病毒感染力的滴定

二、病毒蚀斑技术 病毒蚀斑（plaque) 又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形
成的局限性病灶。
原理：适当稀释的病毒悬液接种经长成单层的敏感
细胞后，在覆盖的固体或半固体介质（琼脂糖、甲基 纤维素）的作用下，病毒在最初感染的细胞内增殖后， 只能进而感染并破坏临近的细胞，经过几个增殖周期 后，形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区，即局
每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即病毒悬液
中的感染性病毒浓度。 计算方法： 如用PRV接种PK-15细胞，每孔接种了0.4ml，结 果10-5孔形成了208个空斑，而10-6孔形成了22个空斑，
则该病毒在PK-15细胞上的空斑形成单位（PFU）为：
22×106/0.4ml=5.5×107个/ml。
一、病毒TCID50的测定 操作步骤
在青霉素瓶中将病毒作连续 10倍的稀释，从10-1-
10-10。
将稀释好的病毒接种到 96孔微量培养板中，每一
稀释度作8孔，每孔接种100µ l。
在每孔加入细胞悬液100µ l，使细胞量达到3×105 个/ml。
设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
将培养板臵37℃ 5% CO2培养箱吸附1h，吸弃病毒液， 用含钙、镁的PBS（pH7.4）洗3次。 取1.6%-2%的低熔点琼脂糖，融化后降温至38-42℃，
与等量预热至38-42℃含6%-10%犊牛血清的无酚红
DMEM混合，注入细胞培养板中。
室温放臵直至琼脂糖凝固，或于4℃冰箱放臵几
分钟至琼脂糖凝固，然后于37℃ 5% CO2培养箱
获得高滴度的病毒，扩大培养后作种用。
• 筛选重组病毒：收集病变的细胞或病毒悬液，
通过PCR或其它方法进行鉴定，取阳性者再作下 一轮空斑纯化。如此3-5轮空斑纯化后即可得到 纯化的病毒粒子。
噬斑技术的应用： 用于病毒纯化：挑选病毒的克隆株 测定病毒悬液中感染病毒的含量
噬斑形成单位（plaque forming unit, PFU ） 概念：
逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法
TCID50的计算方法
Calculation of TCID50
• Use of Reed & Muench method (if 50 ul of virus dilution is added to each well)
病毒感染力的滴定
测定病毒感染力的方法:
半数致死量LD50（50% lethal dose）
半数鸡胚感染量EID50 (egg 50% infective dose)
半数细胞培养物感染量TCID50（tissue culture
50% infective dose) 蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）
Reed-Muench两氏法
病毒液 稀释度 CPE孔数 无CPE 孔数 累 计 出现CPE孔 所占的% CPE孔数 无CPE孔数
10-1
10 -2 10 -3 10 -4 10 -5
8
8 7 3 1
0
0 1 5 7
27
19 11 4 1
0
0 1 6 13
100（27/27）
100（19/19） 91.6 （11/12） 40（4/10） 0.7（1/14）
毒所形成的空斑数，然后根据公式计算PFU。
如果是作病毒纯化
•挑取空斑于200μL维持液中，反复冻融3次，接
种于PK-15细胞已长成单层的24孔细胞培养板，
再于37℃ 5% CO2培养箱培养至完全发生病变。
• 一般的毒种纯化：收集病变的细胞悬液，测定
TCID50，然后选TCID50较高者再作几轮空斑纯化，
继续培养。 每天于显微镜下观察细胞病变情况。 出现空斑后（2-3天），用含钙、镁的PBS将 0.1%的中性红贮存液10倍稀释后滴加到细胞培 养板上。 于37℃ 5% CO2培养箱中作用1h，吸弃染液，继
续于温箱中培养2-3h。
TK-突变株与野毒形成的空斑的比较
如果是测定PFU，则直接记取一定稀释度的病
10 -6
0
8
0
21
0（0/21）
距离比例＝（高于50%病变率的百分数 -50%）/（高于 50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数） ＝（91.6-50）/（91.6-40） ＝ 0.8
lgTCID50= 距离此例×稀释度对数之间的差 + 高于 50%病变率的稀释度的对数 =0.8×(-1)+(-3) =-3.8 TCID50=10-3.8／0.1ml
Karber法 病毒液稀释度
10-1
出现CPE孔的比率
8/8=1
10-2
10-3
8/8=1
7/8=0.875
10-4
10-5
3/8=0.375
1/8=0.125
10-6
0/8=0
lgTCID50=L-d(s-0.5) L: 最高稀释度的对数 D：稀释度对数之间的差 S：阳性孔比率总和 lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5) =-3.875 TCID50=10-3.875/0.1ml
限性的病灶。
plaques
Procedures
操作步骤
将敏感细胞在平皿或6孔板内培养成单层 吸弃培养液。
用维持液将病毒液作连续10倍的稀释，选择适当稀 释度的病毒悬液接种培养孔内的单层细胞，接种量 约为原培养液的1/10-1/5，以覆盖住细胞单层为宜， 每个稀释度接种2-3孔。