超高效液相色谱法快速检测粮食中玉米赤霉烯酮的含量_谢刚
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［5 ］ ［3 ］ ［6 － 7 ］ ， 赤霉烯酮的污染 危害消费者健康。 研究表明： 我国儿童对 ZEN 的膳食暴露量均高于成人， 是膳食 ［8 ］ 暴露 ZEN 的高危人群 。 我国食品安全国家标准
《食品中真菌毒素限量》 （ GB 2761 —2011 ） 中规定谷 物及其制品中玉米赤霉烯酮限量为 60 μg / kg。 目前报道用于检测玉米赤霉烯酮的分析方法 ［9］ ［10］ 有酶联免 疫 法 、 免疫胶体金试纸法 、 气相色
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收稿日期： 2013 － 09 － 29 基金项目： 国家科技部 863 课题（ 2012AA101609 ） 1974 年出生， 作者简介： 谢刚， 男， 副研究员． 1977 年出生， 通讯作者： 王松雪， 男， 博士， 研究员．
质量Βιβλιοθήκη Baidu全
近年来建立在亚 2 μm 填料技术上的超高效液相色 具有超高分离度、 超快速度、 超高 谱系统（ UPLC ） ， ［18 － 19 ］ 。本文结合 灵敏度的特点， 适于微量快速分析 免疫亲和净化手段， 基于超高压快速液相色谱分离 技术， 建立了一种进样量小、 分离度高、 快速准确、 环 以满足当前绿色 保的玉米赤霉烯酮定量分析方法， 。 检验的需要
添加 ZEN 的小麦、 玉米样品， 每个浓度做 5 个 平行样检测， 测方法回收率， 结果见表 4 。 对小麦和
图3 玉米赤霉烯酮的色谱图 ZEN 的保留体积 0． 2 0． 48 标准偏差 相对标准偏差 （ STD） （ ＲSD） / % 0． 006 1． 3 样品 添加量 / （ ng / g） 小麦 20 /50 /100 20 /50 /100 玉米 表1 流速 / （ mL / min） 保留体积 / mL 0． 1 0． 47
［11］ ［12］ 谱 —质谱联用 法 、 高效液相色谱法 、 液相色 ［13 － 14］ 、 谱 —质谱联用法 多不对称波形离子迁移谱 ［16］ 、 间接 竞 争 免 疫 分 辨 荧 光 免 疫 分 析 、 薄 ［17］ 。 ， 层色谱法 等 薄层色谱法由于操作复杂 目前
质谱
［15］
。我国小麦和玉米中也经常发生玉米
粮油食品科技 第 22 卷 2014 年 第 2 期
到样品提取液。 1． 5． 2 样品净化与洗脱 将免疫亲和柱连接于 10 mL 玻璃注射器下。准 确移取 10． 0 mL 上述提取滤液注入玻璃注射器中， 将空气压力泵与玻璃注射器连接， 调节压力使溶液 直至有 以约 1 ～ 2 滴 / s 流速缓慢通过免疫亲和柱， 。 10 mL 1 部分空气通过柱体 以 水淋洗柱子 次， 弃 去全部流出液， 并使部分空气通过柱体。 准确加入 1． 0 mL 甲醇洗脱， 流速控制为 1 ～ 2 mL / min， 收集全 部洗脱液于玻璃试管中， 过 0． 22 μm 有机滤膜， 供 测定。 1． 6 样品测定 将玉米赤霉烯酮标准工作液和样液按上述色谱 条件进行 UPLC 分析， 得到标准曲线回归方程， 以外
应用较少 ； 胶体金和酶联免疫方法用于快速筛查 ； 普通液相色 谱 方 法 目 前 应 用 较 多 ， 但分析速度较 慢， 耗费溶 剂 较 多 ， 成 本 高； 液 质 联 用 仪 检 测 需 要 高 高端的质 谱 仪 。 当 前 急 需 建 立 一 种 更 加 灵 敏 、 效、 低溶剂量的玉米赤霉烯酮微量快速定量方法 。
Ｒapid detection of zearalenone in grain by UPLC
XIE Gang，WANG Song － xue，CUI Hua，ZHANG Yan，LI Ｒui （ Academy of State Administration of Grain，Beijing 100037 ） Abstract： A rapid method，immunoaffinity column － ultra － high performance liquid chromatography，was established for determining zearalenone （ ZEN） in grain． The retention volume of ZEN was 0． 47 mL，the detection limit 5 pg． The linear detection ranges of ZEN was 10 ～ 500 pg with correlation coefficients （ Ｒ2 ） of 0． 999 9． Ｒecovery rates in grains （ wheat，corn） spiked with ZEN was in the range of 85% ～ 102% ， 83% ～ 112% ，respectively，with the relative standard deviation of 2． 7% ～ 6． 9% ． The method with analytical time less than 45 min was suitable for the determination of ZEN in the raw grain，with the advantages of simplicity，rapidness，sensitivity，good reproducibility，and less solvent． Key words： grain； zearalenone （ ZEN ） ； ultra － high performance liquid chromatography （ UPLC ） ； immunoaffinity column（ IAC ） ZEN ） 又称 F － 2 玉米赤霉烯酮 （ Zearalenone， 毒素， 主要由木贼镰刀菌 （ Fusarium． equiseti ） 、 尖孢 镰刀菌 （ Fusarium． oxysporum ） 、 禾谷镰刀菌 （ Fusarium． graminearum ） 、 三 线 镰 刀 菌 （ Fusarium． trcinctum） 、 茄 病 镰 刀 菌 （ Fusarium． solani ） 、 串珠镰刀菌 ［1 － 2 ］ （ Fusarium． moniliforme ） 等 产 生 。 ZEN 是 一 种 有强烈的致畸作用 ， 生殖系统毒素 （ 雌性激素 ） ， ［4 ］ 被国际癌症研究中心归类为 3 类致癌物 ， 主要污 染小麦、 大麦、 水稻、 玉米、 小米和燕麦等谷物。小麦 粉、 啤酒等农产品加工品中也常能检测到该毒素的 存在。阿根廷报道新收获玉米的含量在未检出到 83 mg / kg 之 间，储 存 玉 米 的 含 量 在 未 检 出 到 17 mg / kg 之间
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质量安全
超高效液相色谱法快速检测粮食中 玉米赤霉烯酮的含量
谢 刚， 王松雪， 崔 华， 张 艳， 黎 睿
（ 国家粮食局科学研究院，北京 100037 ） 摘 要： 建立了免疫亲和柱净化—超高效液相色谱法快速测定粮食中玉米赤霉烯酮 （ Zearalenone， ZEN） 的方法。ZEN 的保留体积为 0． 47 mL， 检出限为 5 pg， 在 10 ～ 500． 0 pg 范围内呈线性相关， 相 2 关系数 Ｒ 值为 0． 999 9 ； 在小麦、 玉米样品中的加标回收率分别为 85% ～ 102% 和 83% ～ 112% ， 精密 度为 2． 7% ～ 6． 9% 。本方法从样品前处理到分析整个过程小于 45 min， 简便快速、 灵敏度高、 重现 性好、 溶剂用量少， 适用于粮食中玉米赤霉烯酮的快速测定 。 关键词： 粮食； 玉米赤霉烯酮； 超高效液相色谱； 免疫亲和柱 中图分类号： TS 207． 3 文献标识码： A 文章编号： 1007 － 7561 （ 2014 ） 02 － 0071 － 05
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质量安全
方法进行检测。 添加量为 100 ng / g 的同一批样品 每天测 7 次， 做方法精密度实验， 结果 重复测 7 天， 见表 3 。从表 3 的数据看， 方法具有较好的精密度。
表3 ＲSD s r / % 精密度实验结果 日内 2． 7% 日间 6． 9%
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1． 1
材料与方法
仪器与试剂 超高效液相色谱仪 （ Acquity UPLC ） ： 美国 Wa-
ters 公 司； 荧 光 检 测 器 （ FLD ） ： 美 国 Waters 公 司； EMPOWEＲ 色谱工作站； 玉米赤霉烯酮免疫亲和柱： 90mm ） ： 美国 Vicam 公司； 玻璃纤维滤纸 （ GF / B ， 英国 Whatman 公司； 0． 22 μm 有机滤膜： 天津津腾； 6 位泵流操作架： 北京中检维康公司； PL403IC 型电 子分析天平： 梅特勒上海有限公司； Pulverisette14 高 速旋转粉碎机： 德国 Fritsch 公司； 高速均质器： 美国 Waring 公司。 玉米赤霉 烯 酮 甲 醇 溶 液 标 准 品 ： 国 家 粮 食 局 乙腈 （ 色谱纯 ） ： 美国 Fisher 科学研究院研制 ； 甲醇 、 公司 ； 实验用 水 为 Milli － Q 超 纯 水 ： 美 国 Millipore 公司 。 1． 2 玉米赤霉烯酮标准溶液的配制 准确移取一定体积的玉米赤霉烯酮溶液标准物 ， 浓度分 质 用流动相稀释成适当浓度的标准工作液 ， 10 、 20 、 50 、 100 、 200 、 500 μg / L。 别为 0 、 色谱条件 Acquity UPLC ； 色 谱 柱： Waters Acquity UPLC BEH C18 （ 50 mm × 2． 1 mm，1． 7 μm ） ； 流动相 ∶ 乙腈 + 水 + 甲醇， 按体积比 46∶ 46∶ 8 混合， 并脱气； 流速： 0． 15 mL / min； 柱温： 25 ℃ ； 进样量： 1 μL； 检 测 器： Acquity FLD 检 测 器， 激 发 波 长 305 nm； 发 射 波 长 1． 3 455 nm； 样品室温度： 25 ℃ 。 1． 4 样品加标 未检出 ZEN 的稻谷、 小麦、 玉米样品用高速旋 转粉碎机粉碎， 过 0． 5 mm 筛。 称取 40 g 粉碎的稻 谷、 小麦、 玉米样品分别放入 250 mL 具塞三角瓶中， 添加玉米赤霉烯酮标准溶液， 使小麦、 玉米中 ZEN 20 、 50 、 100 ng / g ， ， 的含量分别为 避光 室温过夜。 1． 5 样品提取与净化 1． 5． 1 样品提取 将稻谷、 小麦、 玉米样品及过夜后的加标样品， 加入 4 g 氯化钠和 100 mL 甲醇—水（ 8 + 2 ） ， 以均质 器高速搅拌提取 2 min， 通过折叠快速定性滤纸过 滤， 准确移取 10． 0 mL 滤液并加入 30． 0 mL 水稀释 混匀， 用玻璃纤维滤纸过滤 1 ～ 2 次， 至滤液澄清， 得
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标法定量， 计算样品中玉米赤霉烯酮的含量 。
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2． 1
结果与分析
激发波长、 发射波长的选择 用荧光 实验过程中采用流动相作为背景溶液， 检测器对玉米赤霉烯酮标准液在 190 ～ 600 nm 进行 扫描（ 见图 1 ） 。 结果表明， 玉米赤霉烯酮最佳激发 波长为 305 nm， 最佳发射波长为 460 nm。
玉米加标样品的考察结果显示， 本方法的回收率为 83 ～ 112% （ 见表 4 ） 。
图1
玉米赤霉烯酮激发波长扫描谱图
图2
玉米赤霉烯酮发射波长扫描谱图
2． 2
流动相及流速 根据以上条件， 参考 GB / T 5009． 209 —2008 的 流动相， 以乙腈 + 水 + 甲醇， 按体积比 46 ∶ 46 ∶ 8 混 合， 流速不同时， 峰的保留体积基本相同， 表明该流 ZEN ， 1 。 动相对 来说很稳定 结果见表
《食品中真菌毒素限量》 （ GB 2761 —2011 ） 中规定谷 物及其制品中玉米赤霉烯酮限量为 60 μg / kg。 目前报道用于检测玉米赤霉烯酮的分析方法 ［9］ ［10］ 有酶联免 疫 法 、 免疫胶体金试纸法 、 气相色
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收稿日期： 2013 － 09 － 29 基金项目： 国家科技部 863 课题（ 2012AA101609 ） 1974 年出生， 作者简介： 谢刚， 男， 副研究员． 1977 年出生， 通讯作者： 王松雪， 男， 博士， 研究员．
质量Βιβλιοθήκη Baidu全
近年来建立在亚 2 μm 填料技术上的超高效液相色 具有超高分离度、 超快速度、 超高 谱系统（ UPLC ） ， ［18 － 19 ］ 。本文结合 灵敏度的特点， 适于微量快速分析 免疫亲和净化手段， 基于超高压快速液相色谱分离 技术， 建立了一种进样量小、 分离度高、 快速准确、 环 以满足当前绿色 保的玉米赤霉烯酮定量分析方法， 。 检验的需要
添加 ZEN 的小麦、 玉米样品， 每个浓度做 5 个 平行样检测， 测方法回收率， 结果见表 4 。 对小麦和
图3 玉米赤霉烯酮的色谱图 ZEN 的保留体积 0． 2 0． 48 标准偏差 相对标准偏差 （ STD） （ ＲSD） / % 0． 006 1． 3 样品 添加量 / （ ng / g） 小麦 20 /50 /100 20 /50 /100 玉米 表1 流速 / （ mL / min） 保留体积 / mL 0． 1 0． 47
［11］ ［12］ 谱 —质谱联用 法 、 高效液相色谱法 、 液相色 ［13 － 14］ 、 谱 —质谱联用法 多不对称波形离子迁移谱 ［16］ 、 间接 竞 争 免 疫 分 辨 荧 光 免 疫 分 析 、 薄 ［17］ 。 ， 层色谱法 等 薄层色谱法由于操作复杂 目前
质谱
［15］
。我国小麦和玉米中也经常发生玉米
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到样品提取液。 1． 5． 2 样品净化与洗脱 将免疫亲和柱连接于 10 mL 玻璃注射器下。准 确移取 10． 0 mL 上述提取滤液注入玻璃注射器中， 将空气压力泵与玻璃注射器连接， 调节压力使溶液 直至有 以约 1 ～ 2 滴 / s 流速缓慢通过免疫亲和柱， 。 10 mL 1 部分空气通过柱体 以 水淋洗柱子 次， 弃 去全部流出液， 并使部分空气通过柱体。 准确加入 1． 0 mL 甲醇洗脱， 流速控制为 1 ～ 2 mL / min， 收集全 部洗脱液于玻璃试管中， 过 0． 22 μm 有机滤膜， 供 测定。 1． 6 样品测定 将玉米赤霉烯酮标准工作液和样液按上述色谱 条件进行 UPLC 分析， 得到标准曲线回归方程， 以外
应用较少 ； 胶体金和酶联免疫方法用于快速筛查 ； 普通液相色 谱 方 法 目 前 应 用 较 多 ， 但分析速度较 慢， 耗费溶 剂 较 多 ， 成 本 高； 液 质 联 用 仪 检 测 需 要 高 高端的质 谱 仪 。 当 前 急 需 建 立 一 种 更 加 灵 敏 、 效、 低溶剂量的玉米赤霉烯酮微量快速定量方法 。
Ｒapid detection of zearalenone in grain by UPLC
XIE Gang，WANG Song － xue，CUI Hua，ZHANG Yan，LI Ｒui （ Academy of State Administration of Grain，Beijing 100037 ） Abstract： A rapid method，immunoaffinity column － ultra － high performance liquid chromatography，was established for determining zearalenone （ ZEN） in grain． The retention volume of ZEN was 0． 47 mL，the detection limit 5 pg． The linear detection ranges of ZEN was 10 ～ 500 pg with correlation coefficients （ Ｒ2 ） of 0． 999 9． Ｒecovery rates in grains （ wheat，corn） spiked with ZEN was in the range of 85% ～ 102% ， 83% ～ 112% ，respectively，with the relative standard deviation of 2． 7% ～ 6． 9% ． The method with analytical time less than 45 min was suitable for the determination of ZEN in the raw grain，with the advantages of simplicity，rapidness，sensitivity，good reproducibility，and less solvent． Key words： grain； zearalenone （ ZEN ） ； ultra － high performance liquid chromatography （ UPLC ） ； immunoaffinity column（ IAC ） ZEN ） 又称 F － 2 玉米赤霉烯酮 （ Zearalenone， 毒素， 主要由木贼镰刀菌 （ Fusarium． equiseti ） 、 尖孢 镰刀菌 （ Fusarium． oxysporum ） 、 禾谷镰刀菌 （ Fusarium． graminearum ） 、 三 线 镰 刀 菌 （ Fusarium． trcinctum） 、 茄 病 镰 刀 菌 （ Fusarium． solani ） 、 串珠镰刀菌 ［1 － 2 ］ （ Fusarium． moniliforme ） 等 产 生 。 ZEN 是 一 种 有强烈的致畸作用 ， 生殖系统毒素 （ 雌性激素 ） ， ［4 ］ 被国际癌症研究中心归类为 3 类致癌物 ， 主要污 染小麦、 大麦、 水稻、 玉米、 小米和燕麦等谷物。小麦 粉、 啤酒等农产品加工品中也常能检测到该毒素的 存在。阿根廷报道新收获玉米的含量在未检出到 83 mg / kg 之 间，储 存 玉 米 的 含 量 在 未 检 出 到 17 mg / kg 之间
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超高效液相色谱法快速检测粮食中 玉米赤霉烯酮的含量
谢 刚， 王松雪， 崔 华， 张 艳， 黎 睿
（ 国家粮食局科学研究院，北京 100037 ） 摘 要： 建立了免疫亲和柱净化—超高效液相色谱法快速测定粮食中玉米赤霉烯酮 （ Zearalenone， ZEN） 的方法。ZEN 的保留体积为 0． 47 mL， 检出限为 5 pg， 在 10 ～ 500． 0 pg 范围内呈线性相关， 相 2 关系数 Ｒ 值为 0． 999 9 ； 在小麦、 玉米样品中的加标回收率分别为 85% ～ 102% 和 83% ～ 112% ， 精密 度为 2． 7% ～ 6． 9% 。本方法从样品前处理到分析整个过程小于 45 min， 简便快速、 灵敏度高、 重现 性好、 溶剂用量少， 适用于粮食中玉米赤霉烯酮的快速测定 。 关键词： 粮食； 玉米赤霉烯酮； 超高效液相色谱； 免疫亲和柱 中图分类号： TS 207． 3 文献标识码： A 文章编号： 1007 － 7561 （ 2014 ） 02 － 0071 － 05
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方法进行检测。 添加量为 100 ng / g 的同一批样品 每天测 7 次， 做方法精密度实验， 结果 重复测 7 天， 见表 3 。从表 3 的数据看， 方法具有较好的精密度。
表3 ＲSD s r / % 精密度实验结果 日内 2． 7% 日间 6． 9%
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材料与方法
仪器与试剂 超高效液相色谱仪 （ Acquity UPLC ） ： 美国 Wa-
ters 公 司； 荧 光 检 测 器 （ FLD ） ： 美 国 Waters 公 司； EMPOWEＲ 色谱工作站； 玉米赤霉烯酮免疫亲和柱： 90mm ） ： 美国 Vicam 公司； 玻璃纤维滤纸 （ GF / B ， 英国 Whatman 公司； 0． 22 μm 有机滤膜： 天津津腾； 6 位泵流操作架： 北京中检维康公司； PL403IC 型电 子分析天平： 梅特勒上海有限公司； Pulverisette14 高 速旋转粉碎机： 德国 Fritsch 公司； 高速均质器： 美国 Waring 公司。 玉米赤霉 烯 酮 甲 醇 溶 液 标 准 品 ： 国 家 粮 食 局 乙腈 （ 色谱纯 ） ： 美国 Fisher 科学研究院研制 ； 甲醇 、 公司 ； 实验用 水 为 Milli － Q 超 纯 水 ： 美 国 Millipore 公司 。 1． 2 玉米赤霉烯酮标准溶液的配制 准确移取一定体积的玉米赤霉烯酮溶液标准物 ， 浓度分 质 用流动相稀释成适当浓度的标准工作液 ， 10 、 20 、 50 、 100 、 200 、 500 μg / L。 别为 0 、 色谱条件 Acquity UPLC ； 色 谱 柱： Waters Acquity UPLC BEH C18 （ 50 mm × 2． 1 mm，1． 7 μm ） ； 流动相 ∶ 乙腈 + 水 + 甲醇， 按体积比 46∶ 46∶ 8 混合， 并脱气； 流速： 0． 15 mL / min； 柱温： 25 ℃ ； 进样量： 1 μL； 检 测 器： Acquity FLD 检 测 器， 激 发 波 长 305 nm； 发 射 波 长 1． 3 455 nm； 样品室温度： 25 ℃ 。 1． 4 样品加标 未检出 ZEN 的稻谷、 小麦、 玉米样品用高速旋 转粉碎机粉碎， 过 0． 5 mm 筛。 称取 40 g 粉碎的稻 谷、 小麦、 玉米样品分别放入 250 mL 具塞三角瓶中， 添加玉米赤霉烯酮标准溶液， 使小麦、 玉米中 ZEN 20 、 50 、 100 ng / g ， ， 的含量分别为 避光 室温过夜。 1． 5 样品提取与净化 1． 5． 1 样品提取 将稻谷、 小麦、 玉米样品及过夜后的加标样品， 加入 4 g 氯化钠和 100 mL 甲醇—水（ 8 + 2 ） ， 以均质 器高速搅拌提取 2 min， 通过折叠快速定性滤纸过 滤， 准确移取 10． 0 mL 滤液并加入 30． 0 mL 水稀释 混匀， 用玻璃纤维滤纸过滤 1 ～ 2 次， 至滤液澄清， 得
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标法定量， 计算样品中玉米赤霉烯酮的含量 。
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结果与分析
激发波长、 发射波长的选择 用荧光 实验过程中采用流动相作为背景溶液， 检测器对玉米赤霉烯酮标准液在 190 ～ 600 nm 进行 扫描（ 见图 1 ） 。 结果表明， 玉米赤霉烯酮最佳激发 波长为 305 nm， 最佳发射波长为 460 nm。
玉米加标样品的考察结果显示， 本方法的回收率为 83 ～ 112% （ 见表 4 ） 。
图1
玉米赤霉烯酮激发波长扫描谱图
图2
玉米赤霉烯酮发射波长扫描谱图
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流动相及流速 根据以上条件， 参考 GB / T 5009． 209 —2008 的 流动相， 以乙腈 + 水 + 甲醇， 按体积比 46 ∶ 46 ∶ 8 混 合， 流速不同时， 峰的保留体积基本相同， 表明该流 ZEN ， 1 。 动相对 来说很稳定 结果见表