实验三双水相萃取糖化酶1-(1918)

生物工程专业实验之三双水相萃取糖化酶

实验目的

1.通过实验使学生了解双水相萃取在生物活性物质提取中的重要作用；

2.加深对分配系数 K 、相比 R、收率 Y 等基本概念的认识及相图的制作；

3.掌握液液萃取中基本实验技术；

实验原理

双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间

或聚合物与盐之间的不相溶性，使得聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不相溶

的两相，因使用的溶剂是水，因此称为双水相。原则上，无论是天然的还是合成的亲水聚

合物，绝大多数在与另一种聚合物水溶液混合时，都可分成两相，构成双水相体系，几种典

型的双水相系统见表一。通过溶质在相间分配系数的差异而进行萃取的方法称为双水相萃

取。

表一几种典型的双水相系统

聚丙二醇聚乙二醇，聚乙烯醇，葡聚糖（Dex ），羟丙基葡聚糖

聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖（Dex），聚乙烯吡咯烷酮

硫酸葡聚糖钠盐聚丙烯乙二醇

羧甲基葡聚糖钠盐甲基纤维素

羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基纤维素钠盐

聚乙二醇磷酸钾，硫酸铵，硫酸钠，硫酸镁，酒石酸钾钠

双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法。双水相系统通常是由水溶性的两种聚合物组成或一种水溶性聚合物与一种盐组成，其中水占有较大的比例

（70-95% ），相对于传统溶剂萃取来说，双水相萃取的最大优势在于双水相体系可为生物活

性物质提供一个温和的活性环境，因而可在萃取过程中保持生物物质的活性和构象，而且双水相技术具有处理量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点；在蛋白质、酶、核酸等

生物大分子的分离纯化等方面受到广泛重视，是一种有发展潜力的易于工业化应用的生物分

离技术。

生物大分子在双水相上相和下相的浓度比被定义为分配系数（ K=C t/C b）。在双水相系统中有许多因素影响分配系数，包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓

度、盐和离子强度、pH 等，以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、分子量等，利用双水

优分配的。在生化分离中得到广泛应用的双水相体系有：聚乙二醇(PEG)/ 葡聚糖 (Dex) 体系，PEG/盐等体系。

分离某一生物大分子，两相系统的选择原则，必须有利于目的产物的萃取和分离，同时

又要兼顾到聚合物的物理性质。如甲基纤维素和聚乙烯醇，引起年度太高而限制了它们的应用。 PEG 和 Dex 因其无毒性和良好的可调性而得到广泛的应用。

糖化酶亦称淀粉α-1,4 葡萄糖苷酶。这类酶作用于淀粉分子末端，从淀粉非还原性末端

顺次切开α-1,4糖苷键，生成葡萄糖。它们也能作用于支链淀粉的α-1,6键，但速度较慢，因此分解产物全部为葡萄糖，作用结果使糖的还原能力迅速增高。糖化酶在食品、酿造工业上有着广泛用途，是酶制剂工业上一个重要品种。国内生产糖化酶的菌种主要是黑曲霉和根

霉。

本实验选用PEG400-(NH 4)2SO4为双水相系统，从发酵液中萃取糖化酶。

表观分配系数：相比 :

V t R

V b

上相酶总量V t C t RK

收率:Y

V b C b 1 RK

上、下相酶总量 V t C t

式中 :C b、 C t分别为下、上相酶浓度（活性）；

V b、 V t分别为下相、上相的体积。

分配系数 K 与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。物料衡算：加入的原液总酶活 =上相酶活×上相体积 +下相酶活×下相体积

实验仪器与药品

仪器：天平、恒温水浴、K C t

离心机、液相混合器；刻度试管、吸管、酸式滴定管等；

C b

药品：发酵液、 PEG400、(NH 4)2 SO4、 NaOH(C.P) 、 2%可溶淀粉、 0.15 M NaOH 、1 M H 2SO4；

实验步骤

1. PEG400-(NH42 4 双水相系统相图的制作

)S O

水性两相的形成条件和定量关系常用相图表示，由上、下相中PEG 和 (NH 4)2SO4的浓度可在 PEG-(NH 4)2 SO4浓度图中得到点，顺次连接这些点得到一曲线，称为双节线。双节线下方为一相区，上方为两相区。

1.1配制 40％的硫酸铵溶液（已经配好）。在具塞三角瓶中准确称量约7 g 左右，实验中量取 7.19g 的 PEG400；

1.2按实验记录部分的表依次进行，先加入 5 ml 水（此时体系澄清）。然后用滴定管慢慢加入40％ (NH 4 )2SO4溶液，不断摇匀，直至试管开始出现混浊为止，记录加入的 (NH 4)2 SO4的体积和质量；

1.3按实验记录部分的表依次进行，加入适量水（水的加量），使体系变澄清，并继续加

入 40％ (NH 4)2SO4，使系统再次变混浊，记录加入的体积和质量；

1.4 如此反复操作，计算达到混浊时PEG 和(NH 4)2SO4在系统中的重量百分浓度，得出

PEG 和 (NH 4) 2SO4的双节线图。

2.双水相系统中蛋白质分配系数的测定

2.1 按实验记录部分的表中所示的顺序，干燥的50ml的离心管适量PEG400，再加入适量 40% (NH 4 )2SO4溶液，加入适量水补足到30ml，在混合器上混匀，再加入1ml酶液，于混合器上混合 2 min 。然后离心 5 min （混匀过程一律手动进行上下混匀）。

2.2 取出读取上、下相体积及总体积，按表二中所示的稀释倍数取样稀释后，分别测其

酶活。酶原液稀释20 倍测定。

2.3 糖化酶活力测定方法

2.3.1 糖化：在干燥试管中，加入2% 可溶淀粉溶液 5 ml ，再加入pH 4.5 的醋酸 -醋酸钠缓冲液 1.25 ml ，加入0.5 ml稀释酶液，迅速摇匀计时（空白实验用0.5 ml蒸馏水代替酶液）在 50°C恒温水浴中准确保温60 min ，加入四滴1M NaOH。

2.3.2 定糖：吸出 1 ml糖化液，稀释一定倍数用SBA测定（显示值在0～ 100 之间为正常，如果超过100 请根据显示数值稀释相应倍数再次测定）

注意事项

1.FEG400 比较粘稠，在取用时尽量慢一点，保证所取体积；

2.实验开始前要准确称量空瓶的重量，实验过程中每步加水和加硫酸铵溶液步骤必须称

量总体系的重量；

3.在滴定的过程中轻轻的振荡三角瓶，尽量减慢硫酸铵滴定的速率，并时刻观察瓶中液

体的变化，注意滴定终点；

4.这个实验是两个小实验，实验步骤比较多，做实验前要按照一定的顺序进行，按实验

步骤做好组内分配工作，对所做实验做好标记，特别是在稀释过程中要在试管上贴好标签，

同时准确记录记录实验数据；

5.实验完毕，做好清洁工作。

实验结果

以下是两个实验的数据记录表：

1.两相图实验数据：

所取的 PEG 质量为 7.19g；其中瓶质量为78.29g：

表二两相图数据记录表

次数水体积水的质40% 硫酸铵溶硫酸铵总溶液PEG 含硫酸铵（ ml ）量（ g）液（非溶体系累量%含量 %

液）累积计量（ g）（ g/g）（ g/g）

g ml

量（ g）

15 5.03 1.42 1.150.56813.6452.71 4.16

23 3.02 2.61 2.10 1.61219.2737.318.37