生化仪方法及参数设置有关的知识

方法及参数有关的知识

1、导向知识：生化分析仪的基本原理是分光光度计，或者俗称比色计。分光光度计的依据是“朗伯—比尔定律”。

朗伯—比尔定律阐述了液体吸光度与液体浓度的关系，并且引申出相应的公式及推导公式。吸光度越高，溶液的色度也就越深，反之越浅。当然前提是同波长下。

一般来说，生化反应把吸光度增加的叫做正反应，或者叫做上升反应，色度越来越深；吸光度下降的反应叫做负反应或者下降反应，色度越来越浅。

应用和维修的界限其实很难划分，一般来说操作问题属于应用，故障属于维修。但结果问题有可能是应用问题，也有可能是故障，所以生化仪区分应用和维修我认为纯属找麻烦。

2、生化的测试方法：从分光光度计的方法来说，有透射和散射两种方法，生化仪只用到透射法，因为它只有一套光路。贝克曼的自有机型和特定蛋白仪及免疫类血凝类设备，还增加有散射法等等。

生化的测试方法只有两种，那就是终点法和速率法，其余方法都是衍生法。

而单试剂或者双试剂与否与方法关系不大，只跟衍生法有关。

2.1终点法顾名思义，在反应终点进行吸光度测定的方法，其衍生方法有一点终点法，对应单试剂；两点终点法对应双试剂。还有一些相关的概念：试剂空白、血清空白。

先声明一下，下面出现的所有例图都是选自日立、奥林巴斯、东芝、拜耳这些生化仪的手册，选择的目的一是有代表性，而是清晰度好，并非我个人有所倾向。

2.2一点终点法：也就是单试剂采用的方法。

这是奥林巴斯的曲线示意图，它是R1+S方式，所有生化仪都是以样本S的加入为正式读点的开始，之前加入的试剂读点都为0或负数。所有试剂和样本加入后，都进行搅拌。

上图中R1加入搅拌后进行第一个读点吸光度测试，读点编号为0，然后加入样本再次搅拌开始正式读点1-27。而测试读点是27，也就是反应终点。当然，不一定非要到最后一个读点，很多蛋白反应速度很快，几分钟就到达终点，所以根据情况设置。

奥林巴斯的机型算是一类机型，与贝克曼自有机型类似，R和S间隔读点，也正是这个特性引发了试剂空白和血清空白的应用。

而日立的机器代表着另一类机型，那就是S+R方式，但S和R在同一圈内加入，所以读点从1开始，没有0也没有负数。如下图：

从上图可以看出，第一点已经开始反应了，没有奥林巴斯机型那样有个平坦的水平线。这个图例反应时间比较长，直到30以后才趋于平稳反应终结，所以读点算在了33-34点。也就是最后两点。

上面两例都是一点终点法，日立的机型无话可说，它就没有平坦区域，那么奥林巴斯的呢？是否可以在平坦区域，也就是R加入后去一个读点，将空白扣除掉，这样结果不是更精确吗？话可以这么说，事情不能这么做，因为一点终点法都是以反应终结的吸光度为准的，不能出来第二个点，何况机型不同，有的你就出不来第一点。

那么在上面两张图里，大家都看到，反应的起点都不是Y轴的0点，可能大于0也可能小于0，单纯的终点吸光度减去起点吸光度仅能适用于一点终点法。

所以奥林巴斯机型把R加入后的平坦区域，叫做试剂空白，这没错，这段区域只有R参与，根本没有任何样本。但它并不在测试时增加一个空白读点，而是在测试准备或定标准备前增加了一个试剂空白测试。试剂空白检测完毕后，数据保存在数据库里，在更换试剂之前，试剂到期之前都采用这个数据作为空白值参与结果的计算。

试剂空白有一定的范围，超过这个设定范围会认为试剂失效或者污染，所以在奥林巴斯的机型里，试剂空白是一定要做的，而且间隔时间不能太长，否则会报错。

除了试剂空白外，还有血清空白，因为血清的底色甚至高于试剂底色。所以在一点终点法中，为了得到精确的结果，也要进行血清空白的测试。要注意的是，这个方法很少使用，因为要

测定血清空白需要单独的通道。也就是说一个样本要被测试两次，一次是常规的反应，加入R进行测试，另一次是单独采集样本，不加入试剂，而加入生理盐水或纯水稀释到前一次的稀释比例，单独测试样本血清的吸光度。然后将终点反应的吸光度减去血清空白，得到的结果才是反应结果。如下图：

2.3两点终点法，也就是双试剂常用的终点法。

在奥林巴斯机型中，双试剂会出现两个或三个平坦的区域，R1加入之后，和S加入之后，如果是终点法，会在反应终点还会出现一个。如下图：

那么两点终点法除了在27点读一个之外，还要在10点读一个点，也就是在R2加入之前读一个点。这样反应吸光度值就等于终点吸光度值减去试剂样本空白，注意是试剂样本空白，不是试剂空白，所以这个点只能在S之后，R2之前。惯例一般在R2之前的一个点，而不是R2之前S之后的任意点。

下面是日立的图例：

由于是S+R1，所以曲线开始就进行反应，除去杂质消除干扰，直到R2加入前趋于稳定。16点之后加入R2，正式反应启动，直到27点趋于稳定，所以终点读点选在33-34上。而试剂样本空白选择在15-16上。

从日立的图上我们可以看出，如果选择一点终点法，那么反应的吸光度值应该是137-（-562）=699，而去除试剂样本空白的两点终点法的反应吸光度值呢？应该是137-（-477）=614，可以看出后者更为精确。

说明：如果是正反应，吸光度值等于终点值-试剂样本空白值；如果是负反应，吸光度值等于终点值-（-试剂样本空白值）。这就是为什么要告诉反应方向的原因，否则算出来是负的结果没法报了。

总结：一点终点法适用于单试剂，两点终点法适用于双试剂，但第一点要在R2之前的一点。

2.4速率法：使用最小平方法计算两点间的吸光度变化，确定每分钟吸光度的变化率，也就是ΔOD/min。

常规的速率法是在R2加入之后，给出两个读点，系统根据两点间的时间，自动计算每分钟的吸光度变化。下图是奥林巴斯的图例：

下图是日立的图例：

可以看出上图读点范围是22-28点。

采用常规速率法有个前提，那就是R1加入之后前期反应趋于稳定，比较平坦，加入R2之后迅速启动反应，形成斜线，读点范围取在斜线上。