考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
实验8考马斯亮蓝法测蛋白质的含量
对实验条件进行优化，如调整PH值、反应时间、温度等，以提高实验
结果的稳定性。
03
应用拓展
进一步研究考马斯亮蓝法在特殊蛋白质或不同来源蛋白质测定中的应用，
拓展其应用范围。同时，可以探索与其他蛋白质测定方法的比较研究，
为蛋白质定量分析提供更多选择。
THANKS
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标准曲线的绘制
加样
将标准蛋白溶液分 别加入相应的试管 中。
测定光密度值
在特定波长下测定 各试管的光密度值， 记录数据。
准备标准蛋白溶液
制备一系列不同浓 度的标准蛋白溶液。
显色反应
向每个试管中加入 适量的考马斯亮蓝 溶液，混合均匀。
绘制标准曲线
根据测得的光密度 值与标准蛋白浓度 绘制标准曲线。
加样
样品稀释
根据实验需求，将蛋白质 样品进行适当稀释，以便 后续测量。
样品标记
对每个样品进行标记，以 便后续结果分析时能够准 确对应。
考马斯亮蓝溶液的配制
准备试剂
储存与使用
按照实验要求准备考马斯亮蓝溶液所 需的试剂。
将配制好的考马斯亮蓝溶液储存于棕 色瓶中，避免光照，使用前摇匀。
配制溶液
将各试剂按比例混合，制备出考马斯 亮蓝溶液。
影响因素
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时，PH值、反应时间、温度等因素 可能影响实验结果。
适用范围
考马斯亮蓝法适用于大多数蛋白质的定量测定，但对于某些特殊蛋 白质或不同来源的蛋白质可能存在一定误差。
对实验的改进建议与展望
01
标准化操作
为提高实验准确性，建议对实验操作进行标准化，减少人为误差。
02
优化条件
考马斯亮蓝与蛋白质结合的机制
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重) =）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μSDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
图1 考马斯亮蓝标准法根据线性拟合公式y=a x+b计算所测溶液的蛋白质的含量。
（二）SDS干扰数据和图表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格根据表2，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。
蛋白质含量的测定考马斯亮蓝染色法
➢ 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合2min左右达到平衡，完成反应
十分迅速，其结合物在室温1h内保持稳定
➢ 考马斯亮蓝G-250染色法简单迅速，灵敏度高，一些阳离子如
K些+去、污Na剂+、如MTgri2t+o、nXN-H104+0以、及SD乙S等醇严等重物干质扰都测不定干，扰且测样定品，测但定一 后不能回收
度计的光源
➢ 单色器 把混合光波分解为单一波长光的装置 在分光光度计中多用棱镜或光栅作为色散元件 ✓ 棱镜：是根据光的折射原理而进行的分光系统，当一束平行光进入棱镜散
射器后就会按波长顺序分解成单一波长的单色光
✓ 光栅：是利用光的衍射和干涉原理进行的分光系统
转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长，调节出入射
狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度
纯粹的单色光只是一种理想情况，实际上只是具有一定波长范围的谱带，
对于单色光纯度来说，狭缝是越窄越好，但光的强度也就越弱
➢ 吸收池
亦称样品室、比色池或吸收池，由透明材料（有机玻璃、石英或蓝宝石等）
制成
在紫外光波区检测选用石英、蓝宝石比色杯；在可见光波区检测可选用有机
➢血清蛋白质含量的计算：利用标准曲线，根据血清蛋白测定的 吸光值求出相应的蛋白含量，注意稀释倍数
பைடு நூலகம்
六、实验思考
➢如何正确使用722型可见光分光光度计？ ➢考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理是什么？ ➢考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量有什么优缺点？
➢人眼可见的光只占电磁波谱的很小一部分（400~760nm）。它是一种频率较 大的电磁波。电磁波按频率大小，从频率最小的无线电波到频率最大的γ-射线 排成一列，即组成电磁波的波谱，如下图所示
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
仪器和试剂
1．仪器：
722型分光光度计；微量注射器；试管及试管架；刻度吸 管
2．试剂：
（1）标准蛋白质溶液：称取100mg 牛血清白蛋白，溶于蒸 馏水并定容至100ml，制成1mg/ml 的溶液。 （2）考马斯亮蓝G-250染液：称取100mg考马斯亮蓝G-250， 溶于50ml 95%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，最 后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液不宜久存，在常温中可 放置1-2个月。
3．若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈， 以免产生大量气泡而难于消除。
思考题
1． 说出你所知道的几种蛋白质定量测定的 方法，并与考马斯亮蓝染色法相比较各有 何优缺点？
2．根据下列所给的条件和要求，选择一种 或几种常用的方法测定蛋白质的浓度。 （1）样品不易溶解，但要求结果较准确； （2）要求在短时间内测定大量样品。 （3）要求很迅速地测定一系列试管（如30 支）中溶液的蛋白质浓度。
实验二
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
实验目的
掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的 原理和方法
学习分光光度计的原理及使用方法
实验原理
根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。 考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复 合方法。考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状 态下呈棕红色，当与蛋白质结合后呈青蓝色。在 一定范围内，也就是当蛋白质含量在0~1000μg范 围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与 蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。
双蒸水（ml） 考马斯亮蓝染液 蛋白质含量（μg）
0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 0 20 40 60 80 100
蛋白质含量的测定考马斯亮蓝染色法
1 2
洗涤
用洗涤液洗涤染色后的蛋白质样品，去除多余的 染料。
测量
使用分光光度计测量蛋白质样品的吸光度值。
3
结果计算
根据标准曲线和吸光度值计算蛋白质含量。
04
结果分析
数据记录与整理
数据记录
在实验过程中，应详细记录每个实验 组的吸光度值，包括空白对照组。
数据整理
将实验数据整理成表格，包括实验组 别、吸光度值以及相应的波长等。
VS
药物研发
在药物研发过程中，考马斯亮蓝染色法可 用于评估药物对蛋白质表达的影响，为新 药研发提供实验依据。
未来发展方向与挑战
技术优化
随着科学技术的不断发展，考马斯亮蓝染色法需要不断优化和完善， 以提高检测的灵敏度和特异性。
应用领域拓展
随着蛋白质组学研究的深入，考马斯亮蓝染色法的应用领域将进一 步拓展，为生命科学和医学研究提供更多支持。
蓝色与黄色
考马斯亮蓝染色后呈蓝色，与未结合蛋白质的黄色形成鲜明对比，便于观察和 检测。
颜色深浅与浓度正相关
随着蛋白质浓度的增加，染色后样品的颜色逐渐加深，通过比色法可测定出不 同浓度下的光密度值，进而计算出蛋白质浓度。
03
实验步骤
样品准备
样品收集
蛋白质提取
选择具有代表性的样品，确保样品新 鲜、无污染。
05
应用与展望
在生物学领域的应用
蛋白质表达分析
考马斯亮蓝染色法常用于检测细胞或组织中蛋白质的表达水平，有助于研究生物体的生 理和病理过程。
蛋白质分离与鉴定
通过考马斯亮蓝染色法对蛋白质进行染色，可以方便地对蛋白质进行分离和鉴定，为蛋 白质组学研究提供技术支持。
在医学领域的应用
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250m ax λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重)=）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μ以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
计算出回归方程。
如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度 SDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
实验1考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
蛋白质含量的测定
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法（Lowry法） 双缩脲法（Biuret法） 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford法）
▪ 实验类型——基础验证型
实验目的
掌握和学习考马斯亮蓝G-250染色法 测定蛋白质含量的基本方法。
五 思考题
测定蛋白质含量还有哪些方法， 测定原理有哪些不同？
移液枪的使用方法
量程的调节 枪头（吸液嘴）的装配 移液的方法 移液器的正确放置 维护保养时的注意事项
吊钩 手柄
移液控制及调节旋纽 吸/枪头推出器
数字显示器
枪杆
移液枪的结构
1.量程的调节 ！！看清量程再调节
千万不要将按钮旋出量程， 否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出 残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的 吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中， 以免污染吸量管及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应 及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上 冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。
/mL
0
10
蛋白质浓度
(μg/mL)
A595
3
4
5
6
7
0.2
0.4
0.6
0.8 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
4.0
4.0
4.0
4.0 4.0
20
40
60
实验三-考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
思考题
（1）试比较该法与其他几种常用蛋白质定量测定 方法的有缺点。
水产示范中心
实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
一.目的:掌握考马斯亮蓝G－250染色法测定蛋 理和操作.
二.原理 三.仪器与用具 四.实验试剂 五.实验操作 六 实验报告
白质的原
水产示范中心
二.原理:
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含 量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色， 最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色 素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量 成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
水产示范中心
五.实验操作
1
(蛋白质含量为0～100μg／ mL)的绘制
牛血清蛋白溶液:浓度为100 μ g／ mL,按照表格配制
混合数次，放置5Min后，用1CM光径比色杯在595nM下比色。以蛋
白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
水产示范中心
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定
吸取样品提取液1.0 ml( why?) ，放入 试管中 ，加入
水产示范中心
三.仪器与用具
721分光光度计；10 mL量筒1个；研钵；烧杯；量 瓶；移液管：1 mL 3支，0 1 mL 3支；10 mL具塞 刻度试管14支。
水产示范中心
四.实验试剂
标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质 50溶液：称取100μg考马斯亮蓝G250，溶于50 mL 90％乙醇中，加入85％的磷酸 100 mL ，最后用蒸馏水定容到1000 mL ，贮放在 棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% HPO，34 雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）HPO。
342、标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、标准曲线制作：1、0 1 2 3 4 5 6 试管编号0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 100ug/ml标准蛋白（ml）1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.15mol/L NaCl （ml）5 5 5 5 5 5 5 考马斯亮蓝试剂（ml）摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色A595nm2、以A为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、595nm40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
=a×X( )+6 3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
实验一 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量【实验目的】1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。
2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。
【实验原理】1976年Bradford 等建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。
染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465 nm 变为595 nm ，光吸收增加。
蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1 g 蛋白。
染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
N CH 2CH 3CH 2N +CH 3CH 2CH 2NHCH 3CH 3O CH 2CH 3SO 3-SO 3Na蛋白质+ 蛋白质-染料复合物H +考马斯亮蓝G-250（蓝色，λmax595nm ）【仪器与试剂】1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。
2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。
【实验步骤】1．标准蛋白质溶液的配制称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成1 mg/ml 的溶液。
2．蛋白试剂的配制称取100 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。
试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。
3．标准曲线的制作取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 μl于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。
以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。
4．样品测定取含10~100 μg蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml 蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝测定蛋白质含量一、实验原理考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈棕红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。
在3～5分钟即成大量吸收，至少稳定1小时。
在10～1000μg/mL范围内，吸光值与蛋白质浓度成正比。
是目前常用方法之一。
二、实验材料、器材与试剂1.材料结晶牛血清白蛋白。
2.器材（1）723分光光度计；（2）试管及试管架；（3）各型号吸量管；（4）坐标纸；（5）记号笔。
3.试剂（1）考马斯亮兰G-250染色液：取考马斯亮兰G-250 100mg溶于50mL95%乙醇中，加100mL85%磷酸，加水稀释至1升。
（2）标准蛋白溶液：用牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定蛋法测定蛋白质含量，根据其纯度，配制成1000μg/mL的蛋白质标准溶液。
标准原液的配制：在分析天平上精确称取0.1g结晶牛血清白蛋白,于小烧杯内，加入少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度。
配制成标准原液，其中牛血清白蛋白浓度为1000μg/mL。
(3)样品液：准确称取小麦叶片（或绿豆芽下胚轴）约200mg,放入研钵中，加入蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移到离心管中，于4000r/min离心10min,将上清液倒入10mL容量瓶中，再向残渣中加入2.0mL蒸馏水悬浮后以4000r/min再离心10min,合并上清液，定容至刻度。
三、实验方法1. 分别取8支试管，编号，按下表加入试剂，混匀，室温放置5～30分钟。
标准蛋白溶液（1000μg/mL）未知样品1未知样品2管号 1 2 3 4 5 6 7 8 样品/mL0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 1.0 水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0 蛋白质含量/μg0 200 400 600 800 1000 待测待测染色液(mL)5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.02.绘制标准曲线：用723分光光度计在595nm处比色。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含(_Bradford_法)
反应化合物在595nm处有最大光吸收，化合物颜色 的深浅在一定范围内与蛋白质浓度成正比，，因
此可通过测定595nm处的光吸收值来计算蛋白的含
量。
考马斯亮蓝染色法的优点：
（1）灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），测 其最低蛋白质测量可达1mg。 (2)测定快速,简洁。只需加入一种试剂， 完成一个样品的测定，只需5min左右。 (3)此方法干扰物少 如干扰Lowry法的K+、 Na+、Mg+例子，Tris缓冲液、蔗糖、甘油、
思考题
1.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理 是什么？ 2.为什么不能用试管刷来清洗比色皿？ 3.能否将卫生纸塞入比色皿中吸干余液？ 4.为什么最后要用95%的乙醇来润洗比 色皿？
尽管相对于其他方法来说尽管相对于其他方法来说??尽管相对于其他方法来说此法的干扰物较少尽管相对于其他方法来说此法的干扰物较少此法的干扰物较少此法的干扰物较少但但由于每种蛋白质与该染料的结合能力不同由于每种蛋白质与该染料的结合能力不同故故标准品的选择非常重要选择标准品的选择非常重要选择尽可能与待测蛋白尽可能与待测蛋白一致的样品一致的样品做标准能最大限度的提高该方法的做标准能最大限度的提高该方法的准确性
七.补充
蛋白质含量测定方法比较
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最
常用、最基本的分析方法之一。目前常用 的有四种古老的经典方法，即定氮法，双 缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法 （Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种 近十年才普遍使用起来的新的测定法，即 考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中 Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外 吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100 倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确， 往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法 的标准蛋白质。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验概要bradford法是最常用的蛋白质快速定量方法。
coomassie brilliant blue g-250与蛋白质结合使染料的最大吸收峰由465 nm变为595 nm，溶液的颜色由棕色变为蓝色，595nm波长下吸光度值与蛋白含量成正比。
灵敏度比lowry法高4倍，与bca法相当。
反应迅速，2分钟即可达到平衡并在1小时内保持稳定。
操作简便，只需要一种反应试剂。
实验原理考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
主要试剂考马斯亮蓝g-250染色工作液： 10mg考马斯亮蓝g-250粉末溶于5ml 95%乙醇中，彻底溶解后，加入10ml 85%磷酸中，边加边搅拌（市售液体磷酸（h3po4）的质量分数≥85.0%，稠状透明液体，可直接使用，对皮肤有很强的腐蚀作用，建议使用5ml移液枪缓慢吸取使用）蒸馏水稀释至100ml。
后经滤纸过滤后储存于棕色试剂瓶中，避光保存。
长时间不用，可放置于4℃冰箱中保存1年，再次使用还需过滤，加入反应管前需要升至室温，否则虽不影响精度，但测得的od值较低，对仪器要求较高。
标准牛血清白蛋白（bsa）：精确称取4mg bsa粉末，溶于1ml 0.15mol/l nacl溶液配制成4mg/ml标准蛋白溶液，-20℃保存。
（如用1cm比色皿测定，建议精确称取40mg bsa 粉末，溶于10ml 0.15mol/l nacl溶液配制成4mg/ml标准蛋白溶液，分装成小管，-20℃保存。
考马斯亮蓝染色法测定牛奶中蛋白质含量
实验六考马斯亮蓝染色法测定牛奶中蛋白质含量一、目的要求学习考马斯亮蓝染色法测定牛奶中蛋白质含量的方法和原理，标准曲线的绘制和回归方程的使用，分光光度计的使用。
二、基本原理考马斯亮蓝所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水微区具有亲和力。
通过疏水作用与蛋白质相结合，形成的蓝色蛋白质染料复合物，在595 am处有最大吸光度，在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质染料复合物在595 nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的测定。
分光光度法的原理：通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。
三、器材和试剂1．器材可见分光光度计，玻璃比色皿，试管2．试剂考马斯亮蓝G一250溶液：精确称取考马斯亮蓝G一250 100 mg，溶于50 mL 95％的乙醇，再加入100 mL 85％的磷酸，稀释定容至1 000 mL备用。
标准蛋白质溶液：精确称取牛血清白蛋白10 mg，加水溶解并定容至10 ml，冰冻，用时吸取上述溶液1 ml，用蒸馏水稀释至10 ml，即为100 μg/ml的标准蛋白质溶液。
样品的制作：准确吸取2 ml牛奶(市场上现买)加水至1000 ml制作样品。
四、操作1．工作曲线的确定在试管中分别精确移取牛血清白蛋白标准溶液0、0.1、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0 mL，加蒸馏水至1．0 mL，然后在各支试管中分别加入4．0 mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，室温下反应5 min，在595 nm波长处测定吸光度，以牛血清白蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品的测定分别准确移取一定量的乳与乳制品样品于试管中，用蒸馏水定容至1．0 mL加入4．0 mL考马斯亮蓝G一250溶液，摇匀，在室温下反应5 min，以空白(不加乳制品)溶液作参比溶液，分光光度计595 nm波长处测定样品组的吸光度。
注意：比色应在1h内完成。
五、计算：根据牛血清白蛋白标准溶液标准曲线得出回归方程(可用EXCEL工具作图给出公式)，以样品吸光度为X代入方程求得Y蛋白浓度。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
实验一 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量【实验目的】1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。
2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。
【实验原理】1976年Bradford 等建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。
染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465 nm 变为595 nm ，光吸收增加。
蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1 g 蛋白。
染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
N CH 2CH 3CH 2N +CH 3CH 2CH 2NHCH 3CH 3O CH 2CH 3SO 3-SO 3Na蛋白质+ 蛋白质-染料复合物H +考马斯亮蓝G-250（蓝色，λmax595nm ）【仪器与试剂】1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。
2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。
【实验步骤】1．标准蛋白质溶液的配制称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成1 mg/ml 的溶液。
2．蛋白试剂的配制称取100 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。
试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。
3．标准曲线的制作取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 μl于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。
以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。
4．样品测定取含10~100 μg蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml 蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝)
Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
O CH 2CH 3
Coomassie G-250
NH
PROTEIN
+
CH 3 C + CH3CH 2 N CH 2 SO3CH 3 N CH 2CH 3 CH 2
Hale Waihona Puke SO3NaAcid
BLUE
Protein - Dye Complex
Amax = 595nm
2、样品的测定
取一EP管 加入样品液1.0ml＋4.0ml考马斯亮蓝液 取一EP管，加入样品液1.0ml＋4.0ml考马斯亮蓝液4.0ml，同上操 考马斯亮蓝液4.0ml， 作，测A595
五、 结果及分析
1、以标准管的浓度为横坐标，A595为纵坐 、以标准管的浓度为横坐标， 标做标准曲线图 2、根据标准曲线，求出样品的浓度。 、根据标准曲线，求出样品的浓度。
标准蛋白溶液(mL) 标准蛋白溶液(mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.9％ 0.9％ NaCl(mL) 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 标准蛋白含量( 10 20 30 40 标准蛋白含量(µg) 0 考马斯亮蓝试剂(mL) 4.0 mL 考马斯亮蓝试剂(mL) 颠倒摇匀，静置5min， 号试管为空白对照， 595nm处比色 颠倒摇匀，静置5min，以 1 号试管为空白对照，在595nm处比色 A595（OD595） 0
六、 注意事项
1、EP管、试剂要求干净，不含有去污剂。 EP管 试剂要求干净，不含有去污剂。 2 、 蓝色物质不易洗去 ， 测定完后用乙醇将蓝 蓝色物质不易洗去， 色的比色杯洗干净。 色的比色杯洗干净。
七、 思考题
1、与其它测定蛋白质浓度的方法相比，考马 与其它测定蛋白质浓度的方法相比， 斯亮蓝染色法测定有何优点？ 斯亮蓝染色法测定有何优点？ 2、制作标准曲线及测定样品时，为什么要将 制作标准曲线及测定样品时， 各管中溶液颠倒混合 ？
考马斯亮蓝 法测定蛋白质含量
二、Bradford法(一）、原理：考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。
这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。
该方法快速、准确、干扰因素少。
CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。
但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。
（二）器材及试剂1、器材A. 分光光度计B. 微量加样器C. 移液管、试管及试管架D. 坐标纸2. 试剂（1）考马斯亮蓝G-250溶液：称取CBB- G-250 100毫克溶于50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升85%（V/V）磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。
（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）（3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。
(4) 血清样品(已稀释200倍)(5) 层析样品(三）、操作（标准曲线制作）：取7支试管按下表操作：混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D 值为纵坐标绘制标准曲线．以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度取试管从层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。
教学内容：实验八考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量【实验目的】1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法【实验原理】此方法是1976年Bradform建立。
考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
（优选）考马斯亮蓝法法测定 蛋白质含量
【实验原理】
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于 染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕 红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白 质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色， 其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数 更大。
考马斯亮蓝G-250在游离状态 下呈红色，最大光吸收在 465nm；当它与蛋白质结合 后变为青色，蛋白质-色素结 合物在595nm波长下有最大 光吸收。其光吸收值与蛋白质 含量成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G250的 结合十分迅速，约2min即可 反应完全，其复合物在1h内 保持稳定。
考马斯亮蓝R250与蛋白 质反应虽然比较缓慢， 但是可以被洗脱下去， 所以可以用来对电泳条 带染色。
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）,
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；
蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 考马斯亮蓝试剂（mL）
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液(I)
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1µg）。 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。 （优选）考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大。 可见光范围内波长和颜色的关系
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考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
一、实验目的
掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和方法。
学习分光光度计的原理及使用方法。
二、实验原理
三、实验步骤
试剂
试管编号
0 1 2 3 4 5 6 7
标准蛋
白质溶
液/ml 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 样品0.1 样品0.1
相当于
蛋白质
含量/微
克0.00 20 40 60 80 100 未知未知
蒸馏水
/ml 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 0 考马斯
亮蓝染
液/ml 3 3 3 3 3 3 3 3
1、打开分光光度计，预热30min。
2、取8支洁净的干燥试管，按上表进行编号，0~5号用于标准曲线的绘制，6号、7号用于
样品溶液的测定。
3、取微量注射器，用蒸馏水清洗3次，再用标准蛋白质溶液润洗2次。
按上表在0~5号试
管中加入标准蛋白质溶液，然后用蒸馏水洗3次，再按上表在0~5号试管中加入相应含量的蒸馏水。
4、微量注射器用样品润洗2次，抽取100微克的样品加入到6号试管，再抽取100微克加
到7号试管。
用蒸馏水清洗微量注射器。
5、取5ml的移液管，用蒸馏水清洗3次，用考马斯亮蓝染液润洗2次。
在0~7号试管中各
加入3.0ml的考马斯亮蓝染液。
振荡试管，混合均匀。
6、待其充分反应（约2分钟）后，用分光光度计分别测它的吸光值。
7、用0~5号的数据。
以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
8、由样品液的吸光值查标准曲线求出蛋白质含量。
四、实验结果与分析
试管编号0 1 2 3 4 5 6 7
A595 0 0.383 0.603 0.871 1.093 1.189 0.876 0.83
6
样品溶液吸光值=（0.876+0.836）/2=0.856
查标准曲线得样品液的蛋白质含量为66.0微克
分析：
考马斯亮蓝G-250能与蛋白质结合，染液与蛋白质结合后引起染料最大吸收峰的改变，从464nm变为595nm，光吸收值增加。
同时蛋白质——染料复合物具有高的消光系数，大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1微克蛋白质。
染料与蛋白质结合迅速约2min，结合物的颜色在1h内保持稳定。
一些阳离子如K+,Na+,Mg2+以及（NH4）2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如T-ritonX-100,SDS等则严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。
优点：染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高。
缺点：每次测量都得重新绘制标准曲线。
注意事项：
1、每次测量吸收值都应用0号试管中的溶液去校准，以免后面的结果偏差过大。
2、0号试管起空白对照的作用，消除一定的系统误差。
3、6、7号实验的关键，它们之间的吸收值应非常接近，误差保持在10%的范围内。
如果误差超过这个范围，则实验宣告失败。