三HPLC分析方法的建立

正相色谱保留机理
正相分析方法建立的推荐方法：
1.调整%B，使0.5<K<20，（氰基柱、己烷-丙醇做流动相） 2.检查峰拖尾现象 3.如必要，调整选择性 a.微调%B
b.改变有机溶剂种类（MC、MTBE、EtAc） ；微调%B
c.混合有机溶剂 d.改变柱类型（二醇、氨基、硅胶）；微调%B 4.优化色谱柱条件（柱长、颗粒大小、流速）
4 + 5 6 + 7
3 4 6
4 5 8
6 10 12 14
7 16
0
1 1.0
3
3 4 6
6 4 8
5 10 12 14
7 16
23%MeOH 苯基柱 1 0 2 1 + 2
52%MeOH苯基柱
3 4 6 8
4
6 5 10 12 14 7 16
0.0 0.2 0.4
1 0.6 0.8 1.0
3
23%MeOH 苯基柱 Rs=2.0 1 3 4 1 + 6 4 6 5 8 2 32%MeOH 氰基柱 Rs=2.0 6 4 3 57 2.0 3.0 4.0 10 7 12 14
1.2 1.4 1.6 2 + 3 5 + 7
1.8
0
2
12%MeOH 氰基柱 4 6 8 （a） 6 5 10 12 14 7 16
0.0 0.2 0.4 1 0.6 0.8 1.0 (b)
6
3 0 2 4
1
1.2 1.4 1.6 1.8
0.0
1.0
不同溶剂与柱类型的结合使用：
正相色谱分析方法的建立
GPC分析方法
SEC保留机理
GFC:凝胶过滤色谱 水相流动相 分离水溶性大分子 固定相：多糖型凝胶、多孔交联聚甲基丙稀酸酯类 树脂、交联聚乙稀基醇树脂、羟基化聚醚类亲水性 树脂等。
GPC:凝胶渗透色谱 有机相流动相 分离脂溶性高分子 固定相填料：苯乙烯-二乙烯苯多孔微球系列
理想SEC填料的性能要求
2 1 8 5 + 9 4
1
3 12 10 11 13
0
2 1 8 5 3 4 11 9 10 13 12
10
2 + 3 1 8 5 4 11 9 10 13
4
6
0
10
2 1 8 5 3 12 4 + 11 9
0 7
10 13 2
10
2 1 84 5 + 12 3 11 9 10
0 2
13 2 1
样品的制备

溶剂萃取 固相萃取 膜分离，超滤， 超临界萃取等
RPC的保留机理
极性 非极性
亲水性
疏水性
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

图1非离子样品的反相分离过程示意图 黑点表示在极性流动相和非极性固定相间分配的样品分子
影响RPC的保留的因素：
10
1 8 3 5 11 4 10 12
3
9 13
0
10
3
8 5 4 11 12
5
9 10 13
0 10
10
0 NPC 溶剂选择性实验的对应色谱图
15×0.46 cm硅胶柱，流动相如前，2.0ml/min，35 0C。 样品为取代 萘 混合物，取代基：1 2-OCH3 ，2 1-NO2，3 1，2-（OCH3）2， 4 1，5-（NO2）2；5 1-CHO，8 2-CHO，9 1-CH2CN，10 1-OH，11 1-COCH3，12 2-COCH3，13 2-OH。
1.流动相的影响：
水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<丙醇<二氯甲烷 A+B： 水+有机溶剂 最佳分离条件：1<k <10
2.%B的选择：
3.流动相强度：
水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<丙醇<二氯甲烷
4.色谱柱和柱温的影响：
非极性、非离子化合物的RPC保留值规则：
(弱）未键合硅胶≤氰基<C1（TMS）<C3<C4<苯基<C8≈C18（强）
b.改变有机溶剂 c.混合有机溶剂
d.改变柱类型 e.改变温度 4.优化柱条件（柱长、颗粒尺寸、流速）
混合溶剂的使用：
柱类型的影ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ：
2 26%MeOH C8柱 1 0 2 2
58%MeOH苯基柱 2 52%MeOH C8柱 4 + 6 7 5 2.0 2
2 26%MeOH C8柱 Rs=0.8 1 0 2 2
SEC填料的色谱特征：
SEC应用：
分离复杂样品，然后再以高分辨率的HPLC分离纯化. 分析纯化高分子化合物，以确定单聚、二聚和多聚
物.
以校正曲线估算大分子物质分子量.
实例: 凝胶渗透色谱法测定羟乙基淀粉分子量
色谱条件: 1. 色谱仪器：pharmacia LKB HPLC pump 2248 KNAUER Differental-referactometer 2. 色谱柱：Shodex OHpak SB-804 HQ(聚羟甲基丙烯酸酯凝胶) 规格： 柱名 排阻限(Pullulan) 粒径(μm) 尺寸(mm) SB-804 HQ 1,000,000 3. 流动相：0.7%硫酸钠+0.02%叠氮化钠 4. 流 速：0.5ml/min 5. 柱 温：35℃ 10 8.0 x 300
一.反相HPLC（RPC） 分析方法的建立
建立分析方法的步骤
样 品 信 息 分 析 目 的 要 求
样 品 制 备
选 择 检 测 方 法 和 条 件
选 择 H P L C 方 法
优 化 分 离 条 件
定 性 定 量 分 析
分 析 方 法 验 证
样品的组成与性质



样品中的化学成分 化合物的结构与官能团 化合物的分子量 化合物的酸碱性和pKa 样品适宜的溶剂及溶解度 样品各成分的含量范围 化合物的紫外吸收光谱
使用正相色谱（NPC）的理由 ：
1.样品在RPC中不保留（亲水性太强）
2.样品在RPC中保留太强（疏水性太强）
3.采用RPC分离不能获得足够的峰间距（α=1） 4.样品含有空间异构体，立体异构体或非对映异构体 5.期望回收到大量疏水性样品组分（制备色谱） 6.样品溶于非极性溶剂（若采用RPC柱，会对直接进样 造成问题）
通常柱温增加1℃，K会减少1%-2%
反相色谱的选择性：
溶剂强度的选择性 溶剂类型的选择性 柱类型对选择性的影响 温度对选择性的影响
1.溶剂强度 的选择性
2.溶剂类型的选择性
3.柱类型对选择 性的影响
4.温度对选择 性的影响：
反相色谱中分析方法的建立：
反相方法建立的推荐步骤： 1.调整%B，使0.5<k<20，（1<k<10更好） 2.检查峰拖尾或塔板数低的现象 3.如果必要，调整选择性 a.微调%B