生化仪方法及参数设置有关的知识

方法及参数有关的知识1、导向知识：生化分析仪的基本原理是分光光度计，或者俗称比色计。

分光光度计的依据是“朗伯—比尔定律”。

朗伯—比尔定律阐述了液体吸光度与液体浓度的关系，并且引申出相应的公式及推导公式。

吸光度越高，溶液的色度也就越深，反之越浅。

当然前提是同波长下。

一般来说，生化反应把吸光度增加的叫做正反应，或者叫做上升反应，色度越来越深；吸光度下降的反应叫做负反应或者下降反应，色度越来越浅。

应用和维修的界限其实很难划分，一般来说操作问题属于应用，故障属于维修。

但结果问题有可能是应用问题，也有可能是故障，所以生化仪区分应用和维修我认为纯属找麻烦。

2、生化的测试方法：从分光光度计的方法来说，有透射和散射两种方法，生化仪只用到透射法，因为它只有一套光路。

贝克曼的自有机型和特定蛋白仪及免疫类血凝类设备，还增加有散射法等等。

生化的测试方法只有两种，那就是终点法和速率法，其余方法都是衍生法。

而单试剂或者双试剂与否与方法关系不大，只跟衍生法有关。

2.1终点法顾名思义，在反应终点进行吸光度测定的方法，其衍生方法有一点终点法，对应单试剂；两点终点法对应双试剂。

还有一些相关的概念：试剂空白、血清空白。

先声明一下，下面出现的所有例图都是选自日立、奥林巴斯、东芝、拜耳这些生化仪的手册，选择的目的一是有代表性，而是清晰度好，并非我个人有所倾向。

2.2一点终点法：也就是单试剂采用的方法。

这是奥林巴斯的曲线示意图，它是R1+S方式，所有生化仪都是以样本S的加入为正式读点的开始，之前加入的试剂读点都为0或负数。

所有试剂和样本加入后，都进行搅拌。

上图中R1加入搅拌后进行第一个读点吸光度测试，读点编号为0，然后加入样本再次搅拌开始正式读点1-27。

而测试读点是27，也就是反应终点。

当然，不一定非要到最后一个读点，很多蛋白反应速度很快，几分钟就到达终点，所以根据情况设置。

奥林巴斯的机型算是一类机型，与贝克曼自有机型类似，R和S间隔读点，也正是这个特性引发了试剂空白和血清空白的应用。

而日立的机器代表着另一类机型，那就是S+R方式，但S和R在同一圈内加入，所以读点从1开始，没有0也没有负数。

如下图：从上图可以看出，第一点已经开始反应了，没有奥林巴斯机型那样有个平坦的水平线。

这个图例反应时间比较长，直到30以后才趋于平稳反应终结，所以读点算在了33-34点。

也就是最后两点。

上面两例都是一点终点法，日立的机型无话可说，它就没有平坦区域，那么奥林巴斯的呢？是否可以在平坦区域，也就是R加入后去一个读点，将空白扣除掉，这样结果不是更精确吗？话可以这么说，事情不能这么做，因为一点终点法都是以反应终结的吸光度为准的，不能出来第二个点，何况机型不同，有的你就出不来第一点。

那么在上面两张图里，大家都看到，反应的起点都不是Y轴的0点，可能大于0也可能小于0，单纯的终点吸光度减去起点吸光度仅能适用于一点终点法。

所以奥林巴斯机型把R加入后的平坦区域，叫做试剂空白，这没错，这段区域只有R参与，根本没有任何样本。

但它并不在测试时增加一个空白读点，而是在测试准备或定标准备前增加了一个试剂空白测试。

试剂空白检测完毕后，数据保存在数据库里，在更换试剂之前，试剂到期之前都采用这个数据作为空白值参与结果的计算。

试剂空白有一定的范围，超过这个设定范围会认为试剂失效或者污染，所以在奥林巴斯的机型里，试剂空白是一定要做的，而且间隔时间不能太长，否则会报错。

除了试剂空白外，还有血清空白，因为血清的底色甚至高于试剂底色。

所以在一点终点法中，为了得到精确的结果，也要进行血清空白的测试。

要注意的是，这个方法很少使用，因为要测定血清空白需要单独的通道。

也就是说一个样本要被测试两次，一次是常规的反应，加入R进行测试，另一次是单独采集样本，不加入试剂，而加入生理盐水或纯水稀释到前一次的稀释比例，单独测试样本血清的吸光度。

然后将终点反应的吸光度减去血清空白，得到的结果才是反应结果。

如下图：2.3两点终点法，也就是双试剂常用的终点法。

在奥林巴斯机型中，双试剂会出现两个或三个平坦的区域，R1加入之后，和S加入之后，如果是终点法，会在反应终点还会出现一个。

如下图：那么两点终点法除了在27点读一个之外，还要在10点读一个点，也就是在R2加入之前读一个点。

这样反应吸光度值就等于终点吸光度值减去试剂样本空白，注意是试剂样本空白，不是试剂空白，所以这个点只能在S之后，R2之前。

惯例一般在R2之前的一个点，而不是R2之前S之后的任意点。

下面是日立的图例：由于是S+R1，所以曲线开始就进行反应，除去杂质消除干扰，直到R2加入前趋于稳定。

16点之后加入R2，正式反应启动，直到27点趋于稳定，所以终点读点选在33-34上。

而试剂样本空白选择在15-16上。

从日立的图上我们可以看出，如果选择一点终点法，那么反应的吸光度值应该是137-（-562）=699，而去除试剂样本空白的两点终点法的反应吸光度值呢？应该是137-（-477）=614，可以看出后者更为精确。

说明：如果是正反应，吸光度值等于终点值-试剂样本空白值；如果是负反应，吸光度值等于终点值-（-试剂样本空白值）。

这就是为什么要告诉反应方向的原因，否则算出来是负的结果没法报了。

总结：一点终点法适用于单试剂，两点终点法适用于双试剂，但第一点要在R2之前的一点。

2.4速率法：使用最小平方法计算两点间的吸光度变化，确定每分钟吸光度的变化率，也就是ΔOD/min。

常规的速率法是在R2加入之后，给出两个读点，系统根据两点间的时间，自动计算每分钟的吸光度变化。

下图是奥林巴斯的图例：下图是日立的图例：可以看出上图读点范围是22-28点。

采用常规速率法有个前提，那就是R1加入之后前期反应趋于稳定，比较平坦，加入R2之后迅速启动反应，形成斜线，读点范围取在斜线上。

如果R1加入之后也是斜线，那就要使用双速率法，也就是在试剂样本空白的斜线上取一段进行空白速率计算。

双速率法很少使用，与常规速率法的结果比较差别也不是很大。

在日立机型中，常规速率法叫速率A法。

日立多了一个速率B法，那是双项目检测的，没有专用试剂无法实现。

图例中的速率法每点线性都很好，但遇到每点线性不好的，就会报错，结果被拒绝、屏蔽。

线性不好一方面是试剂质量问题，另一方面是反应特征，无法保持线性。

那么这种问题各个厂家也都有对应，日立叫做两点速率法，奥林巴斯叫做固定点法。

2.5 两点速率（固定点）法：确定特定两点间的吸光度差值，无线性甄别。

还有引申出来的双固定点法，对应双速率法：上面两图都是奥林巴斯的，下面是日立的两点速率法。

2.6 终点法和速率法的运用不能混淆，什么项目用什么方法一般不会有错，试剂厂家的说明书上都有明确介绍，一般不会搞错，但也有例外，下图就是一个例子，是小东版主的讲义节选的。

例1：故障现象是TBA结果总是出现负值，而且更换过试剂，定标都通过，仍然解决不了。

曲线如下：方法采用的是两点终点法（R2之前之后各一点），这是致命的错误。

根本找不到终点的曲线，怎么能使用终点法呢？再来看看负值是怎么来的，TBA是正反应，如果采用两点终点法应该是后点-前点。

左图后点高于前点，所以是正值；而右图后点低于前点，减出来肯定是负值。

但方法错误这个前提已经确定，后面再怎么分析也没有意义了，明显的速率法。

读点问题最常见，这也就是结果问题要曲线的原因所在。

例2：这是群里的一个问题：高低密项目定标和质控都没有问题，就是病人结果偏低。

这个无法直接回答，还是上曲线看看吧。

两张图传完就明白原因了，读点错误。

高低密采用两点终点法，而两点终点法的关键是R2之前一点，另一点在反应的终点。

而图上明显是两点都在R2之后，再分析为什么会结果偏低，以第一张图为例。

这个机器是R1+S方式，R1加入后吸光度在400上下，比较平稳，紧接着加入S，吸光度升到1000左右，加入R2之后，反应终点区域大致在1300左右。

如果是R2之前一点为1000，R2之后反应终点为1300，那么两点终点法的反应吸光度为1300-1000=300，据此计算浓度。

而图例中两点都选择在了R2之后，第一点的吸光度大致在1300左右，第二点也是1300左右，二者相减相差无几，搞不好还是负的，难怪结果低了。

有一点我很不理解，生化仪的软件设计人性化方面有问题。

既然选择了终点法，你就不该让操作人员设置读点的时候把第一点设为R2之后，干脆报错提示多好呢？2.7 速率法的底物耗尽问题。

所谓底物耗尽，就是样本浓度太高，试剂提供的反应物质迅速反应完，而样本中的检测物质还有很多没有参与反应。

通俗的话讲，就是在速率法的反应中看到了终点法的曲线。

下面是图例，也是小东版主的讲义：图例中看到的是典型的日立速率A法，见到这样的图，结果肯定偏低甚至为0或者负值。

这样的图首先应该想到方法是不是错误，如果速率法没错，那就只有一个可能，底物耗尽。

几乎所有的机型都提供危急值报警和自动重测，遇到这种情况，一般都采取自动或人工稀释重测的方法解决。

而东芝及其OEM机型雅培的生化仪，还有日电及拜耳的机型，可以自动进行判别，并将读点前移。

东芝叫做弹性速率法，日电叫做读点前移。

概念是这样的：以上右图为例，速率法选择的主读点区为22-28，并加以吸光度判别和线性判别，当出现底物耗尽时，这个主读点区的线性几乎停滞，吸光度变化降低到几乎为0，这种情况下启动弹性速率读点区，一般设置在R2加入后10点以内，比如选择在17-21这个区间里。

在弹性速率区间里进行速率法计算，从而得出一个较高的浓度值，因为这一区间反应速度很快。

这种方法以前有很多医院的老师作过实验并发表过论文，与手工稀释的结果比对，符合率高达96%。

这样一来，省工省力，节省了医院最为看重的成本。

下图是官方的弹性速率解释和读点前移介绍：总结：速率法的读点都在R2之后，两点速率法或固定点法不检查线性，底物耗尽要看曲线。

3、生化的定标方法：定标方法分为线性定标和非线性定标，也就是俗话说的直线定标和曲线定标。

生化中大部分项目都是用线性定标，而非线性定标大多用在免疫比浊项目上。

3.1 线性定标。

我们都知道，两点决定一线，所以要定标最少要有2个定标点。

定标的概念是在直角坐标系中，以浓度为X轴，吸光度值为Y轴，通过校准点的XY轴对应关系，将直线确定下来，标本测试中所有的吸光度值都能在这条直线上找到对应的浓度值。

如下图所示：图中给出的STD1、2两点是定标液，无论它们的吸光度值是多少，都会有一个确定的浓度值赋于它们，那么在直角坐标系中，这条定标曲线就被确定下来，无论样本的吸光度值是多少，都能在这条线上找到对应的浓度值。

同时我们还能看出，这条直线是这个第一象限的角平分线，也就是45度的倾角。

这种定标的结果保证了很宽的线性范围，无论多高多低都会有良好的线性。