鸡传染性法氏囊病卵黄抗体的制备和检验

鸡传染性法氏囊病卵黄抗体的制备和检验

【实训目标】

（1）学习和掌握卵黄抗体的制各方法。。

（2）学习和掌握卵黄抗体的检验方法。

【实训材料】

1、材料

（1）抗原与血清：鸡传染性法氏囊强毒油乳剂灭活苗；传染性法氏囊病毒阴、阳性血清。

（2）动物：4～8周龄SPF鸡或4～8周龄健康鸡、健康产蛋母鸡及其所产蛋；小鼠。

（3）主要器材；超净工作台、恒温箱、高压锅、离心机、微量加样器、平皿、酒精灯、烧杯、吸管、玻棒、三角瓶、纱布、记号笔、碘酒棉、酒精棉、镊子、1～5ml注射器和pH 试纸等。

2、试剂0.2%～0.5%新洁尔灭、5%碘酊、75%酒精、灭菌生理盐水、青霉索、链霉索、氯仿、琼脂糖；鲜血琼脂平板、马丁肉汤和厌氧肉肝培养基等。

【内容与方法】

（一）鸡传染性法氏囊病卵黄抗体的制备

1、高免鸡蛋的准备选择SPF或临诊健康产蛋鸡，每只皮下或肌肉注射鸡传染性法氏囊强毒油乳剂灭活苗1ml，一般免疫2～3次，每次间隔10～14d，待卵黄抗体的琼脂扩散实验（AGP）效价达1：128以上即可收蛋。收集所产蛋，置4℃冰箱保存（不宜超过1周）。

2、卵黄抗体的制备收集一定数量的高免蛋后，用0 2%～0.5%的新洁尔灭或高锰酸钾水溶液洗净蛋壳表面，再用5%碘酊消毒，最后用75%的酒精脱碘两次。在无菌条件下打开蛋壳，分离卵黄，将卵黄移至无菌量杯或有刻度的烧杯中，加入等量灭菌生理盐水混合。

粗制卵黄抗体：将生理盐水与卵黄的等量混合物，加青霉素、链霉索、硫柳汞，使其终浓度分别为1 000IU／ml、100ug／ml和0. 01%.充分搅拌。—20℃储存备用。

（二）卵黄抗体的检验

1、理化性状

粗制卵黄抗体：鲜黄色，冰冻溶解后有少量卵黄沉淀。

2、无菌检验取高免卵黄抗体0.2ml，分别接种于鲜血琼脂平板、马丁肉汤和厌氧肉肝培养基，37℃培养48h，均应无菌生长。

3、安全检驻用体重18-22g小鼠5只，每只皮下注射本品0.5ml；用14日龄SPF雏鸡5只，每只皮下注射本品10ml；观察l0d小鼠和雏鸡均应全部健活。

4、效力检验

AGP抗体效价测定：8%氯化钠溶液中加入1g琼脂粉，加热融化后，浇制凝胶板。中央l孔外围6孔打孔，孔径3mm，间距4mm。将卵黄抗体用生理盐水做倍比稀释，取1:8、1: 16、1: 32和1：64稀释度的卵黄抗体，分别加入周围4个孔；另外2个孔分别加入IBDV阳性和阴性血清作为对照；中间孔加1BDV AGP抗原，l5～20ul／孔。然后置37℃湿盒孵育24h，在室温放置24～48h。

结果判定；与标准抗原形成白色沉淀线的抗体最大稀释度即为卵黄抗体的效价。AGP 抗原效价应>1: 32。

【思考与练习】

1、卵黄抗体的质量受哪些因素的影响？应如何克服？

2、精制卵黄抗体与粗制卵黄抗体有何不同，制备过程中应注意什么问题？