离子交换柱层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸一、前言1、分离氨基酸的主要方法：(1) 离子交换法，根据氨基酸是两性电解质这一特征,以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值的差异,利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯化。
离子交换法的分离步骤主要包括树脂的处理、装柱、平衡、加样、洗脱等步骤. 离子交换法也有自身的局限性，由于离子交换法是利用氨基酸等电点的不同，所以当两个或者多个氨基酸的等电点相近时，便无法分离，另外，氨基酸在树脂当中扩散速度较快，就要求料液的流速也相对较慢，这样自然造成了分离的缓慢，离子交换本身的生产原理也决定了反应难以连续还进行，这给工厂自动化生产带来影响，难以大规模地推广。
(2) 沉淀法，沉淀法是历史最悠久的分离纯化方法，目前仍在工业上发挥着重大的作用。
氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。
沉淀法原理是根据某些氨基酸可以与某些有机或者无机化合物结合而形成沉淀，可以利用这种性质向溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸沉淀，与其他氨基酸分离，在分离后再将氨基酸与沉淀剂分离即可。
现在较为成熟的分离方法有精氨酸与苯甲醛在低温条件下，缩合成溶解度小的苯亚甲基精氨酸，从而析出沉淀，析出的沉淀用盐酸处理即可分离得到目标氨基酸精氨酸的盐酸盐；亮氨酸与邻-二甲苯-4-磺酸反应，可生成亮氨酸的磺酸盐。
沉淀法的优点是方法简单，选择性强，但是缺点同样明显，沉淀剂回收困难，造成废液排放污染加剧。
(3) 萃取法，萃取法主要包括反应萃取法、溶剂萃取法、反向微胶团萃取、液膜萃取法等。
其中，反应萃取法是选择适当的萃取剂，使萃取剂解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应，生成可以溶于有机相的物质，从而使氨基酸从水相进入有机相，进而分离氨基酸。
溶剂萃取法，由于氨基酸是离子型化合物，氨基酸在物理萃取时难以高效提取的，因此常用化学发来萃取氨基酸。
(5) 电透析，由于氨基酸拥有不同的等电点，故可以通过控制溶液的PH值，使氨基酸带有正负电荷，即当PH大于等电点时，带有负电荷，将氨基酸放置在电场中，会带上负电，并且移向正极，相反，PH值小于等电点时，则带上正电荷，氨基酸向负极移动。
离子交换柱层析法分离氨基酸(共19张PPT)
试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。
值）。以光吸收值为纵坐标，以洗脱体积为横坐 调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其流速，反复调整测量直到流速约为1mL/min。
全部加在某一局限部位。
注意：平衡、加样、洗脱时都不能冲破树 脂表面
加样示意图
6.洗脱并收集:
将体积均70mL（建议适量多加）离子强度为 与的两种缓冲溶液分别加入到梯度混合器的两个 烧杯中。其中的加入到直接输出溶液的那个池， 如图
将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。
同时开始用部分收集器开始收集洗脱液，管×50。
3、装柱
干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。
将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度， 一个同学一手手同学控制洗瓶加水的速度以及水流出的速度
注意：
1、装柱过程不可中断，倒树脂要缓慢均匀
2、刚开始倒树脂时，水流出速度要控制到很 小，同时可以适当多加点水。最后一段加水和放 水都要慢，装柱过程中水面一定不能低于树脂， 但也不能溢出。
18cm
端倒 面好 高平 的 整层 ，析 无管 气 泡 ， 约
4．平衡：
将层析管与恒流泵联接，从烧杯中吸取钠 离子强度为的柠檬酸缓冲液平衡层析柱，流出 液达床体积的四倍以上时，用pH试纸测流出的 液体的pH，直到和缓冲液的pH一样时（即试管
内的pH和缓冲液一样）即可上样。在平衡同时 进行调速：
调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流 出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其
离子交换柱层析原理
离子交换层析介质的应用离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。
现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。
子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
1.离子交换层析的基本原理：离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。
离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。
几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。
由于离子交换层析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元，也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。
目前，在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。
2.离子交换层析介质：离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。
离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。
电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。
平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。
平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。
离子交换柱层析操作
离子交换柱层析操作离子交换柱层析在生物分离和纯化中广泛应用，包括蛋白质分离和纯化。
蛋白质通常具有带电的氨基酸残基，可以与柱子上的离子交换基团发生静电相互作用。
在离子交换柱层析中，通过调节溶液的pH值和离子浓度，可以控制蛋白质与柱子上的离子交换基团之间的相互作用，从而实现蛋白质的选择性吸附和洗脱。
1.离子交换柱的选择：根据所要分离的目标分子的特性选择合适的离子交换柱。
离子交换柱可以根据其固定相的性质分为阴离子交换柱和阳离子交换柱，根据离子交换基团的类型分为疏水基团和孔隙基团等。
2.样品预处理：将待分离的样品进行预处理，包括清除杂质、富集目标分子等步骤，以获得较高的纯度和回收率。
3.样品加载：将预处理过的样品溶液加载到离子交换柱上。
样品溶液中的目标分子与离子交换基团之间发生静电相互作用，被柱子上的固定相吸附。
4.柱洗脱：通过调节洗脱缓冲液的pH值、离子浓度或盐浓度等条件，改变目标分子与离子交换基团之间的相互作用，使其从柱子上洗脱下来。
5.纯化目标分子：将洗脱得到的目标分子进一步纯化和收集，可以通过再次进行柱层析、凝胶过滤、电泳等方法进行。
离子交换柱层析操作对于蛋白质的纯化十分重要。
在蛋白质纯化中，可以根据蛋白质的等电点和溶液的pH值选择合适的离子交换柱，实现对特定蛋白质的选择性吸附和洗脱。
通过优化离子交换柱层析操作的条件，可以获得较高纯度和产量的蛋白质。
总结起来，离子交换柱层析操作是一种常用的用于生物分离和纯化的方法。
它利用样品中带电的离子与柱子上的离子交换基团之间的相互作用，实现对生物分子的选择性吸附和洗脱。
离子交换柱层析对于蛋白质的纯化具有重要意义，可以通过调节柱层析条件实现对特定蛋白质的纯化和富集。
离子交换柱层析操作是一种非常有用和广泛应用的生物分离技术。
离子交换柱层析法分离氨基酸
离子交换柱层析法分离氨基酸【目的要求】1．学习离子交换树脂分离氨基酸的基本原理；2．掌握离子交换柱层析的基本操作；3．掌握氨基酸和茚三酮显色机理。
【实验原理】一、离子交换层析原理离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离目的的方法。
有些高分子物质含有一些可以解离的基团，例如错误！未找到引用源。
，错误！未找到引用源。
等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应，如：或这类高分子物质统称为离子交换剂，离子交换剂是一类具有离子交换功能的高分子材料。
功能基团由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动离子两部分组成，二者所带电荷相反，以静电作用结合。
可进行交换的离子称为反离子或抗衡离子，这种反离子可与溶液中带同种电荷的离子进行交换反应。
因离子交换反应是可逆的，在一定条件下被交换的离子也可以“解吸”，使离子交换剂又恢复到原来的离子形式，所以离子交换剂通过交换和再生可以反复使用。
其中使用的最普遍的是离子交换树脂。
由于一定离子交换剂对于不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后完全分离。
选择适当的条件，可使一些溶质分子变成离子态，通过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质则不能被交换，这两类物质即可被分离。
带同种电荷的不同离子都可以结合到同一介质上，但由于各自所带电量不同，与介质的结合牢度不同，可改变洗脱条件使它们依次先后被洗脱，从而达到分离目的。
离子交换层析是一种基于氨基酸电荷行为的层析方法。
本实验采用磺酸型阳离子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI2.97）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI9.74）的混合液。
氨基酸是两性电解质，分子上所带的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值。
在pH5.3条件下，因为pH值低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。
在pH12条件下，因pH值高于Lys的pI值Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。
离子交换树脂层析分离混合氨基酸
实验二离子交换树脂层析分离混合氨基酸【实验目的】1. 了解离子交换树脂层析的工作原理及操作技术。
2. 学会用离子交换树脂层析法分离混合氨基酸。
【实验原理】离子交换树脂是一种合成的高聚物,不溶于水,能吸水膨胀。
高聚物分子由能电离的性基团及非极性的树脂组成。
极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用,而非极性的树脂本身物性不变。
通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸(=R=S03H)、弱(=COOH)、强碱(=N+=R:)和弱碱(=NH2=NHR=NR2)。
离子交换树脂分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。
但对生物大于物质如蛋白质是不适当的,因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。
故如分离生物大子、可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。
本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)碱性氨基酸(赖氨酸)的混合液。
在特定的pH条件下,它们解离程度不同,通过改变脱液的pH 或离子强度可分别洗脱分离。
【实验材料】1.实验器材层析柱(1.6X20cm);恒流泵;梯度混合器;试管及试管架;紫外分光光度计、磺酸阳离子交换树脂(Dowex 50)2.实验试剂(1)2mol/L HCl(2)2mol/L NaOH(3)0.1mOl/L HCl(4)0.1mol/L NaOH(5)pH4.2的柠檬酸缓冲液:0.lmol/L柠檬酸54m1加0.1mol/L柠檬酸钠46ml(6)pH5的醋酸缓冲液:0.2mol/L NaAc 70ml加0.2mol/L HAc 30ml(7)0.2%中性茚三酮溶液:0.2g茚三酮加100ml丙酮(8)氨基酸混合液:丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸各10m1加0.1mol/L HCl 3m【实验方法】1. 树脂的处理100ml烧杯中置约10g树脂,加25ml 12mo1/L HCl搅拌2h,倾弃酸液,用蒸馏水充洗涤树脂至中性。
加25ml 12mol/L NaOH至上述树脂中搅拌2h,倾弃碱液,用蒸馏水洗涤至中性。
学习指南5 离子交换柱层析法分离氨基酸
离子交换柱层析法分离氨基酸——学习指南l 学习重点 1. 学习离子交换柱层析技术的基本原理和操作。
2. 掌握根据分离对象的性质差异进行实验条件的选择和设计。
l 知识要点1. 树脂：惰性的不溶高分子化合物。
根据树脂修饰的功能基团的性质差异，可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。
阳离子交换树脂：功能基团是酸性的，其可解离的H ＋离子可与溶液相中的其它阳离子发生交换作用。
阴离子交换树脂：功能基团是碱性的，其可解离的OH －离子可与溶液相中的其它阴离子发生交换作用。
2. 离子交换柱层析法分离氨基酸：不同氨基酸的等电点不同，在同一缓冲液中，不同氨基酸所带电荷的性质和数量具有差异，与离子交换树脂的亲和力不同。
因此，不同的氨基酸会在洗脱的过程中先后流出层析柱，达到分离的目的。
3. 茚三酮法：在加热条件及弱酸环境下，氨基酸与茚三酮反应生成紫蓝色化合物（脯氨酸、羟脯氨酸反应生成黄色化合物），最大检测波长在570nm 处。
l 试剂 1. 阳离子交换树脂（Amberlite IR-120）。
2. 0.45mol/L pH5.3柠檬酸缓冲液。
3. 氨基酸样品：0.005mol/L 的Asp 和Lys （用0.02mol/L HCl 配制）。
4. 0.5%茚三酮溶液。
5. 0.1% CuSO 4溶液。
l 仪器层析柱、层析柱支架台、螺旋夹、恒流泵、旋涡混合仪、电磁炉、电磁炉锅、紫外可见分光光度计l 操作l 注意事项 1. 新鲜树脂通过预处理，可去除树脂生产过程中残留的溶剂、低聚物及少量的重金属离子等杂质。
2. 树脂预处理后的保存液与洗脱液不同，因此需预先平衡，以保证分离体系已经全部替换成洗脱液。
一般来说，需2~3倍柱床体积完成平衡。
3. 装柱时应注意液面不能低于树脂表面，加入树脂的速度不能太快，以免产生气泡。
4. 加样时应避免冲坏树脂表面，注意不能将样品全部加在某一局限部位。
氨基酸的分离原理
氨基酸的分离原理
氨基酸的分离原理主要是基于它们在不同条件下的溶解性、酸碱性和极性的差异。
以下是常用的氨基酸分离方法：
1. 薄层层析法：将氨基酸溶液均匀涂布在薄层层析板上，通过上机进行高效层析分离。
根据氨基酸在固定相和流动相中的相互作用力的不同，氨基酸在薄层上的迁移距离也不同，从而实现分离。
2. 离子交换色谱法：利用带电的树脂固定相对氨基酸进行分离。
树脂可以选择正离子交换树脂或阴离子交换树脂，根据氨基酸的酸碱性质进行选择。
溶液中的氨基酸通过与固定相发生离子交换，从而实现分离。
3. 气相色谱法：利用气相色谱仪将氨基酸蒸发后送入色谱柱进行分离。
根据氨基酸在固定相和载气中的分配系数不同，氨基酸在色谱柱中的保留时间也不同，从而实现分离。
4. 高效液相色谱法：利用高效液相色谱仪将氨基酸在流动相中进行分离。
根据氨基酸与固定相之间的亲疏水性差异，通过调节流动相组成及流速，实现氨基酸的分离。
综上所述，氨基酸的分离原理主要是利用它们在不同条件下的物理化学性质的差异，通过各种色谱方法实现分离。
离子交换柱层析原理
离子交换层析介质得应用离子交换层析分离纯化生物大分子得过程,主要就是利用各种分子得可离解性、离子得净电荷、表面电荷分布得电性差异而进行选择分离得。
现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁得纯化技术之一。
离子交换层析(IｏｎExcｈａnｇｅChromatｏgraphｙ简称为IＥC)就是以离子交换剂为固定相,依据流动相中得组分离子与交换剂上得平衡离子进行可逆交换时得结合力大小得差别而进行分离得一种层析方法。
离子交换层析就是目前生物化学领域中常用得一种层析方法,广泛得应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等得分离纯化。
1、离子交换层析得基本原理:ﻫ离子交换层析就是通过带电得溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化得方法,也可以认为就是蛋白质分子中带电得氨基酸与带相反电荷得介质得骨架相互作用而达到分离纯化得方法。
离子交换层析法主要依赖电荷间得相互作用,利用带电分子中电荷得微小差异而进行分离,具有较高得分离容量。
几乎所有得生物大分子都就是极性得,都可使其带电,所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子得分离、中等纯化及精制得各个步骤中。
由于离子交换层析法分辨率高,工作容量大,并容易操作,因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立得操作单元,也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化得一种重要得方法。
目前,在生化分离中约有75%得工艺采用离子交换层析法。
2、离子交换层析介质:离子交换层析得固定相就是离子交换剂,它就是由一类不溶于水得惰性高分子聚合物基质通过一定得化学反应共价结合上某种电荷基团形成得。
离子交换剂可以分为三部分:高分子聚合物基质、电荷基团与平衡离子。
电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电得可进行离子交换得基团。
平衡离子就是结合于电荷基团上得相反离子,它能与溶液中其它得离子基团发生可逆得交换反应。
平衡离子带正电得离子交换剂能与带正电得离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂;平衡离子带负电得离子交换剂与带负电得离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。
离子交换层析分离氨基酸
离子交换层析分离氨基酸[目的]1．熟悉离子交换层析技术的基本原理和方法2．熟悉离子交换层析分离氨基酸的基本原理和操作[原理]氨基酸是两性电解质，不同的氨基酸有其特定的等电点，在溶液pH小于其pI值时带正电，大于其pI时带负电。
故在一定的pH条件下，各种氨基酸的带电情况不同，与离子交换剂上的交换基团的亲和力亦不同。
因而得到分离。
本实验选用Dowex 50作为离子交换剂，它是含磺酸基团的强酸型阳离子交换剂，分离的样品为Asp、Gly、His三种氨基酸的混合液，这三种氨基酸分别属于酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸，它们在pH4.2的缓冲液中分别带负电荷和不同量的正电荷，与Dowex 50的磺酸基团之间的亲和力不同，因此被洗脱下来的顺序亦不同，可以将三种不同的氨基酸分离开来，将各收集管分别用茚三酮显色鉴定。
[操作]1．装柱前准备：用流水冲洗层析柱、然后用蒸馏水冲洗，柱流水口装上橡皮管放入2-3ml蒸馏水，按压橡皮管内气泡，抬高流出管防止蒸馏水排空。
2．装柱：将处理好的Dowex 50悬液小心倒入层析柱内，待Dowex 50自然下沉至柱下部时，打开下端放出液体，再慢慢加入悬液至Dowex 50沉积面离层析柱上缘约3cm 时停止。
装柱时注意防止液面低于交换树脂平面以及气泡的产生。
3．平衡：用pH4.2的柠檬酸钠缓冲液反复加在柱床上面，平衡10分钟，最后接通蠕动泵，调节流速1ml/min。
4．加样：柱内缓冲液的液面与树脂平面相平，但勿使树脂露出液面，马上用滴管加7滴样品在树脂平面上（注意不能使树脂平面破坏），然后加少量缓冲液使样品进入柱内，反复两次，当样品完全进入树脂床后，接通蠕动泵，用PH4.2的柠檬酸钠缓冲液洗脱，分步收集器收集。
5.收集与检测：取12支试管编号，每管加入茚三酮显色液20滴，依次收集洗脱液每管2m1，混匀，置沸水浴15分钟取出，观色，用自来水冷却后在波长570mm处比色、当收集至第二洗脱峰刚出现时，(茚三酮显色)即换用0.1N NaOH溶液洗脱直至第三洗脱峰出现后，停止洗脱。
离子交换法分离提纯氨基酸
精品整理
离子交换法分离提纯氨基酸
氨基酸是蛋白质组成的基本单元，氨基酸在国民经济尤其是医药方面尤为重要，分离纯化氨基酸的技术就成了医药领域重要的技术。
氨基酸的分离提纯方法主要有沉淀法、离子交换法、萃取法、电渗析等。
其中，常用的是离子交换法。
离子交换法，根据氨基酸是两性电解质这一特征，以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值的差异，利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯化。
离子交换法应用广泛，如味精厂采用强酸性阳离子交换树脂对L-谷氨酸阳离子进行选择性吸附，使发酵液中影响L-谷氨酸晶的杂质得以分离，某采用逆流多级交换，大大减少了树脂用量和洗涤树脂用水量；732阳离子交换树脂可用来分离纯化L-苯丙氨酸；分离纯化L - 谷氨酰胺基本上都采用阴阳双柱离子交换法；将胱氨酸发酵液通过732阳离子交换柱分离出精氨酸、组氨酸和赖氨酸；采用离子交换热参数泵从水解液和制革废水中浓缩分离氨基酸；采用强酸性阳离子交换树脂从发酵液中吸附L-赖氨酸等等的方法。
离子交换层析法分离氨基酸
3.平衡、加样
用pH5.8的柠檬酸缓冲液冲洗平衡交换柱。调节流速为 1mL/min，流出液达到床体积的2-3倍时即可上样。 由柱上端仔细加入氨基酸的混合液0.5mL，同时开始收集流 出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入0.5mL柠檬酸 缓冲液冲洗加样品处。待缓冲液弯月面靠近树脂顶端时，再加入 0.5mL缓冲液。如此重复两次，
各种氨基酸分子的等电点不同在同一ph时所带电荷不同与离子交换树脂的结合力有差异因此可依据结合力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来达到分离的效果
实验三 离子交换层析法分离氨基酸
【实验目的】
（1）学习采用离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。 （2）掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。
【实验原理】
离子交换层析法主要是利用溶液中各种来自电离子与离子交苯乙烯磺酸钠型树脂（强酸1×8，100—200目）。 2mol/L盐酸溶液；2mol/L氢氧化钠溶液。 混合氨基酸溶液：天冬氨酸、赖氨酸溶液。 柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液（pH5.8，钠离子浓 度0.45mol/L） 显色剂（茚三酮溶液）
12cm×1cm层析管; 蠕动泵; 部分收集器；烘箱。
【实验步骤】 1.树脂的处理 ：碱-酸-碱
H+或Na+
SO3—
—CH2—CH2—CH—CH2—CH2—CH—
有氢型和钠型
—CH —CH2—CH2—CH— 苯环—SO3— H+或Na+
从交换剂上洗脱目的物的方法有两种： 1.调节洗脱液的pH，使目的物在此pH下 失去电荷甚至带相反电荷。
2.用高浓度的同性离子，将目的离子取代 下来。
【试剂和器材】
4.洗脱
并将柱与蠕动泵想和部分收集器相连。开始用试管收集洗脱液， 每管收集1mL，共收集40—50管。
离子交换柱交换层析法分离氨基酸知识讲解
离子交换柱交换层析法分离氨基酸离子交换柱层析法分离氨基酸一、实验原理离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力（静电引力）而达到分离目的的分离技术。
离子交换层析的固定相是离子交换剂，流动相是具有一定pH和离子强度的电解质溶液。
树脂（惰性支持物）上结合了阳离子或阴离子后，可与阴离子或阳离子结合，改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离。
由于不同的氨基酸在不同的pH值和离子强度溶液中的所带电荷各不相同，故对离子交换树脂的亲和力也各不相同。
从而可以在洗脱过程中按先后次序洗出，达到分离的目的。
带电荷量少，与交换剂亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量大，与交换剂亲和力大的后被洗脱下来。
本次实验采用的是Amberlite IR-120阳离子交换树脂作为离子交换剂，分离的样品为Asp和Lys两种氨基酸的混合液。
在一定的pH下，Asp和Lys的带电情况不同，与磺酸集团的亲和力不同，因此被洗脱下来的次序不一样。
将各收集管分别用茚三酮显色后，测定吸光度，从而得到洗脱曲线。
二、实验器材实验仪器：层析柱、恒流泵、试管*30、吸管、移液枪、烧杯、紫外分光光度计实验试剂：Amberlite IR-120阳离子交换树脂、柠檬酸缓冲液（pH5.3）、0.5%茚三酮、0.1%CuSO4、氨基酸样品（0.005mol/L的Asp和Lys，用0.02mol/L的HCl配制）三、实验操作记录1、树脂的处理干树脂经蒸馏水膨胀，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol/L HCl及2mol/L NaOH依次浸洗，每次浸2h，并分别用蒸馏水洗至中性。
再用1mol/L NaOH浸半小时（转型），用蒸馏水洗至中性。
2、装柱前的准备选择直径1cm，长度15~20cm的层析柱，观察柱底端滤膜是否完好，分别用流水和蒸馏水冲洗干净。
将层析柱垂直装在铁架台上，柱进水口和出水口装上橡皮管，关闭柱底端出口，在柱内注入少许（约1cm高）的洗脱液，打开出水口，排净管内空气后关闭出水口。
氨基酸分离的主要技术及原理
氨基酸分离的主要技术及原理林锦池董越范雪雪摘要：本文对氨基酸分离提纯常用的沉淀法、离子交换法、萃取法、吸附法、毛细电渗析法、膜分离法以及结晶法等方法的技术原理及研究进行较全面的总结。
1 沉淀法沉淀法是最古老的分离、纯化方法，目前仍广泛应用在工业上和实验室中。
它是利用某种沉淀剂使所需要提取的物质在溶液中的溶解度降低而形成沉淀的过程。
该方法具有简单、方便、经济和浓缩倍数高的优点。
氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。
1．1 利用氨基酸的溶解度分离或等电点沉淀法在生产中常利用各种氨基酸在水和乙醇等溶剂中溶解度的差异，将氨基酸彼此分离。
如胱氨酸和酪氨酸在水中极难溶解，而其它氨基酸则比较易溶；酪氨酸在热水中溶解度大，而胱氨酸则无大差别。
根据此性质，即可把它们分离出来，并且互相分开。
另外，可以利用氨基酸的两性解离有等电点的性质。
由于氨基酸在等电点时溶解度最小，最容易析出沉淀，所以利用溶解度法分离氨基酸时，也常结合等电点沉淀法。
1．2特殊试剂沉淀法某些氨基酸可以与一些有机或无机化合物结合，形成结晶性衍生物沉淀，利用这种性质向混合氨基酸溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸与沉淀剂沉淀下来，达到与其它氨基酸分离的目的。
较为成熟的工艺有：缬氨酸与苯甲醛在碱性和低温条件下，可缩合成溶解度很小的苯亚甲基精氨酸，分离这种沉淀，用盐酸水解除去苯甲醛，即可得精氨酸盐酸盐；亮氨酸与邻一二甲苯一4一磺酸反应，生成亮氨酸的磺酸盐，后者与氨水反应得到亮氨酸；组氨酸与氯化汞作用生成组氨酸汞盐的沉淀，再经处理就可得到组氨酸。
特殊试剂沉淀法虽然操作简单、选择性强，但是由于沉淀剂回收困难，废液排放污染严重，残留沉淀剂的毒性等原因已逐渐被它方法取代。
工业应用举例：选择性沉淀分离亮氨酸、精氨酸的方法该方法包括下述步骤：将二氯苯磺酸加入到毛发酸水解液中，所述二氯苯磺酸和所述水解液之间的重量/体积比为二氯苯磺酸∶水解液＝1∶5～20；搅拌所述毛发酸水解液；将生成的亮氨酸沉淀物进行分离以获取亮氨酸。
氨基酸的分离提纯
氨基酸的分离提纯刘艳梅周关华(东华大学环境科学与工程学院上海200051)摘要国内外氨基酸分离与提纯的发展研究现状及其在生产实践中的应用。
关键词氨基酸分离提纯应用氨基酸及其衍生物是组成蛋白质的基本单元，广泛用于医药、食品、饲料、化妆品工业等领域。
例如，在食品加工和饲料工业，L-谷氨酸一钠可作为增鲜剂，L一天冬氨酸、甘氨酸和DI，-丙氨酸等也用作食品风味改良剂，另外，L一天冬酰苯丙氨酸甲酯作为低热量甜味剂fAspartame)，在国外已广泛应用于饮料等食品。
L-赖氨酸和DL蛋氨酸广泛应用于改进饲料成份的营养价值。
I，-赖氨酸还用于强化面粉和强化米的生产。
在医药卫生方面，除了大量应用结晶氨基酸输液外，某些氨基酸及其类似物也被用于治疗某些疾病。
例如L-多巴[L一3一(3，4一二轻基苯基)丙氨酸】是治疗帕金森氏病的重要药物，而仅一甲基一多巴为有用的降压药物。
L一谷酰胺及衍生物用于治疗胃溃疡，L_色氨酸和5一羟基一L一色氨酸是有效的抗抑郁剂。
另外某些氨基酸衍生物具有抗肿瘤的作用。
一些肽类例如催产素，血管紧张肽和促胃液激素等，它们具有医疗效果的激素效应。
氨基酸聚合物，例如聚一一甲基一谷氨酸已被用作人造革的原料。
总之，氨基酸及其衍生物将会随着科学研究和工业生产的发展，而被更加广泛地应用【l】。
然而，国内氨基酸的生产远不能满足其需求。
1氨基酸的性质氨基酸是一种具有两性官能团的物质。
氨基酸分子既含有氨基又含有羧基，在溶液中主要以一NH，，一COO一形式存在。
氨基和羧基的电离取决于溶液的pH值和氨基酸的等电点PI：在pH低于等电点P1时，羧基的电离被抑制，氨基酸带正电荷；在pH值高于等电点Pl时，氨基的电离被抑制而带负电荷。
在等电点时，氨基酸的溶解度最小，最易从溶液中析出。
按照侧链基团的不同，氨基酸可以分为3类：酸性氨基酸，中性氨基酸，和碱性氨基酸。
而各种氨基酸的等电点不同，酸性氨基酸<中性氨基酸<碱性氨基酸。
211216232_氨基酸分析仪检出限以及分离度不确定的评定
2023年第2期品牌与标准化氨基酸分析仪是一款广泛应用于食品科学、农业环境、生物化学、医疗卫生及化工领域的分析仪器[1-2]。
氨基酸分析仪的基本原理为：试样经过前处理去蛋白之后，样液经离子交换柱层析分离，被分离出的氨基酸通过柱后衍生与茚三酮溶液反应显色，用紫外检测器检测，外标法定量[3-4]。
检出限是评价分析方法的重要指标，一般分为仪器检出限、分析方法检出限。
仪器检出限是指分析仪器能区分噪声的最低检出浓度的能力，而方法检出限不但与仪器噪声有关，还与方法全部流程的各个环节相关。
目前，研究方法检出限的较多，但较少有针对仪器检出限不确定度进行评定的方法。
为正确评估仪器检出限，本文将针对氨基酸分析仪进行仪器检出限不确定度的评定，为检出限不确定度评定提供解决方案。
分离度是氨基酸分析仪判断待测物质在色谱柱中分离情况的另一个重要指标。
氨基酸分析仪的分离度是指峰高分离度。
本文通过结合分离度和仪器检出限的不确定度分析，对氨基酸分析仪的性能水平作出准确评价。
1材料与方法1.1材料与仪器17种氨基酸混合标准溶液：浓度约为1mmol/L ，扩展不确定度为0.02~0.04mmol/L （k =2），中国计量科学研究院生产；电子天平：Ⅰ级，感量为0.1mg ，METTLER TOLEDO 公司；L-8900型氨基酸分析仪：日立公司；游标卡尺：测量范围为0~150mm ，最小分度0.02mm ，检定的不确定度为0.04mm ，k =2，桂林广陆数字测控股份有限公司；容量瓶：100mL/250mL/1000mL ，A 级。
Evaluation of Uncertainty ofDetection Lmit and Resolution of Amino Acid AnalyzerTONG Junting（Liaoning Institute of Measurement ，Shenyang 110004，China ）Abstract ：In this paper ，the mixed standard substance of amino acid is used to evaluate the uncertainty of detection limit and resolution of amino acid analyzer.The results show that the expanded relative uncertainty of the detection limit is 9.6%.Through uncertainty analysis ，the fluctuation of baseline noise has the greatest impact on the detection limit of the instrument.Reducing baseline noise can effectively improve the detection limit of the instrument.The expanded relative uncertainty of degree of separation is 6.1%.Through uncertainty analysis ，the uncertainty of reference materials and concentration of the analytes has the greatest impact on the degree of separation.Appropriately increasing the concentration of the analytes within the linear range of the instrument can effectively improve the degree of separation of the instrument.Key words ：amino acid analyzer ；evaluation of uncertainty ；detection limit ；degree of separation氨基酸分析仪检出限以及分离度不确定的评定佟俊婷（辽宁省计量科学研究院，辽宁沈阳110004）【摘要】本文使用氨基酸混合标准物质，对氨基酸分析仪检出限以及分离度进行不确定度评定。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
树脂对离子的亲和力，与水合离子半径、 电荷及离子的极化程度有关。水合离子半径 愈小、电荷愈高、极化程度愈大，则它的亲 和力愈大。其中静电力起主要作用。 在ph=5.8 的缓冲液中，在阳离子柱中氨基 酸洗出的大体顺序为酸性、中性、碱性。本 试验所用氨基酸中，Asp(天冬氨酸)是酸性氨 基酸，pI=2.97;Lys(赖氨酸）是碱性氨基酸， pI=9.74。 茚三酮跟蛋白质或者多肽在加热条件下发 生紫色反应
端 面 高平 整 ， 无 气 泡 ， 约 18cm
倒 好 的 层 析 管
4．平衡： 将层析管与恒流泵联接，从烧杯中吸取 pH=5.8钠离子强度为0.45的柠檬酸缓冲液平 衡层析柱，流出液达床体积的四倍以上时， 用pH试纸测流出的液体的pH，直到和缓冲液 的pH一样时（即试管内的pH和缓冲液一样） 即可上样。在平衡同时进行调速： 调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量 流出液的体积，根据流出液体积与所需时间 计算其流速，反复调整测量直到流速约为 1mL/min。
注意： 1.试管太多，建议大家进行水浴时使用铝 制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑 试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱 出摔裂。水浴锅内水面刚好没过试管架中层 即可。水浴完成后用镊子和抹布把试管架拿 出来。 2. 应避免用手直接接触茚三酮。
六、思考题
1、为什么要使样品缓慢的进入层析柱的树脂？ 2、为什么要使用梯度缓冲液来洗脱？为什么 0.45的缓冲液加入到A池中？ 3、三次加入缓冲液的作用分别是什么？ （平衡、加样、洗脱） 4、试设计利用离子交换剂分离一种含等电点 分别为4.0、6.0、7.5和9.0的蛋白质混合液的 方案，并简述理由。
预祝大家实验成功！
加样示意图
6.洗脱并收集: 将体积均70mL（建议适量多加）离子强 度为0.45与0.9的两种缓冲溶液分别加入到梯 度混合器的两个烧杯中。其中0.45的加入到 直接输出溶液的那个池，如图 将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器 联接。同时开始用部分收集器开始收集洗脱 液，1.5ml/管×50。 注意：设臵首管为1，若有50支管，建议末管 号设臵为51
离子交换柱层析法分离氨基酸指导老师：肖靓 小老师： Nhomakorabea春丽、李洁茜
一、实验目的和要求
1.学习采用离子交换柱层析法分离氨基酸的原 理和方法。 2.掌握离子交换柱层析法的基本操作技术， 包括树脂的装柱加样、洗脱、检查等。
二、实验原理
离子交换树脂是具有酸性或碱性的合成聚 苯乙烯-苯乙二烯不溶性高分子化合物。 各种氨基酸分子的结构不同从而导致pI点 不同。各种氨基酸在同一pH时带有不同的电 荷，与离子交换树脂的亲和力有差异，因此 可依亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下 来，达到分离的效果。
7．氨基酸的鉴定： 向各管收集液中加1.5mL水合茚三酮显色 剂并混匀（加显色剂规则为：前10管都加， 以后每隔一管加一次，但当出现显色时，周 围几管都加。）在沸水浴中准确加热15min后 冷却至室温，再在加过显色剂的试管中加 1.5mL的50%乙醇溶液，放臵10min。以收集 液第二管为空白，对加过显色剂和乙醇的试 管进行光波吸收测定（测定570nm波长的光 吸收值）。以光吸收值为纵坐标，以洗脱体 积为横坐标绘制洗脱曲线
离子交换树脂转型示意图
离子交换树脂分离氨基酸原理示意图
四、实验器材
MC99-3自动液相色谱分离层析仪 层析管（20cmX1cm） 专用试管（≥50支） 水浴锅 铝制试管架X2 分光光度计 玻璃棒 移液管 洗瓶 硅胶管
五、实验步骤
1、树脂的准备： 将强酸型阳离子交换树脂用氢氧化钠处理 成Na+型后洗至中性待用。方法如下：将干 的强酸型离子交换树脂用蒸馏水浸过夜或搅 拌2小时，使其充分溶胀，倾去细小颗粒，再 用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡一小时（树脂 换为氢型），倾去清液，洗至中性，再用 2mol/L的氢氧化钠溶液做同样处理（树脂换 为钠型），洗至中性待用。
5．加样: 平衡好后，停止加入缓冲溶液，待缓冲溶 液弯月面靠近树脂顶端时，关闭下端开口。 加入0.5mL左右混合氨基酸溶液，待样品弯月 面靠近树脂顶端时，立即用少量浓度为 （0.45mol/L）的柠檬酸缓冲溶液冲洗层析管 内壁数次，再加入缓冲液约3～4厘米左右。 加样时应避免冲破树脂表面，且避免将样品 全部加在某一局限部位。 注意：平衡、加样、洗脱时都不能冲破树 脂表面
2、连接装臵 梯度混合器→恒流泵→层析管→部分收集器
3、装柱 干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸 馏水。将层析管用层析管架固定在铁架台上 适当高度，一个同学一手手执烧杯，一手用 玻璃棒快速在杯口搅动树脂，使树脂缓慢均 匀的流入层析管。另一个同学控制洗瓶加水 的速度以及水流出的速度 注意： 1、装柱过程不可中断，倒树脂要缓慢均匀 2、刚开始倒树脂时，水流出速度要控制 到很小，同时可以适当多加点水。最后一段 加水和放水都要慢，装柱过程中水面一定不 能低于树脂，但也不能溢出。
三、实验试剂
1、732阳离子交换树脂 2、2 mol/L盐酸溶液。 3．2 mol/L氢氧化钠溶液。 4. 标准氨基酸溶液：天冬氨酸2mg/mL、赖氨酸均配制成 4mg／mL的0.1mol/L盐酸溶液。 5．混合氨基酸溶液：将上述天冬氨酸、赖氨酸各溶液按 1:3的比例混合。 6. 两种檬酸钠-氧氧化钠-盐酸缓冲液(pH5.8，钠离子浓 度0.45mol/L的缓冲液和钠离子浓度为0.90mol/L的缓冲液) 取柠檬酸14.25g、氢氢化钠9.3g和浓盐酸5.25mL溶于少量 蒸馏水后，定容至500Ml（另一种定容至250mL），冰箱 保存。 7．显色剂：称取2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中， 加蒸馏水至100mL。 8．50%乙醇水溶液。