病毒感染力的滴定
TCID50与moi值的计算.doc
实验四病毒感染力的滴定（TCID的测定）50一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力的方法( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测半数致死量LD50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞半数细胞培养物感染量TCID50来检测蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）的操作步骤四、TCID501、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。
3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
（100µl生长液+100µl细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法的计算方法五、TCID501、Reed-Muench两氏法CPE：Cytopathic effect距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.6-50）/（91.6-40）＝ 0.8lgTCID=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数50=0.8×(-1)+(-3)=-3.8=10-3.8/0.1mlTCID50含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。
临床医学检验临床微生物：病毒检验基本技术考试资料
临床医学检验临床微生物：病毒检验基本技术考试资料1、单选适合于登革病毒的分离和培养的细胞是（）A.C6／36B.鸡胚C.VeroD.HelaE.Hep－2正确答案：A参考解析：C6／36是白蚊伊蚊细胞（江南博哥）。
该细胞同样适合于培养分离由蚊子作为传播媒介的乙型脑炎病毒。
2、单选常用的麻疹的诊断实验是（）A.ELISA检测急性期血清中特异性IgM抗体B.ELISA检测急性期和恢复期血清中特异性IgG抗体C.病毒分离D.RT－PCR检测病毒核酸E.红细胞凝集抑制试验正确答案：A参考解析：麻疹病毒感染后，IgM抗体出现较早，因此把IgM抗体的出现作为早期麻疹感染的证据，WHO建议使用ELISA方法检测麻疹病毒特异性，IgM抗体来进行麻疹的诊断。
3、单选关于病毒学检验中标本采集、处理与运送的原则是（）A.标本必须新鲜，采集后立即送检B.用于分离和鉴定的标本应在急性期采集C.在检验容器上要贴好标签D.用于分离和鉴定的标本应在病程初期采集E.以上都是正确答案：E4、单选流行性斑疹伤寒的病原体是（）A.普氏立克次体B.莫氏立克次体C.康氏立克次体D.Q热立克次体E.小蛛立克次体正确答案：A参考解析：普氏立克次体引起流行性斑疹伤寒，莫氏立克次体引起地方性斑疹伤寒。
5、单选关于蓝氏贾第鞭毛虫所致腹泻病的叙述，下列不正确的是（）A.人是该病的主要传染源B.该病多为自限性C.该病多见于环境卫生差、医疗水平低的地区D.该虫定居于结肠E.检查其包囊时宜用碘液染色法正确答案：D参考解析：氏贾第鞭毛虫简称贾第虫。
寄生人体小肠、胆囊，主要在十二指肠，可引起腹痛、腹泻和吸收不良等症状，致贾第虫病，为人体肠道感染的常见寄生虫之一。
6、单选以下破碎细胞让病毒释放出来的方法不属于物理方法的是（）A.研磨B.冻融C.超声波处理D.中性去污剂裂解E.高压冲击正确答案：D7、单选病毒的分子生物学鉴定包括病毒核酸和蛋白质测定，蛋白质测定可使用（）A.免疫测定技术、电泳技术和质谱技术等B.免疫测定技术、探针技术和质谱技术等C.免疫测定技术、电泳技术和聚合酶链反应技术等D.免疫测定技术、电泳技术和杂交技术等E.免疫测定技术、电泳技术和探针技术等正确答案：A参考解析：探针技术、杂交技术和聚合酶链反应技术等用于核酸测定。
病毒滴度
二、空斑测定法空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。
这一方法得到的结果往往最不稳定。
1．5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。
或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。
2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。
第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。
稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。
稀释：将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。
用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。
换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%吸打5次，稀释度为10-2。
然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。
注意：每次稀释时都必须换用新枪头。
3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。
4．吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。
5．37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。
21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。
结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。
三、50%组织培养感染剂量法此方法基于最高稀释度下在细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法（一）细胞准备：1．收集一瓶细胞，计数。
2．用DMEM 2%准备20ml 105/ml细胞。
3．用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。
（二）准备稀释病毒液1．第1管中加入0.9ml DMEM 2%，其余加入1.8ml。
常规病毒学实验技术
常规病毒学实验技术常规病毒学实验技术（⼀）病毒的培养实验动物：家兔、⼩⽩⿏、⼤⽩⿏、豚⿏、仓⿏主要⽤于：①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒②培养病毒，制造抗原和疫苗③测定各毒株之间的抗原关系，（⽤实验动物作中和试验和交叉保护实验）④制备免疫⾎清和单克隆抗体⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒⼒测定、建⽴病毒病动物模型等注意：选择对⽬的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。
鸡胚（⼀）条件要求SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。
新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。
（⼆）优点组织分化程度低，可选择不同的⽇龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有⼤量病毒，容易采集和处理，⽽且来源充⾜，设备和操作简便易⾏。
（三）接种途径1．绒⽑尿囊膜接种（10-12⽇龄鸡胚）主要⽤于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。
1）⽅法⼀（造⼈⼯⽓室）①在胚胎附近近⽓室处，选择⾎管较少的部位，⽤电烙器在卵壳上烙⼀个直径约3-4mm的烤焦圈。
②⽤碘酊和酒精消毒后，⼩⼼⽤⼑尖撬起卵壳，造成卵窗。
③在⽓室端中央钻⼀个⼩孔。
④⽤针尖挑破卵窗中⼼的壳膜，切勿损伤其下的绒⽑尿囊膜。
⑤滴加滴⽣理盐⽔于刺破处，⽤橡⽪乳头紧贴于⽓室中央⼩孔上吸⽓，造成⽓室内负压，使卵窗部位的绒⽑尿囊膜下陷⽽形成⼈⼯⽓室，此时可见滴于壳膜上的⽣理盐⽔迅速渗⼊。
⑥⽤1ml注射器滴⼊2-3滴接种物于绒⽑尿囊膜上。
⑦⽤透明胶纸封住卵窗，或⽤玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的⽯蜡密封，⽓室中央的⼩孔⽤⽯蜡密封。
⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
2）⽅法⼆①在⽓室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的⼝。
②⽤灭菌眼科镊⼦撕去⼀⼩⽚内壳膜。
③滴⼊接种物。
④⽤透明胶纸封闭开⼝。
2．尿囊腔接种（10-11⽇龄）⽤于正粘病毒和副粘病毒（NDV）1）画出⽓室和胚位2）在⽓室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒3）⽤钢锥穿⼀⼩孔4）将注射器针头沿此⼩孔插⼊0.5-1cm，注⼊接种物5）⽤⽯蜡封⼝，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次3．卵黄囊接种（6-8⽇龄）主要⽤⾍媒病毒以及鹦鹉热⾐原体和⽴克次⽒体等的分离和增殖。
第三章病毒感染力的滴定-精品文档
逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber
法
TCID50的计算方法
Calculation of TCID50
• Use of Reed & Muench method (if 50 ul of virus dilution is added to each well)
forming unit, PFU）
概念：
每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即病毒悬液中
的感染性病毒浓度。 计算方法： 如用PRV接种PK-15细胞，每孔接种了0.4ml， 结果10-5孔形成了208个空斑，而10-6孔形成了22个
空斑，则该病毒在PK-15细胞上的空斑形成单位
（PFU）为：22×106/0.4ml=5.5×107个/ml。
第三章 病毒感染力的滴定
测定病毒感染力的方法:
半数致死量LD50（50% lethal dose）
半数鸡胚感染量EID50 (egg 50% infective
dose)
半数细胞培养物感染量TCID50（tissue culture 50% infective dose) 蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）
一、病毒TCID50的测定
操作步骤
在青霉素瓶中将病毒作连续 10 倍的稀释，从 101-10-10。
将稀释好的病毒接种到 96孔微量培养板中，每一
稀释度作8孔，每孔接种100µ l。
在 每 孔 加 入 细 胞 悬 液 100µ l，使细胞量达到 3×105个/ml。
设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
限性的病灶。
plaques
病毒滴度测定
可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。
第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ;第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释, 所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0uL;第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释, 所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ;依次类推…第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释, 所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5 uL ;第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释, 所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6 uL ;换句话说：如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3 个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E-5)=3E+5 ，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。
稀释计数法滴度单位：TU/mL指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
「TU」为「transducing units 」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293 T细胞消化计数后稀释至1 X 100 000/mL，加入96孔板，100卩L/孔，为每个病毒准备10个孔。
放入37 °C，5%二氧化碳培养箱中培养。
第二天加病毒在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5mL EP管，每管加入90卩L培养液，往第一个管中加入10卩L病毒原液，混匀后,吸取10卩L加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度(10—0.00000001 )。
吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100卩L完全培养液，利于细胞的生长。
第四天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
微生物检验技术初级(士)专业知识模拟试卷8(题后含答案及解析)
微生物检验技术初级（士）专业知识模拟试卷8(题后含答案及解析) 题型有：1. A1/A2型题1．Alsever液常用于A．培养细胞B．冻存细胞C．制作红细胞悬液D．空斑试验E．中和试验正确答案：C2．红细胞在Alsever液中的保存期限A．4℃保存1天B．4℃保存1个月C．室温保存1个月D．4℃保存1年E．室温保存1年正确答案：B3．关于补体结合试验错误的是A．补体的某些组分对热很不稳定，采血后要尽快分离血清放低温保存B．为保证补体的稳定性，含补体的血清每次试验前要用冷水溶解C．补体可反复冻融D．稀释后的补体仅限当天使用E．试验中补体量过大会影响试验灵敏度正确答案：C4．病毒实验中用于浸泡和清洁玻璃器材的清洁浸泡液含有的化学成分是A．硫酸和重铬酸钾B．硫酸C．盐酸D．硝酸E．重铬酸钾正确答案：A5．配制清洁液的正确方法是A．将重铬酸钾放入自来水中，加热完全溶解冷却后慢慢加硫酸B．先加水，加硫酸再加重铬酸钾C．先加硫酸，加重铬酸钾再加水D．先加重铬酸钾，加硫酸再加水E．先加硫酸，加水再加重铬酸钾正确答案：A6．细胞培养液可分为细胞生长液和细胞维持液两种。
这两种液体成分的主要区别是A．氨基酸含量不同B．氨基酸种类不同C．血清含量不同D．维生素含量不同E．谷氨酰胺含量不同正确答案：C7．用于病毒的组织培养的合成营养液中不包括A．氨基酸B．辅助生长因子C．无机盐D．维生素E．脂肪正确答案：E8．常用的细胞培养液是A．高糖DMEMB．MEM和1640C．Ham F12D．低糖DMEME．McCoy5A正确答案：B9．细胞培养液中要使培养液具有较强的缓冲能力可加入A．HEPESB．谷氨酰胺C．碳酸氢钠D．胎牛血清E．双抗正确答案：A10．用于分离组织和成片细胞分散的成单个细胞的化学试剂为A．HEPES和胰蛋白酶B．胰蛋白酶和EDTAC．HEPES和Versen溶液D．胰蛋白酶和胎牛血清E．胎牛血清和Versen溶液正确答案：B11．细胞生长最适宜的pH范围是A．6．4～6．8B．6．8～7．0C．7．0～7．2D．7．2～7．6E．7．6～8．0正确答案：D12．细胞培养技术全过程的关键是A．保持培养器皿的高度清洁B．调节血清浓度C．调节pHD．防止污染E．确定细胞传代的时机正确答案：D13．细胞培养中血清的作用不包括A．提供营养因子B．防止细菌污染C．促进细胞贴壁D．促进细胞生长E．酸碱缓冲能力正确答案：B解析：血清是细菌的营养物质，因此不能防止污染。
TCID50的测定方法
实验病毒感染力的滴定（TCID50的测定）滴度：在半定量或定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。
根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱。
滴度（抗体的多少）越高，受传染的机会就越小。
一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力的方法半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步骤1、在离心管中用MEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-6。
2、将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8 孔，每孔接种100µl。
3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
（100µl生长液+100µl细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法。
五、TCID50的计算方法1、Reed-Muench两氏法（CPE：Cytopathic effect细胞病变影响）距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.6-50）/（91.6-40）＝0.8lg TCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。
病毒滴度的测定
病毒滴度的测定病毒感染的测量方法–直接计数法将病毒与乳胶颗粒混合电子显微镜观测缺点是无法判断病毒的感染性–间接计数法空斑形成单位plaque forming unitsPFUs 50终点法血凝试验干扰滴定第一节空斑形成单位法一、基本原理原理–空斑形成单位plaque forming unitsPFUs试验将不同稀释倍数的病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合当病毒感染时会造成宿主细胞溶解而形成空斑每个空斑系由一个病毒颗粒引起计数空斑数目再乘稀释倍数得病毒感染的浓度–病毒空斑—蚀斑将病毒稀释后移入单细胞培养瓶中吸附1h后覆盖营养琼脂病毒在琼脂中只感染临近的细胞形成空斑的退化细胞区中性红染色活细胞染红色死细胞无色产生CPU的病毒均可用此方法二、方法与步骤测定病毒空斑的试验方法–病毒杀死感染细胞的检测产生细胞病变效应中型红活细胞染红色台盼兰死细胞染蓝色MTT溴化二苯基四氮唑将活细胞染成深蓝色易于计数易分离病毒转化或有抵抗力的细胞–未能杀死细胞可产生血凝素因能吸附红细胞空斑用血吸附显出用显微镜计数吸附红细胞的空斑–细胞融合病毒感染细胞与临近的未感染细胞融合形成多核细胞用显微镜观查合胞体空斑–空斑中含有病毒的抗原免疫荧光分析–免疫组化技术生物素-抗生物素-过氧化物酶染色技术间接免疫过氧化物酶染色三、空斑形成单位法测定病毒滴度的计算空斑形成单位试验技术–传代细胞平皿法单层细胞浓度为2×106培养液为RPMI1640EagleMEM 病毒液稀释在冰浴盘作10倍稀释每个稀释度培养2瓶每加一次样时要新吸管来回吸三次加至培养瓶无细胞层的瓶壁底角再倾斜来回摇动使病?揪 ? CO2孵箱吸附90min后再用营养琼脂覆盖培养58d后加入0.01的中性红染色计数空斑病毒滴度的计数–按以下公式计算空斑形成单位PFUs/ml dvnn21X1、X2、Xn表示同一稀释度在不同培养孔板实验单位中数得到的空斑数n表示计数空斑的培养板孔数v表示病毒量mld表示稀释倍数例以稀释成10-4的病毒悬液感染细胞四个培养板孔中的空斑数分别为113及5个接种量为0.2 ml 空斑形成单位PFUs/ml 4100.245311 1.25×105PFUs/ml 空斑形成单位PFUs与重复感染数M.O.I –重复感染数Mutiplicity of InfectionM.O.I是指感染一个细胞的病毒颗粒的平均数–一般来说M.O.I值越大则实验细胞被感染的比例越大–若某病毒的PFUs 已经测得要按一定量的M.0.I进行感染细胞时则所需的病毒量可按公式1和2计算公式1实验细胞数×所需的M.O.I值所需的PFUs 公式2所需的PFUs/实际病毒的PFUs需要加的病毒量例已知某病毒的滴度为1.3×1011 PFUs/ml试验细胞数为每孔1.8 ×106计划M.O.I值为200。
病毒感染力的滴定(TCID50的测定)
病毒感染力的滴定（TCID50的测定）概念：半数感染量（median infective dose， ID50）表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。
一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力的方法半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步骤1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。
3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
（100µl生长液+100µl细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml含义：将该病毒稀释103.875接种100µl可使50%的细胞发生病变。
实例1鸡新城疫活疫苗（一）培养病毒将鸡新城疫病毒（la sota株）接种于9～11d鸡胚的尿囊腔中，接种后48～72h收获病毒，供检测与制苗用。
病毒感染力的滴定(TCID50的测定)
病毒感染力的滴定（TCID50的测定）概念：半数感染量（median infective dose， ID50）表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。
一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力的方法半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物(tissue,组织)感染量TCID50（50% tissue culture inf ective dose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步骤1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10 -10。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。
3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
（100µl生长液+100µl细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高稀释度的对数（-1）D：稀释度对数之间的差（lg10-1-lg10-2=1）S：阳性孔比率总和（1+1+0.875+0.375+0.125=3.375）lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml含义：将该病毒稀释103.875接种100µl可使50%的细胞发生病变。
病毒滴定方法
病毒滴定方法病毒滴定方法1．样品细胞培养中生长的病毒，或保存于储存液中的病毒，都可用于下列程序。
2. 原理在进行病毒中和试验之前，所有的病毒必须预先于以定量，以便使中和试验中的病毒与其反应物（如待测病人的血清抗体）相互之间有一个合适的量。
病毒滴定是先将病毒作一系列的10倍稀释，再将它们分别加到敏感细胞的培养物上，培养一定时间以后观察病毒生长迹象。
滴度的终点是能使50%接种的细胞产生病毒增殖的病毒最高稀释度，称为半数细胞感染量，即TCID50。
因此，滴定结果并不是病毒颗粒的准确数量，而是一种稀释度，病毒在这一稀释度时仍然存在并具有感染性。
3. 材料3.1 仪器无菌易盖试管（12 × 75 mm），无菌吸管（1 mL，5 mL），斜架，35°C培养箱，显微镜，振荡器。
3.2 试剂细菌培养基4. 方法4.1 准备病毒悬液如果病毒是从单层细胞培养得到的腺病毒或肠道病毒，可按以下冻融法制备病毒悬液。
先将含病毒的细胞管连同其中的培养液一起放入-70°C冷冻。
当培养液完全冻结以后，取出置于自来水笼头下以流水融化。
重复如此冻融一次。
移入离心管，1500 × g离心10分钟，取上清液滴定病毒。
对于其它病毒（VZV除外），可以用病毒培养的细胞上清液滴定病毒。
4.2 取8支无菌试管，分别标上-1，-2，-3，-4，-5，-6，-7，-8，这些数字代表稀释度的指数。
4.3 每管中加入0.9 mL细胞培养基4.4 用100 μL 移液枪取0.1 mL混匀的病毒悬液（4.1），加入到第1管（-1管）中，盖上盖以后振荡混匀。
4.5 换用一支新的枪头，从-1管中取0.1 mL移入-2管中，振荡混匀。
如此继续稀释至-8管，注意每次移液都必须换用新的枪头，否则就会将枪头外面的病毒带入到新的一管，导致过高估计滴度的终点。
4.6 对于一个稀释度，准备2支敏感细胞，作好标记。
4.7 从不同稀释的病毒管中各取0.1 mL接种到相应标记的敏感细胞管中，每个稀释度种2管。
病毒滴度测定
病毒滴度测定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。
1．VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）2．GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3．PFU（空斑形成单位）4．TCID50（50%组织培养感染剂量）不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。
1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。
用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。
因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。
2．GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。
这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。
如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。
3．PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。
空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。
一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。
4．TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。
病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。
TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。
许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。
最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。
一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。
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二、病毒蚀斑技术 病毒蚀斑（plaque) 又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形
成的局限性病灶。
原理：适当稀释的病毒悬液接种经长成单层的敏感
细胞后，在覆盖的固体或半固体介质（琼脂糖、甲基 纤维素）的作用下，病毒在最初感染的细胞内增殖后， 只能进而感染并破坏临近的细胞，经过几个增殖周期 后，形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区，即局
每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即病毒悬液
中的感染性病毒浓度。 计算方法： 如用PRV接种PK-15细胞，每孔接种了0.4ml，结 果10-5孔形成了208个空斑，而10-6孔形成了22个空斑，
则该病毒在PK-15细胞上的空斑形成单位（PFU）为：
22×106/0.4ml=5.5×107个/ml。
一、病毒TCID50的测定 操作步骤
在青霉素瓶中将病毒作连续 10倍的稀释，从10-1-
10-10。
将稀释好的病毒接种到 96孔微量培养板中，每一
稀释度作8孔，每孔接种100µ l。
在每孔加入细胞悬液100µ l，使细胞量达到3×105 个/ml。
设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
将培养板臵37℃ 5% CO2培养箱吸附1h，吸弃病毒液， 用含钙、镁的PBS（pH7.4）洗3次。 取1.6%-2%的低熔点琼脂糖，融化后降温至38-42℃，
与等量预热至38-42℃含6%-10%犊牛血清的无酚红
DMEM混合，注入细胞培养板中。
室温放臵直至琼脂糖凝固，或于4℃冰箱放臵几
分钟至琼脂糖凝固，然后于37℃ 5% CO2培养箱
获得高滴度的病毒，扩大培养后作种用。
• 筛选重组病毒：收集病变的细胞或病毒悬液，
通过PCR或其它方法进行鉴定，取阳性者再作下 一轮空斑纯化。如此3-5轮空斑纯化后即可得到 纯化的病毒粒子。
噬斑技术的应用： 用于病毒纯化：挑选病毒的克隆株 测定病毒悬液中感染病毒的含量
噬斑形成单位（plaque forming unit, PFU ） 概念：
逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法
TCID50的计算方法
Calculation of TCID50
• Use of Reed & Muench method (if 50 ul of virus dilution is added to each well)
病毒感染力的滴定
测定病毒感染力的方法:
半数致死量LD50（50% lethal dose）
半数鸡胚感染量EID50 (egg 50% infective dose)
半数细胞培养物感染量TCID50（tissue culture
50% infective dose) 蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）
Reed-Muench两氏法
病毒液 稀释度 CPE孔数 无CPE 孔数 累 计 出现CPE孔 所占的% CPE孔数 无CPE孔数
10-1
10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
8
8 7 3 1
0
0 1 5 7
27
19 11 4 1
0
0 1 6 13
100（27/27）
100（19/19） 91.6 （11/12） 40（4/10） 0.7（1/14）
毒所形成的空斑数，然后根据公式计算PFU。
如果是作病毒纯化
•挑取空斑于200μL维持液中，反复冻融3次，接
种于PK-15细胞已长成单层的24孔细胞培养板，
再于37℃ 5% CO2培养箱培养至完全发生病变。
• 一般的毒种纯化：收集病变的细胞悬液，测定
TCID50，然后选TCID50较高者再作几轮空斑纯化，
继续培养。 每天于显微镜下观察细胞病变情况。 出现空斑后（2-3天），用含钙、镁的PBS将 0.1%的中性红贮存液10倍稀释后滴加到细胞培 养板上。 于37℃ 5% CO2培养箱中作用1h，吸弃染液，继
续于温箱中培养2-3h。
TK-突变株与野毒形成的空斑的比较
如果是测定PFU，则直接记取一定稀释度的病
10 -6
0
8
0
21
0（0/21）
距离比例＝（高于50%病变率的百分数 -50%）/（高于 50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数） ＝（91.6-50）/（91.6-40） ＝ 0.8
lgTCID50= 距离此例×稀释度对数之间的差 + 高于 50%病变率的稀释度的对数 =0.8×(-1)+(-3) =-3.8 TCID50=10-3.8／0.1ml
Karber法 病毒液稀释度
10-1
出现CPE孔的比率
8/8=1
10-2
10-3
8/8=1
7/8=0.875
10-4
10-5
3/8=0.375
1/8=0.125
10-6
0/8=0
lgTCID50=L-d(s-0.5) L: 最高稀释度的对数 D：稀释度对数之间的差 S：阳性孔比率总和 lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5) =-3.875 TCID50=10-3.875/0.1ml
限性的病灶。
plaques
Procedures
操作步骤
将敏感细胞在平皿或6孔板内培养成单层 吸弃培养液。
用维持液将病毒液作连续10倍的稀释，选择适当稀 释度的病毒悬液接种培养孔内的单层细胞，接种量 约为原培养液的1/10-1/5，以覆盖住细胞单层为宜， 每个稀释度接种2-3孔。