和功能之间的关系，并为进一步的改良和应用提供指导。
定点突变技术的发展为酶的研究和应用带来了新的可能性。
通过改变酶的氨基酸序列，科学家们可以调控酶的催化性能、特异性和稳定性。
这些改变使得酶能够在更广泛的反应条件下发挥作用，并具有更高的催化效率和选择性。
此外，定点突变技术还为工业生产和药物研发提供了一种有效的手段。
通过改造酶的特性，科学家们可以设计出更高效、更环境友好的工艺和药物。
总而言之，在酶的定点突变技术的探索中，科学家们通过改变酶的氨基酸序列，成功创造出了新的催化效果和生物活性。
基因定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’-CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
基因定点突变的原理和实验过程
基因定点突变的原理和实验过程嘿，咱今儿就来聊聊基因定点突变这档子事儿！你说这基因啊，就好比是生命的密码本，那定点突变呢，就是给这个密码本做点小修改。
想象一下，基因就像是一条长长的绳子，上面串着好多好多的信息。
而定点突变呢，就是要在这根绳子上精准地找到一个位置，然后把它给变一变。
这可不是随随便便就能干的事儿，得有一套原理和方法才行。
简单来说，基因定点突变的原理就是通过一些特定的技术手段，让我们想要改变的那个基因位点发生特定的变化。
这就好像是在一个复杂的地图上，准确地找到一个小点，然后给它标上不一样的颜色。
那实验过程呢，那可真是精细活儿。
首先得准备好各种材料和试剂，就像厨师做菜得准备好食材一样。
然后呢，要设计好突变的方案，这可得深思熟虑，不能马虎。
接下来，就是一系列复杂的操作啦。
比如说，得把基因片段提取出来，这就好比是从一大包东西里找出我们要的那个小物件。
然后呢，用各种酶啊、试剂啊去处理它，让它按照我们的想法发生变化。
这过程可不简单，就跟走迷宫似的，一个不小心可能就走错路了。
在实验过程中，每一步都得小心翼翼，就跟绣花似的。
稍微有点差错，可能就前功尽弃啦。
你说这是不是很考验耐心和技术啊？而且啊，这可不是一次就能成功的事儿。
有时候得反复尝试好多遍，就跟解一道很难很难的数学题一样，得不断地尝试不同的方法。
做完这些还不算完呢，还得检测突变是不是成功了。
这就好比是考试结束了，得看看自己考得咋样。
要是没成功，那就得重新再来一遍。
基因定点突变的研究，那可是对生命科学有着重要意义的呀！它能让我们更好地了解基因的功能，为治疗各种疾病提供新的思路和方法。
总之呢，基因定点突变可不是件容易的事儿，但它的意义和价值那可是大大的。
咱可得好好研究，说不定哪天就能给人类带来巨大的福音呢！这就是基因定点突变，神奇又充满挑战的领域！你难道不想深入了解一下吗？。
定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
dpn1定点突变原理
dpn1定点突变原理
dpn1定点突变原理是一种基因突变分析方法，用来确定基因序列中的突变位点。
该原理利用特定引物扩增基因序列，并采用基因测序技术对扩增产物进行测序。
在测序过程中，引物中的特定核苷酸位点会发生突变，形成两个不同的碱基。
通过比较突变位点上的碱基组成，可以确定基因序列中的突变。
dpn1定点突变原理可用于分析基因的单碱基多态性（SNP）和小片段内的插入/缺失变异。
该方法能够高效、准确地检测基因突变，并广泛应用于基因突变鉴定、疾病诊断和研究等领域。
该原理的关键是选择合适的引物和测序方法，以确保突变位点上的碱基能够被准确测序。
此外，为了提高检测的特异性和敏感性，还可以结合其他方法，如聚合酶链反应（PCR）、限制性内切酶切割等。
总之，dpn1定点突变原理是一种可靠、高效的基因突变分析方法，对于研究和诊断基因突变具有重要意义。
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1.1.1基因定点突变
简介（INTRODUCTION）
定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR）
►搭桥法（重叠PCR）定点突变
搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
搭桥法定点突变
PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增
PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增
实验步骤（PROCEDURE）
1.两对引物的Tm值都应相当。
两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突
变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2.对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，
也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’
完全互补
5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’
部分互补
5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’
部分互补
一对中间位置的点突变引物设计
3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为
引物对扩增。
两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
（注意前两次不能使用taq聚合酶，因为taq在产物3’ 端多加一个A，导致后续的PCR3出现移码突变）
4.克隆：回收PCR3产物，酶切，连接，转化。
►一步法定点突变
一步法是以质粒为模板，考虑扩增效率需将正向引物和反向引物分开扩增，避免二聚体的产生。
原理如图
实验步骤（PROCEDURE）
5.引物设计：设计一对含有目标突变的引物，除所需要引入的突变位点外，其余序列与质粒模
板完全匹配。
不同于搭桥法的一对中间引物，全质粒PCR法的一对引物最好不是完全配对，因为这对引物是放在一个PCR反应中，完全配对极易形成引物二聚体，而不是与模板质粒结合。
这就要求两条引物间配对区域的Tm值要小。
6.PCR。
PCR1：质粒+正向引物扩增，PCR2：质粒+反向引物扩增。
两次PCR均按照常规PCR
程序进行，不同的是只反应12个而不是30个循环。
PCR3：PCR1和PCR2反应完成后，将二者体系混合成一个体系并补加适量的高保真聚合酶（如Pfu 或Pfu-X1），然后按照常规PCR程序继续反应16个循环。
▲关键步骤：
♫不能用taq酶，一是taq酶无3’-5’外切酶活性导致保真性差，全质粒PCR片段长，易出现非目标突变。
二是因为taq酶具有5’-3’外切酶活性这就导致当PCR以质粒
为模板复制一圈回到最初引物位置时，原有引物会被外切导致引入的突变又变回
野生型质粒的序列。
♫为防止非目标突变，PCR循环数不要太多（建议不超过25个cycle）
♫在质粒能正常扩增的前提下，应尽量减少质粒模板使用量以免模板质粒消化不完全背景增加。
（酶切和PCR都无法区分）
7.PCR产物的甲基化酶处理
8.待突变的质粒通常来源于DH5α等dam+大肠杆菌，在这些dam+细菌中质粒会被甲基化修
饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。
这样用特异性识别甲基化位点的酶DpnI处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来（DpnI酶只消化甲基化的DNA）。
随后把DpnI处理过的产物转化感受态细菌后，突变质粒中的两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。
9.向PCR产物中加入1 μL DpnI酶和4 μL的10× NEB cutsmart buffer消化模板质粒置于37°C
反应1 h，取出5 μL跑胶检测，剩余的取部分做细菌转化，涂板。
筛选转化子，测序。