免疫荧光.ppt

(3)四乙基罗达明(RB200) 呈褐红色粉 末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可 长期保存。最大吸收光谱570nm，最大 发射光谱596～600nm，呈明亮橙红色荧 光，分子量580，RB200不能直接和蛋白 质结合，要先经五氯化磷反应，转化成 硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。
(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯 (5)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS） (6)得克萨斯红（Texas red） (7)藻红蛋白（PE） (8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）
四、荧光抗体的质量控制 主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。 1.特异性染色效价测定 2.非特异性染色测定 3.吸收试验 4.F/P比值的测定方法
五、免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法 简便、快速，用已知特异性标 记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。 操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS 洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS 洗。
发射 以辐身方式跃迁时，能量转化成相 应波长的光，这个过程叫发射。
荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单
重激发态。如果电子直接从单重激发态以 辐身方式跃迁到基态，由于单重激发态很 不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也 很短，这种发射光，叫荧光。
二、荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物
称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的 光能并发射荧光。
操作流程 (1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石 蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS 洗3×3min。 (2)适当稀释特异性一抗，37℃孵育1h， 或室温4h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。
(3)荧光标记二抗适当稀释37℃ 30min， PBS洗3×3min。 (4)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min。 (5)封片，镜检。
(2)滤片系统 是荧光显微镜的重要组成部 分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像 和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片 性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的 前提和必要条件。
滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热 滤片，分光镜和其他一些中性滤片。
荧光显微镜的滤片系统
激励法 U V BV
B
IB G
IG
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上， 湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。 (3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min，蒸馏水洗2次，除去Nacl结晶。 (4)pH9.0缓冲甘油封片。 (5)镜检
2.间接法 是直接法的重要改进，先用标 记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结 合，随后用间接荧光标记二抗与一抗特异 性结合。
免疫荧光组化技术
主要内容
一、荧光的特征 二、荧光素 三、荧光素标记抗体的方法 四、荧光抗体的质量鉴定 五、免疫荧光组化染色方法 六、荧光显微镜 七、非特异性荧光的消除方法
思考题： 1.什么叫荧光？ 2.常用荧光素有哪些特征？ 3.标记荧光抗体有哪二种主要的制备
方法？
4.免疫荧光组化直接法、间接法的 原理和主要操作流程？
FITC- N – C – N - 蛋白质 ‖
H SH
(2)操作流程 抗体与荧光素比例为50-100:1
抗体的准备：20mg/ml，碳酸盐缓冲液为总 量的1/10。
荧光素的准备：用分析天平准确称取 0.01mgFITC/1mg抗体。
结合：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体 溶液中。
透析 过柱 SephadexG50或 G25 保存 4℃ ,-40℃等量甘油分装保存。 2.Chadwick法 3.改良法 4.透析标记法 （二）四乙基罗达明标记抗体方法 （三）藻红蛋白标记抗体方法
三、荧光素标记抗体的方法 (一)FITC标记抗体的方法 1.Marsshall法 (1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应 时，主要是抗体分子上的赖氨酸ε -氨基与 FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86 个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。
荧光素FITC-N＝C ＋ N-蛋白质→ ‖ S HH
分光镜 DM400 DM455 DM455
DM500
DM505 DM570
DM565 DM600
5.观察荧光组化片时应注意哪些问题？ 6.非特异性荧光的消除方法有哪几种？
一、荧光的特征
分子都含有电子，电子在不停地运 动着。根据量子理论，运动着的电子可以 处于一系列不连续的能量状态中，电子遵 守一定的规则，要以从一个能级向另一能 级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定 能量的吸收或释放。
激发 当电子吸收能量跃迁到较高能级， 这个过程叫激发。
(6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜 色对比鲜明，能清晰判断结果。
2.荧光素的种类 (1)异硫氰酸荧光黄（FITC）：分子量 390D，最大吸收光谱为490～495nm，最 大发射光谱为520～530nm。呈现明亮的 黄绿色荧光，分子量389.4。
(2)四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）是 罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收 光谱为550nm，最大发射光谱为620nm， 呈橙红色荧光。
六、荧光显微镜检查方法 1.荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧
光组织化学的基本工具。它是由超高压光 源，滤片系统(包括激发和压制滤板)，光 学系统和摄影系统等主要部件组成，是利 用一定波长的光激发标本发射荧光。
(1)光源 光源的亮度应根据荧光素的类型 选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染 料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率 超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电， 引起球内水银蒸发，经过5～15min，球内 气压升至50～70标准大气压，此时达到最 高亮度，成为稳定工作状态。

1、具备用于标记抗体的荧光素条件
(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化 学基团，结合后不易离解，而未结合的色 素及其降解产物易排除。
(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光 素质量下降不多。
(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化 性质无影响。
(4)结合方法简便而快速，并且较稳定。
(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其 他物质发生化学反应。