体内致突变试验——Pig-a基因突变试验概况和进展
基于TK6细胞的体外PIG-A基因突变检测方法的建立
基于TK6细胞的体外PIG-A基因突变检测方法的建立李若婉;周长慧;黄鹏程;常艳【摘要】目的:建立基于人成淋巴TK6细胞的体外磷脂酰肌醇聚糖A类(PIG-A)基因突变试验方法,研究甲基磺酸乙酯(EMS)与苯并芘(B[a]P)诱导TK6细胞PIG-A基因突变的能力,并探讨该方法用于药物开发初期遗传毒性筛选和评价的前景.方法:通过免疫磁珠分离清除TK6细胞株中预先存在的GPI(-)细胞(即PIG-A基因突变细胞),然后连续40 d测定正常传代培养TK6细胞PIG-A基因的自发突变率.设不添加体外代谢活化系统长时处理组(24 h-S9)和添加体外代谢活化系统短时处理组(4h+S9),并分别采用3个不同浓度50、75、100μmol/L的EMS和4、8、16μmol/L的B[a]P处理TK6细胞10 d,在第11天收获细胞.使用CD19、CD55、CD59抗体和核酸染料7-AAD对细胞进行标记,然后用流式细胞仪分析CD19阳性细胞中,CD55和CD59表达阴性的细胞频率.结果:经过免疫磁珠分离,TK6细胞中预先存在的PIG-A基因突变细胞频率降低至2.5×10-5.连续测定40 d TK6细胞的PIG-A基因自发突变率,计算得到其自发突变率为5.04×10-7个/d.与阴性对照组比较,不同浓度EMS和B[a]P诱导产生的PIG-A基因突变细胞比例均呈剂量依赖性增加,并超过阴性对照组的2倍以上.结论:本研究初步建立了基于TK6细胞的体外PIG-A基因突变检测方法.该方法成本较低,简便、快速,具有应用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的潜力.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2019(031)003【总页数】7页(P242-248)【关键词】PIG-A基因;TK6细胞;遗传毒性;基因突变检测【作者】李若婉;周长慧;黄鹏程;常艳【作者单位】中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心,上海益诺思生物技术股份有限公司,上海 201203;中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心,上海益诺思生物技术股份有限公司,上海 201203;中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心,上海益诺思生物技术股份有限公司,上海201203;中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心,上海益诺思生物技术股份有限公司,上海 201203【正文语种】中文【中图分类】Q355遗传毒性的危害识别和风险评估在临床前化学品和药品的安全性评价中起着至关重要的作用。
体内Pig-a基因突变检测方法研究
中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文体内Pig-a基因突变检测方法研究The Study of Pig-a Gene MutationAssay Trial in Vivo姓名：邓媛元学号： 8450309077904015专业：免疫学研究方向：遗传毒性导师姓名：王雪二零一二年六月目录中文摘要 (1)Abstract (3)第一章前言 (7)第二章 SD大鼠Pig-a基因突变检测方法的建立 (11)第一节 SD大鼠Pig-a基因突变检测方法的建立 (11)1.1材料和方法 (11)1.2实验结果 (13)1.3讨论 (15)第二节 SD大鼠经ENU和DMBA暴露后Pig-a基因突变发生率 (17)2.1材料和方法 (17)2.2实验结果 (18)2.3讨论 (19)第三节 SD大鼠自发和诱发产生Pig-a基因突变与其周龄的关系 (21)3.1材料和方法 (21)3.2实验结果 (22)3.3讨论 (23)第四节 SD大鼠Pig-a基因突变检测方法评估 (25)前言 (25)4.1样本重复性分析 (25)4.2仪器稳定性分析 (25)4.3染色细胞稳定性分析 (26)4.4血液样本稳定性分析 (26)4.4流式细胞仪检测准确性评估 (27)4.5检测细胞数目对实验结果的影响 (29)第五节小结 (30)第三章 SD大鼠Pig-a基因突变检测方法的应用 (32)第一节两种抗肿瘤药物诱发SD大鼠Pig-a基因突变研究 (32)前言 (32)1.1顺铂注射液对SD大鼠Pig-a基因突变的影响 (32)1.2盐酸甲基苄肼对Pig-a基因突变的影响 (36)第二节两种中药主要成分诱发SD大鼠Pig-a基因突变研究 (40)前言 (40)2.1材料和方法 (40)2.2实验结果 (41)2.3讨论 (43)第三节小结 (44)第四章SD大鼠Pig-a基因突变检测RET方法的建立 (46)前言 (46)1.1材料和方法 (46)1.2实验结果 (48)1.3讨论 (52)第五章综述 (54)缩略语中英对照 (62)致谢 (63)版权申明 (64)中文摘要随着新药不断上市及对药品安全性的日益重视，作为药物非临床研究的重要组成部分的遗传毒性检测，其检测新技术和新方法的开发成了当务之急。
医学实验动物学
《实验动物管理条例》（1988年） 实验动物是指人工饲养、繁育，对其携带的微 生物及寄生虫实行控制、遗传背景明确或者来 源清楚，而应用于科学研究、教学、生产和检 定以及其他科学实验的动物 《实验动物管理条例》 （新修订，未公布） 实验动物是指经人工培育、遗传背景明确或来 源清楚，对其质量实行控制、用于科学实验及 产品生产的动物
• 人类各种疾病的发生发展十分复杂，要深入 探讨其疾病的发病及防治机理是不能也不应 该在病人身上进行的，但可以通过对动物各 种疾病和生命现象的研究，进而推用到人类
• 医学生物学的科研课题有60%以上需要用实验 动物，许多课题的研究离开实验动物就寸步 难行
制药工业方面
• 新的药品必须以大量的动物实验进行严格的安全性、 有效性评价，包括动物急性、亚急性及慢性毒性试 验、三致试验（致畸、致癌、致突变），包括以啮 齿类动物、犬或猴等不同进化程度动物进行试验， 证明对人体安全可靠后，方能呈有关部门审批，申 请生产批号
多个近交系杂交而成
杂交群 (Cross Breeding colony) 两种不 同品系杂交，利用杂交一代 F1杂交优势
突变系（Mutant strain）具有特殊突变基因 的品系动物，正常染色体基因发生突变，并具有各 种遗传缺陷的动物
• 按微生物控制的程度,目前我国将实验动物 分为四个等级
• 1 普通级动物（Conventional Animals) 2 清洁级动物（Clean Animals) 3 无特定病原体动物(Special Pathogen Free Animals, SPF) 4 无菌动物(Germ Free Animals)、悉生动物 (Gnotobiotic Animals)
纳米材料遗传毒性试验选择指南 草案
附件1纳米材料遗传毒性试验选择指南(草案)纳米材料独特的物理化学性质及其与生物体相互作用特性为其在食品加工、抗菌产品生产、药物载体开发、肿瘤诊疗、体内示踪等领域的应用提供了广泛的前景。
新型纳米材料的诞生为人类带来机遇的同时也带来了挑战。
大量纳米材料的涌现，极大程度上增加了人体与纳米材料接触的机会，纳米材料的安全性评价成为关注的热点。
如何合理评价纳米材料对人体的潜在毒性，特别是慢性或者长期毒性，预测其潜在毒性风险是目前全科学界及各相关监管部门亟需解决的问题。
国际标准（ISO / TS 80004-2：2015）[1]对纳米粒子（nanoparticle）的定义为：微小的纳米物体（长度范围约1 nm至100 nm），所有外部尺寸在纳米级，其中纳米物体最长和最短轴的长度没有显著差异。
如果尺寸差异显著（通常超过三倍），则为纳米纤维或纳米板。
纳米粒子的尺寸效应和表面活性高等特点使它极易透过细胞膜，可在表面活性和蓄积性的共同作用下，对细胞遗传物质产生直接或间接的相互作用。
尤其是携带金属离子的纳米粒子进入体内后有可能通过氧化应激等作用机制诱发染色体或DNA断裂[2-5]。
此外，纳米材料进入人体后可能在脏器蓄积并长期存在。
纳米材料的遗传毒性，现已发展成一个专门的亚分支研究领域—纳米遗传毒理学[6-7]。
对纳米材料的潜在致癌和致畸作用评估，是对纳米材料对人体安全性评价中极为重要的一环。
纳米材料与生物体作用方面存在一定特殊性，与大多数化学品和环境诱变剂有所差异，导致现行常规使用的遗传毒性标准化评价组合可能无法有效而可靠地进行评价。
美国FDA医疗器械和辐射健康中心（Center for Devices and Radiological Health, FDA）在2010年9月指出，有必要对标准遗传毒性试验方法进行评价，并分析传统方法是否适用于纳米材料的毒性评价[8]。
经合组织（The Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）纳米材料产品工作组（Working Party on Manufactured Nanomaterials，WPMN）于2013年11月18-19日在加拿大渥太华召开纳米材料产品遗传毒性专题研讨会，就是否需要在现有OECD遗传毒性试验指导原则范畴内对纳米材料遗传毒性测试方法进行特别调整，以及/或需要制定新的试验指导原则或指导性文件进行讨论。
致突变作用及其试验方法与评价
③环状染色体（ring chromosome） 染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒 的节段的两断端连接形成一个环时，称为环 状染色体。
④倒位（inversion） 当某一染色体发生两次 断裂后，其中间节段倒 转180再重接，称为 倒
二、突变类型
遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤： 基因突变
染色体畸变
端粒
着丝粒
姊 妹 染 色 单 体
端粒
染色体畸变 染色体的结构及数目改变。
组 蛋 白
基因突变 一个或几个DNA碱基对的改变。
碱基对
双 螺 旋
这些损伤多因DNA受损所致，也可能因DNA
以外的靶组织受损所致。
基因突变、染色体畸变及染色体数目变化的本
无误 修复
染色体分 离异常
重组事件 SCE 有丝分裂性交换
染色体结 构异常
基因 突变
细胞 死亡
非整倍体 多倍体
常用的致突变试验
1、细菌回复突变试验 （Ames试验） 2、哺乳动物细胞基因突变 试验 3、果蝇伴性隐性致死试验 4、染色体畸变分析 7、显性致死试验 8、小鼠可遗传易位试验
9、细菌DNA修复试验
4、细胞周期、有丝分裂与减数分裂
细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂
终了所经历的过程。
G0 ：DNA合成前期； G1 ：DNA合成期；
S：完成DNA复制；
G2：为有丝分裂做准备；
M：有丝分裂期
有丝分裂过程
有丝分裂指细胞核分 裂的过程，一个细胞 由此生成两个子细胞，
基因突变可行性研究报告
基因突变可行性研究报告一、研究目的和意义基因突变是指生物体基因组中发生的突然性变异，可能对生物体的性状和功能产生不同程度的影响。
基因突变的可行性研究旨在探讨基因突变对生物体的影响，评估基因突变的可行性，并为基因突变在遗传工程和生物学研究中的应用提供理论基础。
本研究选取了实验动物小白鼠为研究对象，通过基因编辑技术诱导小白鼠基因突变，并对其进行系统性评估，以验证基因突变的可行性和对小白鼠的生物学影响。
二、研究方法1.实验动物选择及分组本研究选取了实验动物小白鼠为研究对象，将小白鼠随机分为实验组和对照组，每组均包含10只小白鼠。
2.基因编辑技术诱导基因突变利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，设计合适的靶向序列，针对小白鼠基因组中特定基因进行突变诱导。
通过电转染或病毒载体等方法将编辑工具导入小白鼠胚胎干细胞中，筛选获得基因突变幼年小白鼠。
3.检测基因突变效率利用PCR或测序技术对编辑过的小白鼠进行基因突变效率的检测，确认基因编辑是否成功，评估编辑效果。
4.系统性评估基因突变效果对实验组和对照组小白鼠进行生长发育、行为学、生理指标等多方面的系统性评估，比较两组小白鼠的差异性，评估基因突变对小白鼠的影响。
5.数据统计及分析采集实验数据后，利用统计学方法对数据进行分析和处理，确定实验结果的可信度和显著性。
三、研究结果与讨论1.基因突变诱导经过基因编辑技术诱导，成功获得了小白鼠基因突变模型，基因突变效率达到80%以上。
2.生物学影响评估对实验组和对照组小白鼠进行系统性评估后发现，实验组小白鼠在生长发育、行为学和生理指标等方面与对照组存在显著差异。
实验组小白鼠出现了明显的生长迟缓和行为异常等情况，部分实验组小白鼠甚至出现了严重的生理缺陷。
3.数据分析通过数据统计和分析，发现实验组小白鼠的生长发育和生理功能受到显著影响，表现出异常生长曲线和异常生理指标。
四、研究结论及启示1.本研究通过基因编辑技术成功诱导了小白鼠基因突变模型，并对其进行全面、系统性评估，评估了基因突变对小白鼠的生物学影响。
生物实验突变实验报告
一、实验名称生物实验——突变实验研究二、实验目的1. 探究基因突变对生物性状的影响；2. 熟悉基因突变实验的操作步骤和原理；3. 培养实验设计和数据分析能力。
三、实验原理基因突变是指基因序列发生改变，导致蛋白质合成或功能发生改变。
基因突变是生物进化的重要来源，也是生物多样性的基础。
本实验通过诱变剂诱导基因突变，观察突变体性状变化，分析基因突变对生物性状的影响。
四、实验器材及试剂1. 实验器材：恒温培养箱、显微镜、显微镜载物台、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、酒精灯、酒精、蒸馏水、酒精灯等。
2. 实验试剂：MS培养基、诱变剂（如亚硝酸盐、紫外线等）、植物种子、蒸馏水等。
五、实验步骤1. 准备实验材料：将植物种子浸泡在蒸馏水中，用镊子取出，放入MS培养基中培养。
2. 诱变处理：将培养好的植物幼苗放入含有诱变剂的MS培养基中，处理一定时间后取出。
3. 观察突变体性状：将诱变后的植物幼苗放入MS培养基中继续培养，观察突变体性状变化，如植株高度、叶片形状、花色等。
4. 数据记录与分析：对突变体性状进行统计，并与正常植株进行比较，分析基因突变对生物性状的影响。
六、实验结果1. 突变体植株高度明显低于正常植株；2. 突变体叶片形状发生改变，部分叶片呈扭曲状；3. 突变体花色与正常植株存在差异。
七、实验结论1. 基因突变可以导致生物性状发生改变；2. 诱变剂可以诱导基因突变，提高突变率；3. 本实验成功观察到基因突变对植物性状的影响。
八、讨论1. 实验过程中，诱变剂的选择和浓度对突变率有较大影响，需根据实验目的和材料特性进行合理选择；2. 实验结果受到多种因素的影响，如环境条件、遗传背景等，需进行多因素分析；3. 本实验为基因突变研究提供了实验依据，有助于深入理解基因突变对生物性状的影响。
九、实验改进建议1. 在实验过程中，可尝试不同诱变剂和浓度，观察突变率的变化，为后续实验提供参考；2. 增加实验重复次数，提高实验数据的可靠性；3. 对突变体进行分子生物学分析，确定突变基因，为基因功能研究提供线索。
第六章--致突变作用及其评价
国际环境致突变物致癌物防护委员会 〔ICPEMC〕于1979年曾把致突试验按其观察的 遗传学终点分为四类：
〔1〕基因突变； 〔2〕染色体畸变； 〔3〕不别离； 〔4〕原发性DNA损伤。
1983年重新提出将致突变试验所反响的遗传学终点 分为5类：
〔1〕DNA完整性的改变〔形成加合物断裂、交 联〕；
〔2〕 DNA重排或交换；
1. 试验动物：多用雄性大鼠或小鼠进行。
2. 动物接触被检物的时间：可为一次、5～7天或3个月。 其中3个月者效果较好。然后将雄性与雌性动物按1：2比例 交配，雌性动物不接触化学受试物。小鼠连续交配6周，大 鼠8周，每周更换一批雌鼠。
3. 观察指标
雌鼠受孕后12～13天剖腹取出子宫，检查并记录活胎 数、早期死亡胎数、晚期死亡胎数，并计算总着床数〔可 按早期与晚期死亡胎数和活胎数计算〕以及每只受孕动物 平均着床数。
3 姊妹染色单体交换〔sister chromatid exchange，SCE〕 试验
遗传学终点：①染色体完整性改变②DNA重 排或交换
4 显性致死突变试验〔dominant lethal mutation test〕
遗传学终原理点：：通染过色哺体乳完动物整生性殖改细变胞染色体畸变进行的致
突变作用试验。哺乳动物生殖细胞染色体发生突变时，往 往不能与异性生殖细胞正常结合，易出现受精卵在着床前 死亡和胚胎早期死亡。显性致突变的机理可能是生殖细胞 染色体的断裂和易位。
观察对象：嗜多染红细胞〔PEC〕中的微核发生率， PEC是红细胞成熟发育过程中的一个阶段，此时红
细胞主核已经排出，因细胞质内含有核糖体，Giemsa染色 后呈兰灰色，便于与成熟红细胞鉴别〔成熟红细胞Giemsa 染色后呈桔红色〕，微核与细胞核一致，呈紫红色或紫兰 色。
骨髓增殖异常疾病患者PNH克隆的检测及PIG-A基因突变分析
学位论文作者签名：抖／凝壹
巨捌：趁噬钽缓硝
蒜培溶 导师签名：
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上海第二医科人学２００２级硕士毕业论文
骨髓增殖异常疾病患者ＰＮＨ克隆的检测与ＰＩＧ－Ａ基因突变分析
中文摘要
阵发性睡眠性血红蛋白尿（ＰＮＨ）是一种特殊的获得性造血干细胞克隆性疾病。 近年来的研究证实，位于Ｘ染色体上的ＰＩＧ－Ａ基因发生体细胞水平的突变直接导致 缺陷细胞ＥＰＰＮＨ细胞的形成，同时多种体内外因素造成ＰＮＨ细胞的克隆增殖是ＰＮＨ发 病的主要原因。除ＰＮＨ以外，在其他骨髓增殖异常疾病患者体内也可以检测到刚Ｈ 细胞。
关键词ＰＮＨ克隆ＰＩＧ－Ａ基因流式细胞术突变
卜海第二医科大学２００２级碗士毕业论文
ＰＮＨ ＣＬｍ４ＥＳ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ脚ＴＡＴＩＯＮ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＰＩＧ—Ａ ＧＥＮＥ ＩＮ
ＰＡＴＩＥＮＴＳ ＷＩＴＨ ＭＹＣＥＬＯＤＹＳＡＰＬＡＳＴＩＣ ＤＩＳＥＡＳＥ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ Ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ ｎｏｃｔｕｒｎａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ（ＰＮＨ） ｉｓ ａｎ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｃｌｏｎａｌ
本研究用流式细胞术检测了８７例ＰＮＨ、再生障碍性贫血、ＭＤＳ等骨髓增殖异 常疾病患者ＰＮＨ克隆的大小，分析了患者ＰＩＧ—Ａ基因突变情况，并结合传统的实 验室指标，较好地反映了患者的疾病本质和分子基础，本研究通过对上述疾病中 ＰＮＨ克隆的演变、ＰＩＧ—Ａ基因突变类型与临床特征的相关性的研究，从基因水平、 细胞水平到患者表型等不同层次，为骨髓增殖异常疾病的诊断和鉴别诊断提供了 一个有效的实验诊断平台。
ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｌａｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ＰＮＨ ｃｌｏｎｅ ａｎｄ
基因定点突变的原理和实验过程
基因定点突变的原理和实验过程嘿，咱今儿就来聊聊基因定点突变这档子事儿！你说这基因啊，就好比是生命的密码本，那定点突变呢，就是给这个密码本做点小修改。
想象一下，基因就像是一条长长的绳子，上面串着好多好多的信息。
而定点突变呢，就是要在这根绳子上精准地找到一个位置，然后把它给变一变。
这可不是随随便便就能干的事儿，得有一套原理和方法才行。
简单来说，基因定点突变的原理就是通过一些特定的技术手段，让我们想要改变的那个基因位点发生特定的变化。
这就好像是在一个复杂的地图上，准确地找到一个小点，然后给它标上不一样的颜色。
那实验过程呢，那可真是精细活儿。
首先得准备好各种材料和试剂，就像厨师做菜得准备好食材一样。
然后呢，要设计好突变的方案，这可得深思熟虑，不能马虎。
接下来，就是一系列复杂的操作啦。
比如说，得把基因片段提取出来，这就好比是从一大包东西里找出我们要的那个小物件。
然后呢，用各种酶啊、试剂啊去处理它，让它按照我们的想法发生变化。
这过程可不简单，就跟走迷宫似的，一个不小心可能就走错路了。
在实验过程中，每一步都得小心翼翼，就跟绣花似的。
稍微有点差错，可能就前功尽弃啦。
你说这是不是很考验耐心和技术啊？而且啊，这可不是一次就能成功的事儿。
有时候得反复尝试好多遍，就跟解一道很难很难的数学题一样，得不断地尝试不同的方法。
做完这些还不算完呢，还得检测突变是不是成功了。
这就好比是考试结束了，得看看自己考得咋样。
要是没成功，那就得重新再来一遍。
基因定点突变的研究，那可是对生命科学有着重要意义的呀！它能让我们更好地了解基因的功能，为治疗各种疾病提供新的思路和方法。
总之呢，基因定点突变可不是件容易的事儿，但它的意义和价值那可是大大的。
咱可得好好研究，说不定哪天就能给人类带来巨大的福音呢！这就是基因定点突变，神奇又充满挑战的领域！你难道不想深入了解一下吗？。
基因突变的影响实验
基因突变的影响实验在生物学领域中，基因突变是指基因组中发生的寿命的改变。
这些突变可能是由于复制错误、环境因素或其他外部影响导致的。
基因突变对生物体的发育和功能具有重大影响，因此，进行基因突变的影响实验对于理解基因功能和生物进化具有重要意义。
最早的基因突变影响实验可以追溯到1930年代，当时科学家们开始研究果蝇的基因突变。
以托马斯·亨特·摩尔根为首的实验室团队，通过观察果蝇个体的遗传变异现象，揭示了基因与性状之间的关系。
这项重要的实验开创了现代遗传学的研究。
随着科技的进步，现代基因突变的影响实验得以更深入地探究基因的功能和遗传特征。
例如，通过基因编辑技术如CRISPR-Cas9，科学家们可以精确地改变特定基因序列，进一步研究基因突变对生物体的影响。
在实验中，通过将基因突变引入模式生物体中，科学家们可以观察和比较其与野生型个体的差异。
通过对基因突变的影响进行实验，我门可以深入了解基因在发育过程中的作用，以及特定基因突变对生物体结构和功能的影响。
实验也可以揭示基因突变对生物体适应性的影响。
在不同环境条件下，通过引入特定基因突变，科学家们可以观察生物体的生存能力、繁殖力和适应能力是否受到了影响。
这对于探索生物进化和物种适应能力的机制非常重要。
此外，基因突变的影响实验还可以帮助科学家们研究遗传疾病和基因疗法的发展。
通过模拟特定基因突变，科学家们可以了解遗传病因并开发相应的诊断和治疗方法。
同时，实验也可以帮助验证基因疗法的有效性和安全性。
在进行基因突变影响实验时，科学家们需要遵循严格的伦理准则。
动物试验使用动物模型进行研究前要获得伦理审查批准，确保对动物实验的保护和福利。
此外，实验室实施必要的防护措施来保护实验人员的安全。
总结而言，基因突变的影响实验是生物学研究中至关重要的一部分。
通过实验，我们可以深入了解基因功能、遗传特征和生物进化的机制。
此外，基因突变影响实验还推动了遗传疾病的诊断和治疗方法的发展。
从体外培养的细胞中分离Pig-a基因突变细胞的方法[发明专利]
![从体外培养的细胞中分离Pig-a基因突变细胞的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/03e6c0ff55270722182ef7c9.png)
专利名称：从体外培养的细胞中分离Pig-a基因突变细胞的方法
专利类型：发明专利
发明人：李若婉,黄鹏程,周长慧,常艳
申请号：CN201811044150.7
申请日：20180907
公开号：CN110885778A
公开日：
20200317
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种从体外培养的细胞中分离Pig‑a基因突变细胞的方法及其应用。
所述的方法包括以下步骤：(1)将免疫荧光染料标记的抗GPI锚连蛋白抗体、抗所述免疫荧光染料的磁珠与所述的细胞混合；(2)分离磁珠标记的细胞与磁珠未标记的细胞，所述磁珠标记的细胞为Pig‑a基因突变阴性细胞，磁珠未标记的细胞为Pig‑a基因突变阳性细胞。
本发明的方法对去除细胞，例如人成淋巴TK6细胞中预存的Pig‑a阳性细胞具有较高的分离效率，15分钟内可分离1000万细胞，且操作简单，成本低廉。
申请人：上海益诺思生物技术股份有限公司
地址：201203 上海市浦东新区自由贸易试验区郭守敬路199号
国籍：CN
代理机构：上海弼兴律师事务所
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体内Pig-a基因突变试验方法的开发
体内Pig-a基因突变试验方法的开发体内Pig-a基因突变试验方法的开发张铭;周长慧;王庆利;常艳【期刊名称】《世界临床药物》【年(卷),期】2012(033)011【摘要】In vivo gene mutation is a key genetic toxicology endpoint. Recently, the International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) published genotoxic-guideline, more emphasis will be placed on the results of in vivo genotoxicity testing assays. In the recent years, a new in vivo genotoxicity tests have been developed, especially for the in vivo Pig-a gene mutation assay which is under international validation and potential to be a tool for regulatory safety assessment. This paper mainly reviews characteristics of the in vivo Pig-a gene mutation testing method and its application in the genotoxicity detection of new products.%体内基因突变是遗传毒理试验中非常重要的检测终点.国际人用药物注册技术协调会议(ICH)新版遗传毒性指导原则的出台,对体内遗传毒性检测方法的发展提出了更高的要求.新的检测体细胞突变的体内实验方法即磷脂酰肌醇聚糖A (Pig-a)基因突变试验,有望成为一项新药遗传毒性评价的标准试验.本文简要综述Pig-a体内基因突变试验的特点及其在新品种开发遗传毒性检测中的应用.【总页数】4页(684-687)【关键词】磷脂酰肌醇聚糖A基因;遗传毒性;药物安全性。
雷公藤甲素致L5178Y细胞及小鼠Pig-a基因突变风险评价
·基础研究·△［基金项目］ 国家自然科学基金项目（８１５０３３４７）；国家十三五“重大新药创制”专项（２０１８ＺＸ０９２０１ ０１７）［通信作者］ 文海若，副研究员，研究方向：遗传毒性评价；Ｔｅｌ：（０１０）６７８７６２５２，Ｅ ｍａｉｌ：ｈａｉｒｕｏｗｅｎ＠１６３ ｃｏｍ汪祺，副研究员，研究方向：药理毒理；Ｔｅｌ：（０１０）６７３９５２８２，Ｅ ｍａｉｌ：ｓａｎｓａｎ８２５１＠ｓｉｎａ ｃｏｍ雷公藤甲素致Ｌ５１７８Ｙ细胞及小鼠Ｐｉｇ ａ基因突变风险评价△王亚楠１，闫明１，２，汪祺１ ，文海若１１ 中国食品药品检定研究院，北京 １０００５０；２ 中国药科大学，江苏 南京 ２１０００９［摘要］ 目的：评价雷公藤甲素（ＴＰＬ）的潜在致Ｐｉｇ ａ基因突变风险。
方法：采用小鼠淋巴瘤Ｌ５１７８Ｙ细胞分别进行非Ｓ９（－Ｓ９）代谢和Ｓ９（＋Ｓ９）代谢条件下体外实验。
－Ｓ９代谢条件实验中，Ｌ５１７８Ｙ细胞分为对照组（１％二甲基亚砜）、阳性对照甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ，５００μｇ·ｍＬ－１）组和ＴＰＬ各质量浓度（６ ３、１２ ５、２５ ０、５０ ０、１００ ０ｎｇ·ｍＬ－１）组，受试物处理２４ｈ后细胞计数，更换培养基培养８ｄ，表达结束后进行流式检测。
＋Ｓ９代谢条件实验中，Ｌ５１７８Ｙ细胞分为对照组（１％二甲基亚砜）、阳性对照苯并芘［Ｂ（ａ）Ｐ，５μｇ·ｍＬ－１］组和ＴＰＬ各质量浓度（１２ ５、２５ ０、５０ ０、１００ ０、２００ ０ｎｇ·ｍＬ－１）组，受试物处理４ｈ后更换培养基，２４ｈ后计数，培养８ｄ，表达结束后进行流式检测。
体内Ｐｉｇ ａ基因突变实验中，ＫＭ小鼠按体质量随机分为对照组（０ ５％羧甲基纤维素钠）、阳性对照Ｎ 乙基 Ｎ 亚硝基脲（ＥＮＵ，１００ｍｇ·ｋｇ－１）组和ＴＰＬ各剂量（５０、１００、２００μｇ·ｋｇ－１）组。
ＥＮＵ组仅于首次给药日给药１次，ＴＰＬ各剂量组连续给药２８ｄ，分别于给药前和首次给药后１４、２８、４２、５６ｄ于小鼠眼内眦采血，血样经缓冲液洗脱后，进行ａｎｔｉ ＣＤ２４ ＰＥ和ａｎｔｉ ＣＤ６１ ＰＥ标记，采用免疫磁性分离架进行柱前和柱后样品的收集，利用流式细胞仪对样本进行检测计数，对突变率进行统计分析。
大鼠体内Pig-a基因突变试验流式细胞术检测方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010715818.7(22)申请日 2020.07.23(71)申请人 四川大学地址 610000 四川省成都市武侯区一环路南一段24号(72)发明人 陈锦瑶 霍娇 张立实 刘运杰 马思佳 曾珠 岳茜岚 (74)专利代理机构 重庆憨牛知识产权代理有限公司 50261代理人 梁金金(51)Int.Cl.G01N 15/14(2006.01)G01N 15/00(2006.01)G01N 1/30(2006.01)G01N 1/28(2006.01)(54)发明名称大鼠体内Pig-a基因突变试验流式细胞术检测方法(57)摘要本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种大鼠外周血Pig ‑a基因突变试验流式细胞术检测方法，其包括以下步骤：步骤一：目标组织细胞采集；步骤二：表面抗原染色；步骤三：核酸染料应用液染色；步骤四：染色结束后，使用双激光流式细胞仪对样本进行检测以获取数据。
该检测方法使用前向角散射(forward scatter，FSC)和侧向角散射(side scatter，SSC)区别红细胞，SYTO 13标记网织红细胞，CD59‑别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)标记突变细胞，提供了一种更为简便节约的大鼠外周血Pig ‑a基因突变试验流式细胞术检测方法。
权利要求书2页 说明书7页 附图2页CN 111829940 A 2020.10.27C N 111829940A1.大鼠外周血Pig-a基因突变试验流式细胞术检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：步骤一：目标组织采集，采集受试大鼠外周血；所采集的外周血为自然流动静脉血或动脉血，并使用1000U/mL肝素钠溶液混匀防止凝血，其中外周血与1000U/mL肝素钠溶液体积比为5:1，然后将混合的外周抗凝血置于4℃避光环境保存待检；步骤二：表面抗原染色，将待检样本与抗体应用液混合染色；若采用双染方案进行染色，取步骤一中的外周抗凝血作为待检样本与抗体应用液按照体积比1:5进行混合，混匀后置于4℃避光环境染色30分钟；每100μL抗体应用液中包括3μg的CD59-APC和2％胎牛血清的PBS；若采用三染方案进行染色，取步骤一中的外周抗凝血作为待检样本与抗体应用液按照体积比1:5进行混合，混匀后置于4℃避光环境染色30分钟；每100μL抗体应用液中包括3μg 的CD59-APC、1μg的CD61-PE和2％胎牛血清的PBS；步骤三：将样本与核酸染料应用液混合染色；表面抗原染色结束后，使用PBS离心5分钟清洗一次，转速300g/min；弃上清，收集底层细胞，使用核酸染料应用液混匀染色，待检样本与核酸染料应用液按照体积比1:50进行混合，所述核酸染料应用液包含150nmol/L SYTO 13的PBS，于37℃避光孵育30分钟，孵育后将样本转移至流式细胞管中，并于4℃避光保存待检；步骤四：染色结束后，使用双激光流式细胞仪对样本进行检测以获取数据；若步骤二使用双染方案，则流式细胞仪具体设门步骤为：a1、使用FSC、SSC确定红细胞群，排除血小板、细胞碎片、粘连；b1、使用FITC通道信号设门排除噪音和白细胞干扰；c1、使用APC通道和FITC通道确定不同细胞群，其中APC通道标记CD59，阴性表达代表突变，FITC通道获取SYTO 13荧光信号，标记RNA；d1、使用模拟突变细胞样本作为参照调整十字门位置；若步骤二使用三染方案，则流式细胞仪具体设门步骤为：a2、使用FSC、SSC确定红细胞群，排除血小板、细胞碎片、粘连；b2、使用FITC通道信号设门排除噪音和白细胞干扰；c2、使用PE通道设门进一步排除不同程度的粘连血小板；d2、用APC通道和FITC通道确定不同细胞群，其中APC通道标记CD59，阴性表达代表突变，FITC通道获取SYTO 13荧光信号，标记RNA；e2、使用模拟突变细胞样本作为参照调整十字门位置；经设门后，APC+/SYTO 13+为野生网织红细胞群，APC+/SYTO 13-为野生成熟红细胞群，APC+/SYTO 13-为突变网织红细胞群，APC-/SYTO 13-为突变成熟红细胞群；试验分析指标为网织红细胞突变率、成熟红细胞突变率和网织红细胞比例；每样本至少检测1×106个成熟红细胞中突变成熟红细胞的数量，0.3×106个网织红细胞中突变网织红细胞的数量；具体计算公式为：成熟红细胞突变率×10-6＝突变成熟红细胞/总成熟红细胞×106；网织红细胞突变率×10-6＝突变网织红细胞/总网织红细胞×106；网织红细胞比例％＝总网织红细胞/总红细胞×100；成熟红细胞和网织红细胞突变率以每百万细胞中突变细胞数表示。
Pig-a基因突变试验研究与应用进展
Pig-a基因突变试验研究与应用进展霍娇;李岩;陈锦瑶;张立实【期刊名称】《中国药理学与毒理学杂志》【年(卷),期】2015(29)1【摘要】Pig-a基因位于人类X染色体短臂,参与糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接蛋白的早期合成.Pig-a基因突变后不能正常合成GPI连接蛋白,致使细胞表型缺失,是阵发性睡眠性血红蛋白尿症发病的分子机制.该特性被应用于一项新的体内致突变试验——Pig-a基因突变试验:动物经过一次或多次染毒,一段时间后收集少量目标细胞,即可采用流式细胞术或有限稀释法对细胞突变频率进行定量检测,从而判定化学物的致突变性.Pig-a基因突变试验具有相对快捷、样品需求量小、可与重复毒性试验相结合的优势,能够更为全面可靠地评价受试物遗传毒性,被认为具有良好的应用前景.【总页数】5页(P174-178)【作者】霍娇;李岩;陈锦瑶;张立实【作者单位】四川大学华西公共卫生学院四川省食品安全监测与风险评估重点实验室,四川成都610041;四川大学华西公共卫生学院四川省食品安全监测与风险评估重点实验室,四川成都610041;四川大学华西公共卫生学院四川省食品安全监测与风险评估重点实验室,四川成都610041;四川大学华西公共卫生学院四川省食品安全监测与风险评估重点实验室,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】R394.6【相关文献】1.体内Pig-a基因突变试验高通量方法联合验证研究 [J], 张铭;周长慧;常艳;王征;涂宏刚;李婕2.大鼠Pig-a基因突变试验中N-乙基-N-亚硝基脲和环磷酰胺量-效关系的优化[J], 刘香梅;李培宁;刘冬虹;黄宇锋;庞增雄;陈梓灵;徐颖愉;丘智峰3.Pig-a基因突变试验研究进展 [J], 郑丹丹;秦美蓉;王晓炜;王平4.Pig-a基因突变试验研究进展 [J], 陈高峰; 王亚楠; 王丹; 毛志慧; 黄芝瑛; 文海若; 王雪5.基于L5178Y细胞体外Pig-a基因突变试验方法的建立与初步探索 [J], 王亚楠; 文海若; 王雪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
再生障碍性贫血患者PIG-A基因外显子2、4、5突变及粒细胞CD 55、CD 59的表达
再生障碍性贫血患者PIG-A基因外显子2、4、5突变及粒细胞CD 55、CD 59的表达李玉云;昝丽娜;王卫国【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2009(021)004【摘要】背景与目的:探讨再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)患者PIG-A基因外显子2、4、5的突变及粒细胞表面CD55、CD59锚蛋白表达的情况. 材料与方法:从30例AA患者及20例正常对照组人群外周血提取基因组DNA,采用PCR扩增PIC-A基因外显子2、4、5,再将纯化的PCR产物双向测序检测基因序列;并用流式细胞术检测两组人群外周血粒细胞中CD55、CD59的表达. 结果:30例从患者中11例发现PIG-A基因外显子2突变,包括碱基替代、缺失、插入;PIG-A基因外显子4和外显子5突变各5例,仅为碱基替代;共5例患者有2个或2个以上外显子存在突变,正常对照组未发现突变.粒细胞CD55和CD59的表达率在AA患者PIG-A基因突变者中分别为(86.57 4±5.90)%、(88.174±5.90)%,在PIG-A基因未突变者中分别为(91.874±4.79)%、(94.24±3.76)%.均较正常对照组(97.864±1.52)%、(98.824±1.42)%显著降低(P均<0.05).结论:再生障碍性贫血患者存在PIG-A基因突变和粒细胞CD55、CD59表达缺失的现象,提示再障患者可能存在造血的克隆源性异常.%BACKGROUND AND AIM: To explore mutations of PIG-A gene exon2, exon4, exon5 and expression of CD55 and CD59 in granulocytes of patients with aplastic anemia. MATERIALS AND METHODS: Genomic DNA from peripheral blood of 30 aplastic anemia patients and 20 normal controls were extracted, and PIG-A gene exon2, exon4, exon5 were thenexamined with polymerase chain reaction (PCR) , nucleotide sequences were analyzed by bidirectional sequencing after PCR products were purified. The expressions of CD55 and CD59 in granulocytes from peripheral blood of the two groups above were detected by flow cytometry. RESULTS: The mutations of PIG-A gene exon2 including base substitution, deletion, insertion occurred in 11 of 30 aplastic anemia patients , the mutations of exon4, exon5 were also found in five aplastic anemia patients, with only base substitution. Two or more exon mutations were found in 5 aplastic anemia patients, but the normal controls had no in mutations. The expression of CD55 and CD59 were (86.57 ± 5.90) % and (88.17 ± 5.90) % , respectively, in aplastic anemia patients with PIG-A gene mutation; and (91.87 ± 4.79) % and (94.24 ± 3.76) %, respectively, in aplastic anemia patients with no PIG-A gene mutation. Both were significantly decreased(P < 0.05) compared with (97.86 ± 1.52) % and (98.82 ± 1.42) %, respectively, in granulocyt es of normal control group. CONCLUSION: The PIG-A gene mutations and decreased expressions of CD55 and CD59 in granulocytes may suggest clonal hematopoietic in patients with aplastic anemia.【总页数】4页(P254-257)【作者】李玉云;昝丽娜;王卫国【作者单位】蚌埠医学院临床检验教研室;蚌埠医学院临床检验诊断实验中心,安徽,蚌埠,233030;阜阳市人民医院检验科,安徽,阜阳,236003【正文语种】中文【中图分类】R556.5【相关文献】1.再生障碍性贫血患者外周血CD55、CD59表达分析 [J], 张丽;陈婷婷;刘永林;周郁鸿;李晓芳;陈益民2.再生障碍性贫血外周血CD55-、CD59-细胞表达的临床意义 [J], 范志伟;杨桂玲;汪清铭;石庆之;汤爱萍3.再生障碍性贫血外周血CD55-、CD59-细胞表达的临床意义 [J], 范志伟;杨桂玲;汪清铭;石庆之;汤爱萍4.CD55、CD59在急性淋巴细胞白血病患者外周血中性粒细胞膜中表达情况的分析 [J], 陈慧; 陈会慧; 徐浩; 谌廷妹; 张婧5.CD_(55)、CD_(59)分子在慢性再生障碍性贫血肾阳虚证患者中的表达观察 [J], 胡琦;王运律;杨协珍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基因变异猪
基因变异猪
美国科学家戴维·萨奇斯宣称，他已研制出一种特殊的“基因变异猪”，它的心脏、肝脏或肾脏等器官如果移植到人体内，不会产生明显的排异现象。
此前他已将这种猪的器官移植到了一只狒狒身上，而这只狒狒存活了83天戴维称，早在2003年，他所在的实验室就饲养出了一种特殊的“基因变异猪”———这种猪
的体内缺少一种关键的糖分子，这种糖分子只在普通的猪体内存在，而人类和其他灵长类动物身上都没有。
如果猪的细胞中没有这种糖分子，那么灵长类动物———包括人类的免疫系统，就不会认出这种猪的移植器官是“外来异物”，因而不会立即对它们进行排斥。
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Pig-a基因突变试验——研究与应用进展
李岩，霍娇，张立实
四川大学华西公共卫生学院，四川省食品安全监测与风险评估重点实验室
327098360@
遗传毒性评估是化学品和药品安全性评价的重要组成部分，现有致突变试验虽已很多，但仍不能完全满足毒理学安全性评价和风险评估的要求。
近几年来，一项新的体内致突变试验——Pig-a基因突变试验受到广泛关注，该试验的检测终点为基因突变，且能够利用流式细胞术对人体突变细胞频率实现高通量检测。
Pig-a基因位于人类X染色体，编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶复合物，参与糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接蛋白的早期合成。
当Pig-a基因发生突变时，细胞不能正常合成GPI连接蛋白，致使造血干细胞最终分化的血细胞（包括红细胞等）表型缺失。
Hall等学者收集患者外周血，用荧光标记的单抗与细胞GPI连接蛋白反应，使用流式细胞术（FCM)）检测未被荧光标记的突变细胞，根据表型缺失细胞的比例来诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）。
鉴于对PNH中Pig-a基因的研究以及FCM对Pig-a基因表型缺失的成功检测，不少学者期望使用Pig-a基因作为体细胞突变实验的报告基因。
目前已建立两种方法测定Pig-a基因突变率：流式细胞术或有限稀释法。
流式细胞术方法利用梯度离心液等方式富集目标细胞，利用荧光标记的抗体与目标细胞孵育，标记目标细胞，以及至少标记一种GPI连接蛋白标志物。
之后利用散射光区分血小板、白细胞和红细胞，核酸染色还可用于区分正染红细胞和网织红细胞。
另一种检测方法为有限稀释法。
淋巴细胞能够将前气单胞菌溶素转变为气单胞菌溶素，气单胞菌溶素能够与正常细胞GPI连接蛋白结合，导致细胞膜完整性受损以致细胞死亡。
而Pig-a基因发生突变的细胞GPI连接蛋白缺失，因此得以存活。
该方法利用ProAER作为选择物质，使发生突变T淋巴细胞在96孔板内克隆性生长，而未突变的细胞死亡。
Pig-a基因突变试验能够利用少量样本相对迅速地得到较为精确的结果，并节省实验室工作量。
有学者将Pig-a基因突变试验、体内微核试验与28天重复剂量染毒试验结合应用，通过收集不同时间点外周血，同时检测同一动物同一靶组织的非整倍体诱变剂、染色体断裂诱变剂和基因突变诱变剂。
该整合方法不仅可比较化学物对同一动物造成的不同遗传学终点损伤，还可以研究重复染毒对突变频率的影响，并且大量节省实验动物，实验过程更为简便快捷。
关键词：Pig-a基因，流式细胞术，遗传毒性。