总黄酮测定(优选.)

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赠人玫瑰，手留余香。

蕨菜中总黄酮和多糖的还原力测定

一．前言

1.项目的意义

蕨菜是采自蕨科蕨属中蕨的幼嫩叶。近年来已成为深受人们喜爱的山野菜。蕨菜还具有清热化痰、利尿安神等功效,经常食用蕨菜会有一定的保健作用。蕨菜中所含黄酮类化合物具有抗溃疡、抗过敏、抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老、降血脂、治疗心脑血管疾病等药用保健功能,也是一类具有广阔开发前景的天然抗氧化剂。文中对蕨菜黄酮的含量测定、抗氧化作用等方面进行了研究,为蕨菜的保健功能研究,更为蕨菜的深度加工与开发提供依据。

2.黄酮的研究进展

由于黄酮具有广谱的药理作用，特别是在抗癌、防癌和抗自由基方面的作用，引起人们

极大的开发兴趣。微波、超声波、酶解、浸提和超临界提取等几种黄酮的提取方法可以单独

使用，也可以相互辅助使用。黄酮的分离和鉴定方法主要有高效液相色谱法、紫外分光光度

法和颜色判别法。测定黄酮的活性时，主要是测其抗氧化性能。近年来，研究黄酮的学者越来越多，相信黄酮会更多地应用到医药、化妆、食品等领域。

3.实验内容

首先采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定样品中总黄酮含量。利用黄酮类化合物与铝

盐反应生成红色络合物,以芦丁为标准在510nm处测吸光度,进行黄酮含量的测定[陈乃富,2007]

然后通过对蕨菜中总黄酮还原力测定[李进,2010] 和DP PH自由基清除能力的测定[李波，2010]及超氧阴离子清除能力的测定[张建平，2009] 对黄酮的抗氧化能力进行测定。

二、项目实施环节及实施方案 1.材料与方法

1.1材料 蕨菜（天水市售）

1.2试剂 磷酸缓冲液、六氰合铁酸钾溶液、三氯乙酸溶液、三氯化铁溶液、DPPH 乙醇溶液、无水乙醇、水杨酸-乙醇溶液、硫酸亚铁溶液、水杨酸、30%双氧水、Vc 、BHT 、Tris-HCl 缓冲液、Hcl 溶液、邻苯三酚

1.3仪器 紫外可见分光光度仪，超声波裂解仪、干燥箱、恒温水浴锅、电磨机、离心机、索氏提取器等。

1.4方法 通过对蕨菜中总黄酮还原力测定[李进,2010] 和DPPH 自由基清除能力的测定[李波，2010]及超氧阴离子清除能力的测定[张建平，2009] 对黄酮的抗氧化能力进行测定。

2.试验方案

2.1.1标准溶液的配制（0.1g/L ）

称取约20mg 芦丁标准品于称量瓶中,置103℃烘箱中烘干至恒重,干燥器中冷却,精确称取10mg 芦丁标准品,用70%乙醇定容至100mL 为标准液。 2.1.2标准曲线制作

精确吸取芦丁标准液0·0、1·0、2·0、3·0、4·0、5·0mL,分别置于6支具塞试管中,各补水至5mL,加5%NaNO2溶液0·3mL,摇匀,放置6min 后,加质量分数10%Al(NO3)3溶液0·3mL,摇匀,放置6min 后,再加4%NaOH 溶液4mL,加水0·4mL,摇匀,放置15min 后,在510nm 处测吸光度-浓度值,所得吸光度-浓度曲线及回归方程。 2.1.3样品黄酮含量的测定

吸取待测液4ml 置于具塞试管中补蒸馏水至5mL,加5%NaNO2溶液0.3mL,摇匀,放置6min 后,加10%Al(NO3)3溶液0.3mL,摇匀,放置6min 后,再加4%NaOH 溶液4mL,加水0.4mL,摇匀,放置15min 后,在510nm 处测吸光度。计算公式如下：

X=

1000100

⨯⨯⨯⨯V m C A

式中 ：X —为样品中总黄酮含量（以芦丁计，mg/100 g ）,

A —为根据标准曲线计算出样品提取液中黄铜含量（μg ），

C—为样品定容体积（mL），

V—为待测液体积（mL），

m—为样品质量（g）

2.2蕨菜中总黄酮的还原力测定[李进,2010]

取一定体积的提取液（黄酮提取液）(提取液的用量为2ml、4ml、6ml、8ml、10ml)于试管中，各补水至10mL,依次加入2.5mL的0.2mol/L的磷酸缓冲液(PBS，pH

6.6)和2.5mL的质量分数1%六氰合铁酸钾溶液(K3Fe(CN)6)，于50℃水浴保温20min

后，快速冷却，再加入2.5mL的质量分数10%三氯乙酸溶液(TCA)。以3000r/min的转速离心10min，取上清液2.5mL，依次加入4mL蒸馏水，1mL的质量分数0.1%三氯化铁溶液(FeCl3)，充分混匀，静置10min后，在700nm下测定其吸光度A700nm(以蒸馏水做参比液)，吸光度越大表示还原能力越强。

2.3 DPPH自由基清除能力的测定[李波，2010]

1 2 3 清除率

蒸馏水

提取液2ml

提取液4ml

提取液6ml

提取液8ml

提取液10ml

VC

BHT

（老师，我们VC和BHT的浓度梯度不知道该怎么确定。）

吸取不同体积的样品溶液, (提取液的用量分别为2ml、4ml、6ml、8ml、10ml)于试管中，各补水至10mL,加入2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液2mL,摇匀后,在室温黑暗处放置30min。以无水乙醇调零,测定517nm处的吸光值(A样品)。同时做空白和对照,并与Vc和BHT进行比较。DPPH自由基清除率=[1-(A样品-A空白)/A对照]×100%。

以0～0．2 mg/mL的抗坏血酸绘制出不同浓度的抗坏血酸对DPPH·清除率曲线。

根据以下公式计算清除率:

清除率(%)=［1－(Ai－Aj)/Ac］×100

式中:Ai为Vc与2 mL DPPH溶液混合、在暗处反应30 min后，最大吸收峰波长处的吸光值;Aj为Vc与2 mL无水乙醇混合、在暗处反应30 min后，最大吸收峰波长处的吸光值;Ac为无水乙醇与2 mL DPPH溶液混合、在暗处反应30 min后，最大吸收峰波长处的吸光值，作为对照组。

以0～0．2 mg/mL的BHT绘制出不同浓度的BHT对DPPH·清除率曲线。

根据以下公式计算清除率:

清除率(%)=［1－(Ai－Aj)/Ac］×100

式中:Ai为BHT与2 mL DPPH溶液混合、在暗处反应30 min后，最大吸收峰波长处的吸光值;Aj为BHT与2 mL无水乙醇混合、在暗处反应30 min后，最大吸收峰波长

处的吸光值;Ac为无水乙醇与2 mL DPPH溶液混合、在暗处反应30 min后，最大吸收峰波长处的吸光值，作为对照组。

3.5 清除羟基自由基能力的测定[李波，2010]

1 2 3 清除率

蒸馏水

提取液1ml

提取液2ml

提取液3ml

提取液4ml

提取液5ml

Vc

BHT

取1mL 9mmol/L FeSO4,加1mL 9mmol/L水杨酸-乙醇溶液, 吸取不同体积的样品溶液, (提取液的用量分别为1ml、2ml、3ml、4ml、5ml)于试管中，各补水至7mL,最后加