灰葡萄孢菌的细胞形态观察及菌种保存

野生型与突变型灰葡萄孢菌的细胞形态观察及菌种保存

1.实验目的

通过灰葡萄孢菌的培养实验，观察灰葡萄孢菌生长过程中菌丝形态的变化及孢子的萌发过程；

通过对灰葡萄孢菌孢子的活化与复壮，保存活力强的菌种。

2.实验内容

野生型及突变体灰葡萄孢菌的培养、菌丝形态的观察；

野生型及突变体灰葡萄孢菌的活化、复壮及保存。

3.实验材料

3.1实验菌株

灰葡萄孢菌是从典型的患灰霉病的番茄上分离并进行了单孢培养，由浙江大学农业与生物技术学院李红叶教授实验室提供；灰葡萄孢菌突变体由本实验室通过紫外诱变获得。3.2仪器

电子天平，高压灭菌锅，酸度计，蒸馏水器，超净工作台，恒温培养箱，显微镜

3.3 试剂

PDA培养基：称取马铃薯200g，洗净，去皮，切成小块，加入1000ml水中煮沸30分钟，再用纱布过滤煮过的马铃薯，弃残渣，在滤液中加入蔗糖20g，1.5%琼脂粉，充分溶解，再用蒸馏水定容至1000ml，分装三角瓶，置高压蒸汽灭菌锅中，0.1Mpa的大气压、121℃条件下，灭菌20min，室温冷却待用。

4 .实验方法与步骤

4.1血球计数板的使用

血球计数板是一个大方格分成25个中方

格，而每个中方格又分成16个小方格，总共

400小格。

(1)将孢子从培养皿的菌丝上洗下来。

(2)稀释孢子至每小方格内含有4-5个孢子为宜,

一般稀释10倍即可。

(3) 将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数

室上加盖专用的盖玻片。

(4)将稀释后的孢子悬液,用移液器吸取一滴置

放大后的计数室

于盖玻片的边缘,使孢子悬液液缓缓渗入,多余

的菌液用吸水纸吸取,稍待片刻,使孢子悬液全部沉降到血球计数室内。

(5)计数时,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的细胞数。

(6) 位于大格线上的孢子,一般只计数大方格的上方和右方线上的孢子(或只计数下方和左方线上的孢子)。

(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数。

细胞数/ml=(80小格内的细胞数/80)×400×1000×稀释倍数。

4.2野生型灰葡萄孢菌的活化

取PDA 培养基在超净工作台内倒平板，培养基冷却凝固后将野生型和突变体灰葡萄孢菌

的菌种用接种环挑取少量分别放入各个培养皿中，记号笔标记菌种、接种时间，将培养皿放入28℃培养箱中倒置培养，第一次活化时间为一周，待其菌丝变为灰绿色长满平皿后，再按照上述方法进行二次活化。

4.3菌株的培养与观察

在紫外灯灭菌20min后的超净工作台中，对已制备培养基进行编号，并将已灭菌培养

基移取少许置于已备载玻片上制成固体培养基。培养基凝固后将野生型灰葡萄孢菌孢子悬液

接种于已置培养基的载玻片上，为防止培养基干燥接种前可用移液枪移取适量灭菌水于培养

皿底部滤纸上，用记号笔作标记，记下接种日期与时间，将其置于恒温培养箱（28℃）中进

行培养。培养期间每隔12h，重复上述操作，直至第六号培养菌培养12h后，打开培养皿盖，取出载玻片，将1至6号培养菌依次置于显微镜下观察并拍照。观察野生型灰葡萄孢菌孢子

萌发、芽管、菌丝和菌落形态。

4.4灰葡萄孢菌孢子悬液的制备

活化后的灰葡萄孢菌再培养7天（28 ℃），待菌体产生孢子即可。用无菌水洗菌体数次得到孢子悬液，孢子悬液用血球计数板计数，将孢子悬液的浓度稀释到2×105个孢子/ml待用。

4.5灰葡萄孢菌的复壮

选取四个大小相近、相对成熟、无损伤的番茄，在超净工作台内用解剖刀分别撕去一平方厘米区域大小的表皮，并在这些区域用分别接野生型和突变体灰葡萄孢菌孢子悬液，用记号笔分别标记（野生型CK,突变体TG)。找一长方体或正方体盒子，去掉盖子用细线将其缠绕形成网状顶部，取适量无菌水倒至底部，将接有孢子悬液的番茄置于其网状顶平面，保鲜膜将其密封，于28℃下培养二至三天，观察菌种生长情况，并拍照。

5实验结果

通过观察野生型灰葡萄孢菌在培养基上的萌发状态，发现野生型灰葡萄孢菌生长12h

萌发长出单极性芽管，24h菌丝分支，36h后长满菌丝，分支增多， 48h时形成分生孢子头，部分开始散发分生孢子，60h时散发分生孢子，72h时分生孢子散发完，部分还在散发分生

孢子（图1）。通过观察不同时段野生型灰葡萄孢菌在培养基上的菌落生长状态，发现24h

时培养基上无肉眼可见菌落长出，36h时有明显的菌落长出，48h长满整个培养基，60h长

至培养基边缘，72h有更多菌丝长出，菌落颜色加深（图2）。野生型和突变体孢子侵染番茄，置室温下均有菌丝长出，说明两类孢子均具有侵染活性（图3）。

12h 24h 36h

图1野生型灰葡萄孢菌不同时段的细胞生长形态

图2 野生型灰葡萄孢菌不同时段菌落生长形态

图3野生型和突变体灰葡萄孢菌侵染番茄

48h 60h 72h

12h 24h 36h 48

h 60h 72h

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