引物设计-lhy
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• Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log △ ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
引物二级结构
• 引物二聚体
– 尽可能避免两个引物分子之间 端有较多碱 尽可能避免两个引物分子之间3’端有较多碱 基互补
• 发夹结构
– 尤其是要避免引物 端形成发夹结构，否则 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构 端形成发夹结构， 将严重影响DNA聚合酶的延伸。 聚合酶的延伸。 将严重影响 聚合酶的延伸
引物5’端 引物 端
• 引物 端可以有与模板DNA不配对碱基， 引物5’端可以有与模板 不配对碱基， 端可以有与模板 不配对碱基 端引入一段非模板依赖性序列。 在5’端引入一段非模板依赖性序列。 端引入一段非模板依赖性序列
– 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切 端加上限制性核酸内切酶位点序列（ 端加上限制性核酸内切酶位点序列 位点5’端加上适当数量的保护碱基 端加上适当数量的保护碱基）。 位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 – 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产 端的某一位点修改某个碱基， 端的某一位点修改某个碱基 物中引入该位点的点突变以作研究。 物中引入该位点的点突变以作研究。 – 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生 端标记放射性元素或非放射性物质（ 端标记放射性元素或非放射性物质 物素、地高辛等）。 物素、地高辛等）。
碱基分布的均衡性
• 同一碱基连续出现不应超过 个 同一碱基连续出现不应超过5个 • GC含量一般 含量一般40-60% 含量一般
– GC含量太低导致引物 值较低，使用较低 含量太低导致引物Tm值较低 值较低， 含量太低导致引物 的退火温度不利于提高PCR的特异性 的特异性 的退火温度不利于提高 – GC含量太高也易于引发非特异扩增。 含量太高也易于引发非特异扩增。 含量太高也易于引发非特异扩增
加酶切位点： 加酶切位点： XbaI： L 5`-TCTAGAATGCGACGGTACCGGACATA SacI： ： R 5`-TGTGCACCAGTTACCTACTAA GAGCTC
• 加保护碱基（酶的边际效应）： 加保护碱基（酶的边际效应）：
L-GTACTCTAGAATGCGACGGTACCGGACATA R`-TGTGCACCAGTTACCTACTAAGAGCTCGTAC
引物设计之浅谈
李慧玉
PCR
过
程
内容
• 引物设计的原则 • Primer premier 5.0的使用 的使用 • 植物表达载体引物设计 • 原核表达载体引物设计 • 酵母表达载体引物设计
一、引物设计的原则
引物长度
• 一般为 一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或 个核苷酸，在做长片段 个核苷酸 或 做某些特殊的PCR时应使用较长的引物， 时应使用较长的引物， 做某些特殊的 时应使用较长的引物 但最多不超过50个核苷酸。 但最多不超过 个核苷酸。 个核苷酸
总结
• • • • • 1、长度为15-30bp 、长度为 2、避免有聚嘌呤或聚嘧啶，尤其是３‘端 、避免有聚嘌呤或聚嘧啶，尤其是３ 3、Tm值：55-65℃ 、 值 ℃ 4、避免二级结构 、 5、3‘端末位为 端末位为T>G（C）>A 、 端末位为 （ ）
二、引物设计软件
• Primer Premier 5.0
引物Tm值 值 引物
• 一般要求：55℃-65℃。 一般要求： ℃ ℃ • 计算： 计算：
– 对于低于 个碱基的引物，Tm值可根据 对于低于20个碱基的引物 个碱基的引物， 值可根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 来粗略估算 – 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学 对于较长引物， 值则需要考虑热动力学 参数， 最近邻位”的计算方式得到， 参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这 也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。
引物的内部稳定性
• 过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能 过去认为，引物 端应牢牢结合在模板上才能 有效地进行延伸， 端最好为G或 。 有效地进行延伸，故3’端最好为 或C。 端最好为 • 现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结 现在的观点认为，引物的 端应是相对稳定结 构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定 端在碱基配对的情况下最好为低稳定 性结构， 端尽可能选用T。 性结构，即3’端尽可能选用 。 端尽可能选用 – 如果 端为富含 、C的结构，只需 端几个 如果3’端为富含 端为富含G、 的结构 只需3’端几个 的结构， 碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造 碱基与模板互补结合，就可能引发延伸， 成假引发。 成假引发。
最后引物序列： 最后引物序列： L：5`-GTACTCTAGAATGCGACGGTACCGGACATA ： R： 5`- GTACGAGCTCTTAGTAGGTAACTGGTGCACA
原核表达载体引物设计
原核表达载体特点
• 原核表达载体（举例） 原核表达载体（举例） • pGEX-4T-2 系列原核表达载体携带谷胱甘 转移酶GST基因 编码蛋白分子量 基因,编码蛋白分子量 肽S转移酶 转移酶 基因 编码蛋白分子量26.0kD , 若外源片段正确插入载体pGEX单克隆位点后 若外源片段正确插入载体pGEX单克隆位点后 将表达GST融合蛋白 融合蛋白。 将表达GST融合蛋白。 • pET28a 特点是在外源蛋白的Ｎ端可编码 个 特点是在外源蛋白的Ｎ端可编码6个 组氨酸残基,6个组氨酸对表达蛋白的活性和结 组氨酸残基 个组氨酸对表达蛋白的活性和结 构影响很少,但由于组氨酸的咪唑环能与金属 构影响很少 但由于组氨酸的咪唑环能与金属Ni 但由于组氨酸的咪唑环能与金属 形成螯合物,因此利用 因此利用Ni-NTA树脂可以很方便 形成螯合物 因此利用 树脂可以很方便 地将外源蛋白从细菌蛋白中分离出来。 地将外源蛋白从细菌蛋白中分离出来。载体蛋 白分子量约3.5kD。 白分子量约 。
引物3’端 引物 端
• 引物的延伸从 端开始，因此3’端的几个 引物的延伸从3’端开始，因此 端的几个 端开始 碱基与模板DNA均需严格配对，不能进 均需严格配对， 碱基与模板 均需严格配对 行任何修饰，否则不能进行有效的延伸， 行任何修饰，否则不能进行有效的延伸， 甚至导致PCR扩增完全失败。 扩增完全失败。 甚至导致 扩增完全失败 • 3’端的末位碱基会导致不同的错配机 端wk.baidu.com末位碱基会导致不同的错配机 率．
举例
• • >1 ATGCGACGGTACCGGACATATGCCCGGGAATTCGGCCATTACGGCCGGGGGAT TGTGGCGGAGCCAATATCCGCCGCTAGGAGGAATTCAGAAAACACAGACAGAG GAAGAGAAATGGGAGGCATCGGATTATTAGTAGCCGACTTCATCTTATCTTTCAT GTGGGTATGGTCAAGTCCTCTAATCAAAATCTTAGTTTCAAAACATTTAGGATTAG GATATCACGATCACACTGGTGAGATCATTCGGTATTCTCTCTCGATTATAAATTTG TTTTTCTTTTCCATCATGGCTAAAGTCAGCAAAGGTGGGGCTTATAACCCGCTTA CAGTTTTGGCTGGTGGTCTTTCTGGGAATTTCAGCCGGTTTTTGTTCTCCATTGG GGCAAGAATCCCTGCTCAGGTCCTTGGTTCCATAATGGGCGTTAGGCTTCTCAT TGGTACCTTTCCTGAAATTGGGCGGGGACCGAAGTTAAATGTCCACATCTATCAT GGCACGTTAACCGACAGGGTTTTTAACCTTTGCAATTGTTTTCATTCAACTAGGG TTAGGAAGAAGCATACCTGGAAGCTTCTTCAGGACGGACTTGGATTGCAAGTCT TTCCAAGGCTTACTCTTCATATTCTCGGTTCTGATCTAACTGGTGGATGCATGAA CCCTGCATCTGTATTTGGGTGGGCATATGCTCGTGGTGATCACATAACCAGGGA GCATATATTTGTGTATTGGCTTGCACCAATAGAGGGTACGTTGTTTGCTTTATGG GTGTTTAAATTGCTGTTTCAGAAGCCAAAAGAGAAAGCAGATATGAAGAATAAAT CAGATTGATGCCACAAGTTCTGGGATGTATTTGTGTTATTGTTATCTCCATTGGTA TCTGGATGGAAGTAACTTAGTAACCAGATTGAAGTTGTGGAGACTTATGAATTCT AGTGGGGAATGTTCCTTTTTTGTATTTGATTCTCCTCTTTATGGCTAGGGTGTATA GATCAGATCATCTAGTATCGGATTAAAGGCATATTGCTTTTTGCTACTCTGTACTC AACATTCCTGGTAATGTGCACCAGTTACCTACTAA
植物表达载体ProkⅡ Ⅱ 植物表达载体
XbaI
35S
BamHI SmaI
KpnI
SacI
确定酶切位点 XbaI： TCTAGA ：
SacI ：GAGCTC
同时在正链上设计3端及 端引物 同时在正链上设计 端及5端引物 端及
上游： 上游：5`-ATGCGACGGTACCGGACATA-3` 下游： 下游：５`-TGTGCACCAGTTACCTACTAA-３` ３
– 生物软件网购买 – 下载，安装后，用文本编辑器打开 下载，安装后，用文本编辑器打开WIN.INI， ， 改为vspace=PU，并将其改 将vspace=DU改为 改为 ， 成只读，便可以使用全部功能。 成只读，便可以使用全部功能。
三、植物表达载体构建引物设计
设计引物步骤
• 1、对基因进行酶切位点分析 、 • 2、选择适当的表达载体及酶切位 2、 点 • 3、根据上、下游序列设计引物 、根据上、
• Enzymes that do not cut:
• AarI, AatII, AccI, AclI, AfeI, AflII, AflIII, AgeI, AhdI, AloI, AloI, AlwI, AlwNI，ApaI, AscI, AseI, AsiSI, AvrII, BaeI, BaeI, BamHI, BanII, BbeI, BbsI, BbvI, BbvCI，BcgI, BcgI, BciVI, BglII, BlpI, BmgBI, BmrI, BmtI, BplI, BpmI, BpuEI, BsaI, BsaAI，BsaBI, BsaHI, BsaXI, BsaXI, BseYI, BsgI, BsiWI, BsmI, BsmBI, BspEI, BspHI, BspMI，BsrBI, BsrDI, BsrGI, BssHII, BstAPI, BstBI, BstEII, BstXI, BstYI, BstZ17I, Bsu36I，BtgI, BtsI, ClaI, DraIII, DrdI, EcoICRI, EcoNI, FalI, FseI, FspI, FspAI, HaeII，HgaI, KasI, MluI, MlyI, MmeI, MscI, MspA1I, NaeI, NarI, NcoI, NgoMIV, NheI, NotI，NruI, NspI, PacI, PciI, PflMI, PleI, PmeI, PmlI, PpiI, PpiI, PshAI, PspOMI, PsrI，PsrI, PstI, PvuI, PvuII, RsrII, SacI, SacII, SalI, SanDI, SapI, SbfI, ScaI, SexAI，SfcI, SfoI, SgrAI, SmlI, SnaBI, SpeI, SphI, SrfI, SspI, StuI, SwaI, Tth111I, XbaI，XhoI, XmnI, ZraI
引物二级结构
• 引物二聚体
– 尽可能避免两个引物分子之间 端有较多碱 尽可能避免两个引物分子之间3’端有较多碱 基互补
• 发夹结构
– 尤其是要避免引物 端形成发夹结构，否则 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构 端形成发夹结构， 将严重影响DNA聚合酶的延伸。 聚合酶的延伸。 将严重影响 聚合酶的延伸
引物5’端 引物 端
• 引物 端可以有与模板DNA不配对碱基， 引物5’端可以有与模板 不配对碱基， 端可以有与模板 不配对碱基 端引入一段非模板依赖性序列。 在5’端引入一段非模板依赖性序列。 端引入一段非模板依赖性序列
– 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切 端加上限制性核酸内切酶位点序列（ 端加上限制性核酸内切酶位点序列 位点5’端加上适当数量的保护碱基 端加上适当数量的保护碱基）。 位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 – 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产 端的某一位点修改某个碱基， 端的某一位点修改某个碱基 物中引入该位点的点突变以作研究。 物中引入该位点的点突变以作研究。 – 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生 端标记放射性元素或非放射性物质（ 端标记放射性元素或非放射性物质 物素、地高辛等）。 物素、地高辛等）。
碱基分布的均衡性
• 同一碱基连续出现不应超过 个 同一碱基连续出现不应超过5个 • GC含量一般 含量一般40-60% 含量一般
– GC含量太低导致引物 值较低，使用较低 含量太低导致引物Tm值较低 值较低， 含量太低导致引物 的退火温度不利于提高PCR的特异性 的特异性 的退火温度不利于提高 – GC含量太高也易于引发非特异扩增。 含量太高也易于引发非特异扩增。 含量太高也易于引发非特异扩增
加酶切位点： 加酶切位点： XbaI： L 5`-TCTAGAATGCGACGGTACCGGACATA SacI： ： R 5`-TGTGCACCAGTTACCTACTAA GAGCTC
• 加保护碱基（酶的边际效应）： 加保护碱基（酶的边际效应）：
L-GTACTCTAGAATGCGACGGTACCGGACATA R`-TGTGCACCAGTTACCTACTAAGAGCTCGTAC
引物设计之浅谈
李慧玉
PCR
过
程
内容
• 引物设计的原则 • Primer premier 5.0的使用 的使用 • 植物表达载体引物设计 • 原核表达载体引物设计 • 酵母表达载体引物设计
一、引物设计的原则
引物长度
• 一般为 一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或 个核苷酸，在做长片段 个核苷酸 或 做某些特殊的PCR时应使用较长的引物， 时应使用较长的引物， 做某些特殊的 时应使用较长的引物 但最多不超过50个核苷酸。 但最多不超过 个核苷酸。 个核苷酸
总结
• • • • • 1、长度为15-30bp 、长度为 2、避免有聚嘌呤或聚嘧啶，尤其是３‘端 、避免有聚嘌呤或聚嘧啶，尤其是３ 3、Tm值：55-65℃ 、 值 ℃ 4、避免二级结构 、 5、3‘端末位为 端末位为T>G（C）>A 、 端末位为 （ ）
二、引物设计软件
• Primer Premier 5.0
引物Tm值 值 引物
• 一般要求：55℃-65℃。 一般要求： ℃ ℃ • 计算： 计算：
– 对于低于 个碱基的引物，Tm值可根据 对于低于20个碱基的引物 个碱基的引物， 值可根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 来粗略估算 – 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学 对于较长引物， 值则需要考虑热动力学 参数， 最近邻位”的计算方式得到， 参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这 也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。
引物的内部稳定性
• 过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能 过去认为，引物 端应牢牢结合在模板上才能 有效地进行延伸， 端最好为G或 。 有效地进行延伸，故3’端最好为 或C。 端最好为 • 现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结 现在的观点认为，引物的 端应是相对稳定结 构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定 端在碱基配对的情况下最好为低稳定 性结构， 端尽可能选用T。 性结构，即3’端尽可能选用 。 端尽可能选用 – 如果 端为富含 、C的结构，只需 端几个 如果3’端为富含 端为富含G、 的结构 只需3’端几个 的结构， 碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造 碱基与模板互补结合，就可能引发延伸， 成假引发。 成假引发。
最后引物序列： 最后引物序列： L：5`-GTACTCTAGAATGCGACGGTACCGGACATA ： R： 5`- GTACGAGCTCTTAGTAGGTAACTGGTGCACA
原核表达载体引物设计
原核表达载体特点
• 原核表达载体（举例） 原核表达载体（举例） • pGEX-4T-2 系列原核表达载体携带谷胱甘 转移酶GST基因 编码蛋白分子量 基因,编码蛋白分子量 肽S转移酶 转移酶 基因 编码蛋白分子量26.0kD , 若外源片段正确插入载体pGEX单克隆位点后 若外源片段正确插入载体pGEX单克隆位点后 将表达GST融合蛋白 融合蛋白。 将表达GST融合蛋白。 • pET28a 特点是在外源蛋白的Ｎ端可编码 个 特点是在外源蛋白的Ｎ端可编码6个 组氨酸残基,6个组氨酸对表达蛋白的活性和结 组氨酸残基 个组氨酸对表达蛋白的活性和结 构影响很少,但由于组氨酸的咪唑环能与金属 构影响很少 但由于组氨酸的咪唑环能与金属Ni 但由于组氨酸的咪唑环能与金属 形成螯合物,因此利用 因此利用Ni-NTA树脂可以很方便 形成螯合物 因此利用 树脂可以很方便 地将外源蛋白从细菌蛋白中分离出来。 地将外源蛋白从细菌蛋白中分离出来。载体蛋 白分子量约3.5kD。 白分子量约 。
引物3’端 引物 端
• 引物的延伸从 端开始，因此3’端的几个 引物的延伸从3’端开始，因此 端的几个 端开始 碱基与模板DNA均需严格配对，不能进 均需严格配对， 碱基与模板 均需严格配对 行任何修饰，否则不能进行有效的延伸， 行任何修饰，否则不能进行有效的延伸， 甚至导致PCR扩增完全失败。 扩增完全失败。 甚至导致 扩增完全失败 • 3’端的末位碱基会导致不同的错配机 端wk.baidu.com末位碱基会导致不同的错配机 率．
举例
• • >1 ATGCGACGGTACCGGACATATGCCCGGGAATTCGGCCATTACGGCCGGGGGAT TGTGGCGGAGCCAATATCCGCCGCTAGGAGGAATTCAGAAAACACAGACAGAG GAAGAGAAATGGGAGGCATCGGATTATTAGTAGCCGACTTCATCTTATCTTTCAT GTGGGTATGGTCAAGTCCTCTAATCAAAATCTTAGTTTCAAAACATTTAGGATTAG GATATCACGATCACACTGGTGAGATCATTCGGTATTCTCTCTCGATTATAAATTTG TTTTTCTTTTCCATCATGGCTAAAGTCAGCAAAGGTGGGGCTTATAACCCGCTTA CAGTTTTGGCTGGTGGTCTTTCTGGGAATTTCAGCCGGTTTTTGTTCTCCATTGG GGCAAGAATCCCTGCTCAGGTCCTTGGTTCCATAATGGGCGTTAGGCTTCTCAT TGGTACCTTTCCTGAAATTGGGCGGGGACCGAAGTTAAATGTCCACATCTATCAT GGCACGTTAACCGACAGGGTTTTTAACCTTTGCAATTGTTTTCATTCAACTAGGG TTAGGAAGAAGCATACCTGGAAGCTTCTTCAGGACGGACTTGGATTGCAAGTCT TTCCAAGGCTTACTCTTCATATTCTCGGTTCTGATCTAACTGGTGGATGCATGAA CCCTGCATCTGTATTTGGGTGGGCATATGCTCGTGGTGATCACATAACCAGGGA GCATATATTTGTGTATTGGCTTGCACCAATAGAGGGTACGTTGTTTGCTTTATGG GTGTTTAAATTGCTGTTTCAGAAGCCAAAAGAGAAAGCAGATATGAAGAATAAAT CAGATTGATGCCACAAGTTCTGGGATGTATTTGTGTTATTGTTATCTCCATTGGTA TCTGGATGGAAGTAACTTAGTAACCAGATTGAAGTTGTGGAGACTTATGAATTCT AGTGGGGAATGTTCCTTTTTTGTATTTGATTCTCCTCTTTATGGCTAGGGTGTATA GATCAGATCATCTAGTATCGGATTAAAGGCATATTGCTTTTTGCTACTCTGTACTC AACATTCCTGGTAATGTGCACCAGTTACCTACTAA
植物表达载体ProkⅡ Ⅱ 植物表达载体
XbaI
35S
BamHI SmaI
KpnI
SacI
确定酶切位点 XbaI： TCTAGA ：
SacI ：GAGCTC
同时在正链上设计3端及 端引物 同时在正链上设计 端及5端引物 端及
上游： 上游：5`-ATGCGACGGTACCGGACATA-3` 下游： 下游：５`-TGTGCACCAGTTACCTACTAA-３` ３
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三、植物表达载体构建引物设计
设计引物步骤
• 1、对基因进行酶切位点分析 、 • 2、选择适当的表达载体及酶切位 2、 点 • 3、根据上、下游序列设计引物 、根据上、
• Enzymes that do not cut:
• AarI, AatII, AccI, AclI, AfeI, AflII, AflIII, AgeI, AhdI, AloI, AloI, AlwI, AlwNI，ApaI, AscI, AseI, AsiSI, AvrII, BaeI, BaeI, BamHI, BanII, BbeI, BbsI, BbvI, BbvCI，BcgI, BcgI, BciVI, BglII, BlpI, BmgBI, BmrI, BmtI, BplI, BpmI, BpuEI, BsaI, BsaAI，BsaBI, BsaHI, BsaXI, BsaXI, BseYI, BsgI, BsiWI, BsmI, BsmBI, BspEI, BspHI, BspMI，BsrBI, BsrDI, BsrGI, BssHII, BstAPI, BstBI, BstEII, BstXI, BstYI, BstZ17I, Bsu36I，BtgI, BtsI, ClaI, DraIII, DrdI, EcoICRI, EcoNI, FalI, FseI, FspI, FspAI, HaeII，HgaI, KasI, MluI, MlyI, MmeI, MscI, MspA1I, NaeI, NarI, NcoI, NgoMIV, NheI, NotI，NruI, NspI, PacI, PciI, PflMI, PleI, PmeI, PmlI, PpiI, PpiI, PshAI, PspOMI, PsrI，PsrI, PstI, PvuI, PvuII, RsrII, SacI, SacII, SalI, SanDI, SapI, SbfI, ScaI, SexAI，SfcI, SfoI, SgrAI, SmlI, SnaBI, SpeI, SphI, SrfI, SspI, StuI, SwaI, Tth111I, XbaI，XhoI, XmnI, ZraI