实验三双水相萃取糖化酶1-(1918)
摸索双水相萃取酵母蔗糖酶的条件实验报告
生物制药工艺学实验报告——摸索双水相萃取酵母蔗糖酶的条件一、实验目的了解双水相萃取的原理；掌握蔗糖酶比活力测定的原理和方法。
二、实验材料试剂：0.1 mol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.4），1 mol/L NaOH溶液，5% 蔗糖溶液，DNS 溶液，1 mg/mL葡萄糖标准溶液；固体试剂：PEG1500,PEG6000,硫酸铵仪器：低速离心机，可见分光光度计，水浴锅。
三、实验原理双水相萃取：某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相系统。
相图：两水相的形成条件和定量关系，常用相图来表示，它是一条双结点线。
影响分配系数的主要因素：①聚合物的相对分子质量在聚合物浓度不变的前提下，当聚合物相对分子质量降低时，其疏水性下降，亲水性蛋白质易分配于富含该聚合物的相中。
②聚合物的浓度当双水相系统的总浓度增大时，两相性质的差别增大，蛋白质趋向一侧分配。
③盐类的影响盐的浓度影响蛋白质疏水性。
蔗糖酶活力测定的原理蔗糖酶可作用于β－1，2糖苷键，将蔗糖水解为D－葡萄糖和D－果糖。
葡萄糖和果糖具有还原性，在偏碱性条件下，可与3，5－二硝基水杨酸共热后生成棕红色物质，在一定浓度范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度成正比关系；蔗糖酶的活力通过其水解产生的还原糖量来反映。
四、实验步骤1、研磨法破碎酵母细胞称6g 活性干酵母粉于研钵中，用捣杵研磨，破碎酵母细胞（至粉末状），再加入30mL0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.4），继续研磨（成匀浆状）。
吸取4mL 酵母细胞匀浆液分配于2 个dorf管中，5000rpm离心20min，留取上清液（标记为“粗酶液”）。
将剩余匀浆液平均分为2份，每份约12mL。
单因素实验考察PEG浓度对蔗糖酶分配的影响条件：硫酸铵浓度为15%，PEG6000PEG6000浓度为：16%，20%2.双水相萃取蔗糖酶（双水相体系重量为40g）先称量干净烧杯的重量，去皮，再将一份酵母细胞匀浆液倒入烧杯中，称量匀浆液的重量；在烧杯中，再加入相应质量的PEG和硫酸铵，补充蒸馏水至40g；搅拌使PEG和硫酸铵溶解，并充分搅拌5min，5000rpm离心20min，加速两相分开；在离心管上标明“萃取组（上）”和“萃取组（下）”。
浅谈双水相在糖化酶提取中的应用 - 终改
双水相萃取技术在糖化酶纯化工业中的应用糖化酶作为发酵行业中将淀粉转化为葡萄糖的重要物质，在酒类、果葡糖浆、有机酸、味精等生产工业中有着不可替代的地位。
是最重要的也是我国产量最大的工业酶制剂产品之一[1]。
仅在石家庄就有东泉生物制品有限公司、兴达酶制剂有限公司、胜利酶制剂厂等多家糖化酶的生产厂家，但他们在糖化酶的提取纯化中普遍采用硫酸铵盐析法，其只能得到含菌体、盐类、杂蛋白及其他固形物的粗酶液。
而且粗品中残余大量硫酸铵，不能满足食品级酶的质量要求。
双水相萃取体系的显著优点是传质和分相速度快,原料成本低,所使用有机溶剂无毒或低毒、粘度低、易回收处理、操作简便,同时该体系温和的环境也不会引起生物物质的损伤和破坏。
将其用于生物物质的分离和纯化的研究,国内外刚刚起步,但对酶制剂已表现出良好的分离性能。
世界上主要的糖化酶生产厂大约有31家,多分布于英日等国,其中丹麦的NOVO公司被认为是世界最大的糖化酶酶制剂公司。
他们采用的是添加无机絮凝剂，如硫酸铝、碱式氯化铝、氯化铁、锌盐等能在水中形成各种氢氧化物凝胶体，以实现双水相分离的方法（也可添加有机高分子絮凝剂，如聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酞胺等）。
糖化酶的双水相萃取过程分为三部分:(1)萃取和平衡, (2)上下相的分离(3)多聚物的分离。
萃取一般在混和沉降罐中进行。
混和沉降罐装有溢流装置, 溢流装置由两相密度差决定,由于体系的表面张力很低, 所以分配能在几分钟达到平衡, 而且界面张力很小, 则界面能低, 搅拌时只需要较小的剪切力就能得到很高的悬浮液, 能耗小。
在萃取达到平衡后, 两相一般经过重力沉降或离心分离。
离心分离常用的一般是碟片式离心机。
离心机完成了相与相的分离后, 要把酶中的多聚物除去。
葡糖糖淀粉酶是我国最大、最重要的酶制剂产品之一。
产葡糖淀粉酶的菌株多有报道，如红曲霉、黑曲霉、米根霉等。
国外率先使用双水相萃取从技术克服了盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法在分离过程中容易发生蛋白质变性，导致蛋白分离提取的收率和效率相对较低的缺点。
实验三 双水相萃取糖化酶1
生物工程专业实验之三双水相萃取糖化酶实验目的1. 通过实验使学生了解双水相萃取在生物活性物质提取中的重要作用；2. 加深对分配系数K、相比R、收率Y等基本概念的认识及相图的制作；3. 掌握液液萃取中基本实验技术；实验原理双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性，使得聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不相溶的两相，因使用的溶剂是水，因此称为双水相。
原则上，无论是天然的还是合成的亲水聚合物，绝大多数在与另一种聚合物水溶液混合时，都可分成两相，构成双水相体系，几种典型的双水相系统见表一。
通过溶质在相间分配系数的差异而进行萃取的方法称为双水相萃取。
表一几种典型的双水相系统双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法。
双水相系统通常是由水溶性的两种聚合物组成或一种水溶性聚合物与一种盐组成，其中水占有较大的比例（70-95%），相对于传统溶剂萃取来说，双水相萃取的最大优势在于双水相体系可为生物活性物质提供一个温和的活性环境，因而可在萃取过程中保持生物物质的活性和构象，而且双水相技术具有处理量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点；在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离纯化等方面受到广泛重视，是一种有发展潜力的易于工业化应用的生物分离技术。
生物大分子在双水相上相和下相的浓度比被定义为分配系数（K=C t/C b）。
在双水相系统中有许多因素影响分配系数，包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、pH等，以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、分子量等，利用双水相技术，通过大量实验研究，可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配的。
在生化分离中得到广泛应用的双水相体系有：聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)体系，PEG/盐等体系。
分离某一生物大分子，两相系统的选择原则，必须有利于目的产物的萃取和分离，同时又要兼顾到聚合物的物理性质。
PEG_NH_4_2SO_4双水相体系提取和纯化糖化酶
5;5
=>?质量分数的确定
随着 " =>?的增加， 分配系数 ! =>?质量分数的影响如图 5 所示，
逐 渐 减 小 ， 但 当 " =>? 大 于 一 定 值 时 ， !增大 （ " =>? 为 6;5@ 时 ， !为 ； 回收率 # 有一定幅度的变化。要 6;655 ， " =>?为 6;5H9 时， ! 为 6;65E ） 使酶液分配在下相， 综合考虑， 本实验选择 " =>?为 6;5@ 。
5;<
图 @ 纯化因子和 =>? 与（ :A@） 5-B5的比例关系 物料衡算的作用
酶活力易受外界 环 境 的 影 响 ， 如反应温度、 时间等， 而造成所 测酶活力有偏差；或者底物不够大，也会造成所测酶活力偏小等 等。由于以上多种潜在原因， 这里就需要用物料衡算来评定结果， 把实验数据和物料衡算结合起来， 作为指导下一步实验的依据。 分 析双水相体系所得总酶活力和所测原酶活力， 如图 < 。
@65#$%&#： 12/ S)..2)&"W4"+, /+X4(/S Y/&/ /KR&).R/N )+N Z$&"W"/N [4 >?@ A （ :BC） 5-DC N%$[3/ )#$/%$S Z2)S/S S4SR/(; 12/ W).R%&S )WW/.R\ "+, S4SR/( N"SR&"[$R"%+ .%/WW"."/+RS， &/.4.3"+, &)R/ )+N Z$&"W4"+, ),/+RS Y/&/ SR$N"/N )+N R2/ %ZR"()3 .%+N"R"%+S %W S)..2)&"W4"+, /+X4(/S
新型分离技术-第四章 双水相萃取
在聚合物-盐或聚合物-聚合物系统混合物时，会出出
现两个不相混的水相，典型的例子如在水溶液的聚乙
二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran），当各种溶质均
在低浓度时，可以得到单项均质液体，但是，当溶质 的浓度增加时，溶液会变得混浊，在静止的条件下， 会形成两个液层，实际上是两个不相混溶的液相达到 平衡，在这种系统中，上层富集了PEG，而下层富集
双水相萃取法与传统的分离方法(如盐析或有机溶
剂沉淀等)比较也有很大的优势(如表);
处理量相同时，双水相萃取法比传统的分离方法, 设备需用量要少3～10倍; 乙醇脱氢酶的分离已达到几十千克湿细胞规模；
用聚乙二醇（PEG Mr为6000）/磷酸钾系统从大肠
杆菌匀浆中提取β -半乳糖苷酶,β -半乳糖苷酶的
双水相系统由两种聚合物或一种
聚合物与无机盐水溶液组成，由
于聚合物之间或聚合物与盐之间
的不相容性，当聚合物或无机盐
浓度达到一定值时，就会分成不
互溶的两个水相，两相中水分所 占比例在85~95%范围，被萃 取物在两个水相之间分配。
双水相系统中两相密度和折射率差别较小、 相界面张力小、 相易分散，活性生物物质或 细胞不易失活。
第四章：新型萃取技术 Novel extraction techniques
第三部分 :双水相萃取
Two-aqueous phase extraction
双水相萃取技术(aqueous-two phase extraction,ATPS)，又称水溶液两相分配技 术(Partion of two aqueous phase extraction) 。 两相为互不相溶的两水相， 组分在两相中溶解度不同而分离。
β－干扰素（β－IFN）的提取
酶的分离纯化第八节 双水相萃取
目的分子与细胞应分配在 不同
的相 （2） 分配系数应足够大，经过一次萃 取，就能得到较高的收率 （3） 离心机容易分离
4 操作流程
1）萃取和平衡 在带有溢流装置的混合-沉降罐中进行，溢
流位置由两相密度差决定。 虽然在高粘度体系中操作，分子扩速度降 低，但由于表面张力很低，分配能在几分 钟内达到平衡，且由于界面张力很小，界 面能低，搅拌只需很小的剪切力就能得到 分散度很高的悬浮液。
pH的微小变化会使蛋白质的分配系数改变
2-3个数量级
2.2.5 影响分配的因素
（4） 温度的影响
影响相图，同时影响分配率和蛋白质的生 物活性，一般远离临界点，影响较小，由 于亲水性聚合物可保护蛋白质，使其在双 水相中的稳定性增加，所以一般可在室温 下操作。
2.2.5 影响分配的因素
（5）体系中微生物的影响 细胞的破碎程度，
细胞壁和细胞膜化学结 构也会导致体系上下比例的改变
普鲁兰酶 分 配 系 数 a -葡萄糖苷酶
细胞浓度/%
体系：9%PEG4000，2%Dex T500
3 双水相系统的应用
(1) 蛋白质纯化 (2) 酶相转移催化 (3) 小分子分离
A B B C 氨基酸 有机酸 抗生素 天然植物成分
两水相分离条件
第八节 双水相萃取
概述 1.1 特点 （1）保留生物 分子活性 （2）除细胞碎 片 （3）表面张力 低，耗 能少 （4）成本高 （5）大分子及 小分子萃取
1
1.2 双水相体系形成
不同的聚合物分子在液相中溶解时， 由于聚合物分子的空间位阻障碍作用，相 互间无法渗透，当浓度达到一定值时，就 不能形成单一的相，所以具有强烈的相分 离倾向。另外，某些聚合物的水溶液与某 些无机盐的水溶液混合时，浓度达到一定 值，也会形成两相，即聚合物—盐双水相 体系，成相机理尚不清楚，一种解释为 “盐析”作用
糖化酶实验报告
一、实验目的1. 了解糖化酶的特性和催化机理。
2. 掌握糖化酶的固定化技术。
3. 学习通过实验测定糖化酶的活力和半衰期。
二、实验原理糖化酶是一种内切酶，能够将淀粉分子水解成葡萄糖。
固定化酶技术是将酶固定在固体载体上，以提高酶的稳定性和重复使用性。
本实验采用戊二醛交联法固定糖化酶，并通过测定固定化酶的活力和半衰期来评估固定化效果。
三、实验材料与仪器材料：1. 马铃薯淀粉2. 葡萄糖3. 戊二醛4. 交联剂5. 硫酸铵6. 碳酸钠7. pH试纸8. 红外测温枪9. 试管10. 烧杯11. 移液器仪器：1. 研钵2. 恒温水浴锅3. 酶标仪4. 分析天平四、实验步骤1. 酶的制备：1.1 称取适量糖化酶粉末，加入适量蒸馏水溶解。
1.2 将溶解后的酶液加入戊二醛，交联剂和硫酸铵，进行固定化处理。
1.3 将固定化酶用碳酸钠溶液洗涤，去除未固定的酶和杂质。
2. 酶活力测定：2.1 准备一定浓度的淀粉溶液，加入固定化酶，在恒温水浴锅中反应。
2.2 定时取样，用碘液检测淀粉浓度，计算酶活力。
2.3 重复实验，求平均值。
3. 半衰期测定：3.1 在恒温水浴锅中，将固定化酶与淀粉溶液混合，定时取样，测定酶活力。
3.2 以酶活力为纵坐标，时间（min）为横坐标，绘制酶活力随时间变化的曲线。
3.3 根据曲线计算半衰期。
五、实验结果与分析1. 酶活力测定结果：实验结果显示，固定化酶的活力与未固定化酶相近，说明固定化过程对酶活力影响较小。
2. 半衰期测定结果：实验结果显示，固定化酶的半衰期为30min，明显高于未固定化酶，说明固定化技术提高了酶的稳定性。
六、结论1. 糖化酶固定化技术是一种提高酶稳定性和重复使用性的有效方法。
2. 本实验中，戊二醛交联法成功固定了糖化酶，固定化酶的活力和稳定性均得到了提高。
七、实验讨论1. 实验过程中，固定化酶的活力和稳定性与固定化条件（如交联剂浓度、交联时间等）密切相关。
2. 在实际应用中，可根据需要选择合适的固定化方法和条件，以获得最佳的固定化效果。
实验二 双水相萃取分离糖化酶
(2)高聚物浓度—界面张力的影响
当成相系统的总浓度增大时， 系统远离临界点，系线长度增加， 两相性质的差别(疏水性等)增大， 蛋白质越容易分配到其中的一相。
(3)盐类
由于盐的正、负离子在两相间的分 配系数不同，两相间形成电势差，从 而影响带电生物大分子的分配。如下 图：加入氯化钠对卵蛋白和溶菌酶分 配系数的影响
四、实验步骤：
40% PE 硫 G 酸 加 铵 编 入 加 号 量 入 （ 量 ml） （m l） A B C D 3 6 9 9 21 21 11. 25 21 PEG相（上相） 水相（下相）
PEG含 量
硫酸 铵含 量
体 积
测 得 酶 活
稀 释 倍 数
体 积
测 得 酶 活
稀 释 倍 数
相 比
分配系 数
85.18% 97.97% 96.73% 97.28%
1
10 10 17. 5 43 14. 5
五、实验结果与讨论：
实验 双水相萃取分离糖化酶
糖化酶
糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶，它能把淀粉从非还原 性未端水解a-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水 解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊 精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。 糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、 有机酸、氨基酸、维生素的发酵；本品还大量用于生产 各种规格的葡萄糖。总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶 水解的工业上，都可适用。
收率%
0.096 8 0.193 5 0.290 3 0.290 3
0.271 0 0.271 0 0.145 2 0.271 0
5.2 5 13 24 16. 5
66 70 53 55
30
酶双水相萃取
2 ）PEG旳循环
在大规模双水相萃取过程中，成相材 料旳回收和循环使用，不但能够降低废水 处理旳费用，还能够节省化学试剂，降低 成本。PEG回收有两种措施：一种即前面所 述旳加入盐使蛋白质转入富盐相来回收 PEG ，一种是将PEG 经过离子互换树脂， 洗脱剂先洗出PEG，再洗出蛋白质。目前常 用旳措施是将第1步萃取旳PEG 相或除去部 分蛋白质旳PEG相循环利用 。
❖处理措施：开发新型便宜旳双水相系统是 该技术应用急需处理旳问题。
LOGO
相系统旳性质有关
4、蛋白质双水相萃取过程
主要有三部分构成：
目旳产物旳萃取 PEG循环 无机盐旳循环
PEG+盐
P E
匀浆液
ATPS
G
循
环 上相（PEG、杂蛋白） 下相（目旳产物）
ATPS
分离器
上相（产物） 下相（废物）
分离器
+盐
1）目旳产物旳萃取
细胞悬浮液经珠磨机破碎细胞后，与 PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进入 离心机分相。经过选择合适旳双水相构成， 一般使目旳蛋白质分配到上相( PEG相) ， 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配 到下相(富盐相) 。
程
条件下即可分为两相。一般以为，聚合物
水溶液旳疏水性差别是产生相分离旳主要
推动力，且蔬水性差别越大，相分离倾向
也越大。
1.2、双水相系统中作用力旳体现
作用力 为斥力
形成双水相系统
双水相
作用力 形成两相，一相为两 为引力 高聚物，一相为水相 均一相
作用力无 强烈引力
完全互溶，形成均一相
和斥力
两相
1.3、几种常见旳双水相体系
价值。
5.2、蛋白质双水相萃取旳缺陷
双水相体系在糖化酶提取纯化中的应用研究
双水相体系在糖化酶提取纯化中的应用研究
李静;柴艳伟;宫春波;于翠芳;谭海刚
【期刊名称】《食品与发酵科技》
【年(卷),期】2010(046)005
【摘要】本文对PEG/KH2PO4、PEG/(NH4)2SO4和PEG/MgSO4三种体系进行了研究,通过制作相图,分析得出PEG/(NH4)2SO4双水相体系是萃取糖化酶最合适的体系.研究了PEG分子量、PEG溶液浓度、(NH4)2SO4溶液浓度对糖化酶分配系数、回收率的影响,确定了萃取糖化酶的最佳条件,即PEG分子量为20000、PEG溶液浓度为28%、(NH4)2SO4溶液浓度为20%时,分配系数为0.15,糖化酶回收率最高为96.1%.
【总页数】5页(P28-32)
【作者】李静;柴艳伟;宫春波;于翠芳;谭海刚
【作者单位】青岛农业大学食品科学与工程学院,山东,青岛,266109;江南大学食品学院,江苏,无锡,214122;青岛农业大学食品科学与工程学院,山东,青岛,266109;青岛农业大学食品科学与工程学院,山东,青岛,266109;青岛农业大学食品科学与工程学院,山东,青岛,266109
【正文语种】中文
【中图分类】Q814.1
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两水相萃取
混均
浑浊 澄清 记录(NH4)2SO4 记录 ml数 数
PEG400%
按表格重复操作… 按表格重复操作
(NH4)2SO4%
两水相系统中蛋白质分配系数的测定
一. 实验原理
1. 糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同程度地分 糖化酶为生物大分子蛋白， 配，分配系数 K = C上/ C下。 相比R 相比 = V上/ V下
系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组 成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服 从杠杆规则。
如点M为整个系统的组成，该系统实际上由T、 B所代表的两相组成，vT表示上相体积，vB表 示下相体积，则：
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系 线越长，两相间的性质差别越大。当点M 线越长，两相间的性质差别越大。当点M向下 移动时，系线长度缩短，两相差别减小，到达 K点时，系线长度为0，两相间差别消失而成 点时，系线长度为0 为一相，因此K点为系统临界点(critical point) 为一相，因此K点为系统临界点(critical point)。 双节线的位置和形状与聚合物的相对分子质量 有关。聚合物Dex的相对分子质量越高， 有关。聚合物Dex的相对分子质量越高，相分 离所需的浓度越低；两种聚合物相对分子质量 相差越大，双节线的形状越不对称，见图。 相差越大，双节线的形状越不对称，见图。
11.4 影响分配的因素
(1) 聚合物组成的影响 Dextran 分子量（粘度高，价格）。 PEG分子量 PEG分子量 (2) 聚合物浓度影响 密度，密度差，粘度，粘度差，表面张力。 上述参数随聚合物浓度变化。 （3）盐与缓冲液 A 盐离子的不均匀分配改变两相间电位差 B 高盐浓度引起盐析效应 （4） pH lgKi*=lgKi+γZi , 等电点测定 （5） 温度的影响(离开临界点远，不太敏感，粘度) 温度的影响(离开临界点远，不太敏感，粘度两水相萃取
《生物分离工程实验》课程教学大纲
《生物分离工程实验》课程教学大纲总学时：24 学 分：1.5理论学时：0 实验学时：24面向专业：生物工程 课程代码：B4100112先开课程：物理化学、化工原理等 课程性质：必修课执笔人：谭海刚 审定人：宫春波 孙庆杰第一部分：实验教学部分一、说明1、本门课程实验的性质任务、目的与要求本实验课程是对理论教学课程的验证，训练学生掌握生物分离工程最基本的操作技能， 了解生物分离的基本知识，加深理解课堂讲授的某些生物分离理论，同时，通过实验培养学 生观察思考、分析问题和解决问题的能力，培养学生实事求是、严肃认真的科学态度以及勤 俭节约、爱护公物的良好作风，为今后的学习和工作打下坚实的基础。
2、本门课程实验项目设置情况实验类型序号 实验名称学时必开选开验证基本操作综合性、设计性内容提要1 微生物细胞的破碎及分离4 √ √啤酒酵母的培养；超声波破壁（高压匀浆破壁或酶法破壁）；计算细胞破碎率。
2 牛奶中酪蛋白的制备及其等电点的测定4 √ √牛奶中酪蛋白的制备——离心去脂法和加热法；酪蛋白等电点的测定。
3 用 PEG/ （NH4） 2SO4双水相体系萃取糖化酶6 √ √不同比例双水相体系提取糖化酶；次碘酸盐法测定糖化酶活力。
4 糖化酶的分离纯化——分子筛层析脱盐6 √ √糖化酶的浸出； 硫酸铵盐析；分子筛层析脱盐；测定糖化酶活力。
5 离子交换树脂总交换容量的测定6 √ √用静态法和动态法测定阴、阳离子交换树脂的总交换容量。
6 氨基酸的分离鉴定——纸层析法4 √ √配制扩展剂和显色剂； 点样；展开；显色；计算 R f 值。
7 酵母 RNA的提取及 4 √ √ 浓盐法、稀碱法提取酵母定性和定量鉴定 ——浓盐法和稀碱 法 RNA；紫外分光光度计测定 酵母 RNA的含量。
8 薄层层析法分离鉴定糖分4 √ √配制扩展剂和显色剂； 制板；点样；展开；显色；计算 Rf值9用超滤技术分离和浓缩碱性蛋白酶 （糖化酶）8 √ √以碱性蛋白酶（糖化酶）粗品为料液超滤，同时进行超滤性能各项指标的研究，包括膜的水通量、截留率、超滤速度随透出液体积而变化的规律。
糖化酶活力测定(1)
在这一系列的反应中，1mБайду номын сангаасl葡萄糖与 1mol NaIO 作用，而1molI2 产生1molNaIO， 因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。 6.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
没有葡萄糖的情况 1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O 2、NaIO在碱性条件下发生歧化反应: 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 3、总反应 3I2+6 NaOH =NaIO3+5NaI+3H2O 4.歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2: NaIO3 +5NaI +3H2SO4=3I2 +3Na2SO4+3H2O
B- 空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数； A- 酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平均值）； N- 硫代硫酸钠的当量浓度。
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2%淀粉溶液 水解生成1μ mol葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位 （U）： 酶活力单位（U/ml）= （B－A）×10-3 ×（N/2）产生的葡萄糖的量 ×（8/5） ×106 转为umol ×2 酶液量0.5ml ×（1/10）转为1min 式中符号与前式相同。
3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1N NaOH溶液 5ml ，(注意： 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧 化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的 NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) 摇匀，在暗处 放置15min后加入1N硫酸2ml； 4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可）， 用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终 点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶 液样品（A）、空白对照（B）；
双水相萃取
双水相萃取的应用
2.人生长激素的提取
用PEG4000 6.6%/磷酸 盐14%体系从E. Coli碎片 中提取人生长激素(hGH )， 当pH值=7，菌体含量为为 1.35%(W/V)干细胞，混合 5~10s后，即可达到萃取平 衡，hGH分配在上相，其 分配系数高达6.4 ，收率大 于60%。若进行三级错流 萃取，总收率可达81%.
系线
均相区
双水相萃取原理—特点
优点： • 有助于保持生物活性 • 易于放大，可以按比例放大 • 回收效率高，耗能较少，速度快 • 操作条件温和（常温常压） • 易于连续化操作，设备简单
双水相萃取原理—特点
缺点： • 成本较高 • 易乳化 • 不易定量控制 • 高聚物回收困难
双水相萃取的应用
1 分离纯化小分子
双水相的形成
• 在聚合物与聚合物或聚合物与无机盐混合时，有时会出现 两个不相混溶的水相 ，如聚乙二醇—葡聚糖体系
上层组成：5%聚乙二醇 2%葡聚糖 93%水 下层组成：3%聚乙二醇 7%葡聚糖 90%水
PEG : 聚乙二醇 DX : 葡聚糖
双水相的形成
双水相萃取原理
• 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在 两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时,物质进 入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎 水键、氢键和离子键等) 的存在和环境因素的影响,使其 在上、下相中的浓度不同。物质在双水相体系中分配系 数K可用下式表示：K= C上/ C下 • InK = InKm+InKe+In Kh+InKb+InKs+InKc 式中，Ke-----静电作用对溶质分配系数的贡献； Kh----- 疏水作用对溶质分配系数的贡献； Kb-----生物亲和作用对溶质分配系数的贡献； Ks----- 分子大小对溶质分配系数的贡献； Kc----- 分子构型影响对溶质分配系数的贡献； Km -----除上述因素外的其它因素影响对溶质分配系数 的贡献。
(三)糖化酶的分离和提取.
（三）糖化酶的分离和提取一、实验目的掌握酶工程中的一些分离和提取方法。
二、实验原理酶的分离提取首先要除去发酵液中的悬浮固形物，获得澄清的酶液；然后进行适当浓度的浓缩；其次将酶沉淀，然后收集沉淀；干燥、磨粉、获得粉状制剂。
黑曲霉糖化酶是一种胞外酶，提纯工艺比较简单。
首先采用过滤法将菌体等杂质除去，继而对滤液进行浓缩，最后将酶沉淀出来，对沉淀物进行干燥，加工成成品。
糖化酶的沉淀可采用硫酸铵盐析法，也可采用有机溶剂如乙醇沉淀。
三、实验材料1.液体培养将黑曲霉从斜面转接到液体三角瓶，28度，200rpm培养96h2.溶液及试剂盐酸、无水乙醇、硫酸铵等3.器材漏斗、离心机、抽滤泵、抽滤瓶、蒸发器、布氏漏斗、天平、干燥箱、定量滤纸四、方法步骤1.发酵液过滤取成熟的发酵液，在漏斗中用滤布过滤除去菌体。
菌体用２０ml水洗涤，抽滤。
合并清夜，量总体积2.浓缩和沉淀将总滤液放入蒸发器中浓缩到1/3～1/5体积，测定酶活。
将浓缩液均分为二，一份用盐酸调节ph至3.5。
在10～20℃条件下加入3.5倍冷冻的无水酒精，边加边搅拌，即可发现酶的沉淀现象。
沉淀物用布氏漏斗抽滤，并称酶泥的重量另一份按55g/100ml加硫酸铵，静止盐析1h。
沉淀物用布氏漏斗抽滤，称酶泥的重量3.干燥与加工将上述步骤中得到的酶泥放入干燥箱，在40℃下以热风干燥。
将干燥的制品磨粉即得成品。
将成品称量并测定酶活。
五、结果分析2.糖化酶的得率得率=（酶泥酶活*酶泥重量）/（浓缩液体积*浓缩液酶活）=（3321.82*0.9715）/（40*113.0805）= 71.35%3.分析从数据可知糖化酶得率较高，为71.35%，由此可知糖化酶得率较好，次实验方法可行，但还可以又进一步改进的余地。
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生物工程专业实验之三双水相萃取糖化酶实验目的1.通过实验使学生了解双水相萃取在生物活性物质提取中的重要作用；2.加深对分配系数 K 、相比 R、收率 Y 等基本概念的认识及相图的制作；3.掌握液液萃取中基本实验技术；实验原理双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性，使得聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不相溶的两相，因使用的溶剂是水，因此称为双水相。
原则上，无论是天然的还是合成的亲水聚合物，绝大多数在与另一种聚合物水溶液混合时，都可分成两相，构成双水相体系，几种典型的双水相系统见表一。
通过溶质在相间分配系数的差异而进行萃取的方法称为双水相萃取。
表一几种典型的双水相系统聚丙二醇聚乙二醇，聚乙烯醇，葡聚糖（Dex ），羟丙基葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖（Dex），聚乙烯吡咯烷酮硫酸葡聚糖钠盐聚丙烯乙二醇羧甲基葡聚糖钠盐甲基纤维素羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基纤维素钠盐聚乙二醇磷酸钾，硫酸铵，硫酸钠，硫酸镁，酒石酸钾钠双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法。
双水相系统通常是由水溶性的两种聚合物组成或一种水溶性聚合物与一种盐组成，其中水占有较大的比例（70-95% ），相对于传统溶剂萃取来说，双水相萃取的最大优势在于双水相体系可为生物活性物质提供一个温和的活性环境，因而可在萃取过程中保持生物物质的活性和构象，而且双水相技术具有处理量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点；在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离纯化等方面受到广泛重视，是一种有发展潜力的易于工业化应用的生物分离技术。
生物大分子在双水相上相和下相的浓度比被定义为分配系数（ K=C t/C b）。
在双水相系统中有许多因素影响分配系数，包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、pH 等，以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、分子量等，利用双水优分配的。
在生化分离中得到广泛应用的双水相体系有：聚乙二醇(PEG)/ 葡聚糖 (Dex) 体系，PEG/盐等体系。
分离某一生物大分子，两相系统的选择原则，必须有利于目的产物的萃取和分离，同时又要兼顾到聚合物的物理性质。
如甲基纤维素和聚乙烯醇，引起年度太高而限制了它们的应用。
PEG 和 Dex 因其无毒性和良好的可调性而得到广泛的应用。
糖化酶亦称淀粉α-1,4 葡萄糖苷酶。
这类酶作用于淀粉分子末端，从淀粉非还原性末端顺次切开α-1,4糖苷键，生成葡萄糖。
它们也能作用于支链淀粉的α-1,6键，但速度较慢，因此分解产物全部为葡萄糖，作用结果使糖的还原能力迅速增高。
糖化酶在食品、酿造工业上有着广泛用途，是酶制剂工业上一个重要品种。
国内生产糖化酶的菌种主要是黑曲霉和根霉。
本实验选用PEG400-(NH 4)2SO4为双水相系统，从发酵液中萃取糖化酶。
表观分配系数：相比 :V t RV b上相酶总量V t C t RK收率:YV b C b 1 RK上、下相酶总量 V t C t式中 :C b、 C t分别为下、上相酶浓度（活性）；V b、 V t分别为下相、上相的体积。
分配系数 K 与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。
物料衡算：加入的原液总酶活 =上相酶活×上相体积 +下相酶活×下相体积实验仪器与药品仪器：天平、恒温水浴、K C t离心机、液相混合器；刻度试管、吸管、酸式滴定管等；C b药品：发酵液、 PEG400、(NH 4)2 SO4、 NaOH(C.P) 、 2%可溶淀粉、 0.15 M NaOH 、1 M H 2SO4；实验步骤1. PEG400-(NH42 4 双水相系统相图的制作)S O水性两相的形成条件和定量关系常用相图表示，由上、下相中PEG 和 (NH 4)2SO4的浓度可在 PEG-(NH 4)2 SO4浓度图中得到点，顺次连接这些点得到一曲线，称为双节线。
双节线下方为一相区，上方为两相区。
1.1配制 40％的硫酸铵溶液（已经配好）。
在具塞三角瓶中准确称量约7 g 左右，实验中量取 7.19g 的 PEG400；1.2按实验记录部分的表依次进行，先加入 5 ml 水（此时体系澄清）。
然后用滴定管慢慢加入40％ (NH 4 )2SO4溶液，不断摇匀，直至试管开始出现混浊为止，记录加入的 (NH 4)2 SO4的体积和质量；1.3按实验记录部分的表依次进行，加入适量水（水的加量），使体系变澄清，并继续加入 40％ (NH 4)2SO4，使系统再次变混浊，记录加入的体积和质量；1.4 如此反复操作，计算达到混浊时PEG 和(NH 4)2SO4在系统中的重量百分浓度，得出PEG 和 (NH 4) 2SO4的双节线图。
2.双水相系统中蛋白质分配系数的测定2.1 按实验记录部分的表中所示的顺序，干燥的50ml的离心管适量PEG400，再加入适量 40% (NH 4 )2SO4溶液，加入适量水补足到30ml，在混合器上混匀，再加入1ml酶液，于混合器上混合 2 min 。
然后离心 5 min （混匀过程一律手动进行上下混匀）。
2.2 取出读取上、下相体积及总体积，按表二中所示的稀释倍数取样稀释后，分别测其酶活。
酶原液稀释20 倍测定。
2.3 糖化酶活力测定方法2.3.1 糖化：在干燥试管中，加入2% 可溶淀粉溶液 5 ml ，再加入pH 4.5 的醋酸 -醋酸钠缓冲液 1.25 ml ，加入0.5 ml稀释酶液，迅速摇匀计时（空白实验用0.5 ml蒸馏水代替酶液）在 50°C恒温水浴中准确保温60 min ，加入四滴1M NaOH。
2.3.2 定糖：吸出 1 ml糖化液，稀释一定倍数用SBA测定（显示值在0～ 100 之间为正常，如果超过100 请根据显示数值稀释相应倍数再次测定）注意事项1.FEG400 比较粘稠，在取用时尽量慢一点，保证所取体积；2.实验开始前要准确称量空瓶的重量，实验过程中每步加水和加硫酸铵溶液步骤必须称量总体系的重量；3.在滴定的过程中轻轻的振荡三角瓶，尽量减慢硫酸铵滴定的速率，并时刻观察瓶中液体的变化，注意滴定终点；4.这个实验是两个小实验，实验步骤比较多，做实验前要按照一定的顺序进行，按实验步骤做好组内分配工作，对所做实验做好标记，特别是在稀释过程中要在试管上贴好标签，同时准确记录记录实验数据；5.实验完毕，做好清洁工作。
实验结果以下是两个实验的数据记录表：1.两相图实验数据：所取的 PEG 质量为 7.19g；其中瓶质量为78.29g：表二两相图数据记录表次数水体积水的质40% 硫酸铵溶硫酸铵总溶液PEG 含硫酸铵（ ml ）量（ g）液（非溶体系累量%含量 %液）累积计量（ g）（ g/g）（ g/g）g ml量（ g）15 5.03 1.42 1.150.56813.6452.71 4.1623 3.02 2.61 2.10 1.61219.2737.318.3733 3.027.37 6.10 4.5629.6624.2415.37 43 2.9911.699.709.23644.3316.2220.83 55 5.0622.2618.6018.1471.6610.0325.31 2.双水相系统中蛋白质分配系数的测定表三双水相系统中蛋白质分配系数的测定编号 PEG40%硫PEG硫酸加入酸铵加含铵含量入量量量（ ml（ ml））PEG 相 (上相 t)水相（下相 b）相比分配收率体积测稀体积测稀系数(%)（ ml得释得释）酶倍酶倍活数活数A3210.10.284681026.75710.1597.193.6 B6210.20.2811.661519.240.6076.397.9 C911.250.30.15224459.316 2.3713.897.0 D9210.30.281429516.330.8648.397.6其中分配系数：C t V t K相比： RC b V b收率： Y上相酶总量V t C t RK 上、下相酶总量V t C t V b C b 1 RK式中 :C b、 C t分别为下、上相酶浓度（活性）；V b、 V t分别为下相、上相的体积。
物料衡算：加入的原液总酶活=上相酶活×上相体积 +下相酶活×下相体积说明：其中的酶活是以葡萄糖的含量为准的，因为酶浓度越大，酶活就越高，最后得到的葡萄糖的含量也就越高，因此在计算时统一以葡萄糖的浓度为基准衡量酶活的大小，注意相应的稀释倍数即可，而且计算时相应的结果都是两者相比，也就不存在单位的不统一的问题。
实验结果及讨论1. 在PEG400-(NH4)2SO4 双水相系统相图中，根据实验所得数据，作出PEG400-(NH 4)2SO4双水相系统的相图，如下图所示，在双水相中，由不同的PEG 含量下，滴定所用的(NH 4)2SO4的量：图一PEG400-(NH4)2SO4 双水相系统相图2.根据实验所得数据，计算各种系统的相比，糖化酶在各种双水相系统中的分配系数及收率，讨论其结果。
编号测量参数原液总酶活相比分配系数收率A2907.250.1597.193.6B3614.80.6076.397.9C4988.8 2.3713.897.0D2078.90.8648.397.6。