石蜡切片冰冻切片超薄切片

石蜡切片技术

虽然21世纪医学高科技迅猛发展、日新月异，新的诊断方法层出不穷，但迄今为止，即使是世界上最发达国家，疾病的确诊主要还是通过病理诊断。病理诊断是所有其他诊断(包括临床诊断、影像诊断、实验室检查诊断乃至分子诊断)的金标准。因此学习相关病理诊断技术具有重要意义。病理技术不仅可以作为临床诊断的金标准，还可以帮助临床查明死因，对研究生来说还可以提供教学、科研的资料。

病理学科是一门基础与临床之间起着桥梁作用的重要学科，病理研究方法在技术工作上又是多方面的，有尸体解剖，大体标本的制作、制片技术（石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片、半薄切片、超薄切片）组织化学方法，免疫酶标技术、荧光技术、摄影技术等。

硕士研究生学习的课题研究阶段，往往需要自己设计并亲自动手操作，为满足研究生的实际需要，本章简要介绍常用的病理学有关技术，并注意尽量做到：①突出实用性：以行之有效的病理学常用技术为主线，围绕硕士研究生的实际需要，对病理学技术的原理、相关理论及具体操作方法、步骤等进行阐述。②反映进展性：充分反映病理学的时代性与进展性。

第一节组织制片的概述

组织制片技术的应用，从1665年由HOOk发现细胞开始，已有300多年的历史。最早应用冰冻切片；随后又进一步利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织，制成石腊切片；后来又利用明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等物质的韧性，以其包埋组织而制作切片。

组织制片技术随着生物学和医学的发展而发展。切片染色方法可以显示不同细胞和组织形态，以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化。因此，组织制片技术是教学、医学和科研中不可缺少的一个组成部分。

第二节制片的种类

一、组织切片法：

任何组织切片必须依靠切片机将组织切成薄片（厚度以μm计），再进行染色而得到结果。在切成薄片以前必须设法使组织内部渗入足够的支持物质，使组织保持一定的硬度，然后使用切片机进行切片。渗透到组织中的支持剂（物质）有多种，如石腊、明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等。

病理学研究中最常用的组织切片技术是常规石蜡切片和冷冻切片。其要点是将研究的组织进行切片，然后进行各种染色。冰冻组织切片法是直接利用快速冷冻法进行切片。

二、组织非切片法

不用切片机，不经过切片手续而制成组织切片的方法，包括整体封藏法、浮片法、压碎法和组织直接印片法。这些方法操作简单而快，可根据制片的需要进行选择使用。

第三节石蜡切片技术

石蜡切片法组织切片的主要程序：

一、取材

取材是根据实验目的及临床活检、尸解组织的病变程度而合理取得组织材料。为了制作优质的切片，取材时组织愈新鲜愈好，并应及时固定。

（一）病理标本的来源及分类：

病理标本的来源有临床活检、尸体解剖、实验动物、培养细胞。

主要病理标本大致可分类如下：

1、手术标本

2、内镜取材标本

3、穿刺取材标本

4、细胞学标本可分为：痰、尿、阴道分泌物、胸水腹水、穿刺细胞学标本、内镜刷取标本、其它等。

（二）取材的一般原则

1、认真观察，取准标本病变部位，切勿漏取。

2、要能全面反映出器官有无病变，显示病变全貌(最大面积)，包括肿瘤转移部位、切缘等。

3、根据临床或肉眼所见及病史提示对病变组织多取材，主要病变与相关组织多取材，特殊病变要尽量多取材。

4、若取材大小受限，应尽量取包含病变周边相对正常组织。

5、应避免选取凝血块、坏死组织及粘液成分。

6、要全面描述病变状况，由表及里，测重量、部位、体积等。

（三）取材方法

常见标本取材方法如下：

1、阑尾炎标本

2、肿瘤标本

3、胃标本

4、肠标本

5、肺、肾脏标本

6、乳腺癌根治标本

7、子宫标本

8、卵巢与输卵管囊肿标本

9、淋巴结标本

10、一般小标本

（四）取材注意事项

1、新鲜

2、配合

3、目的

4、部位

5、避免挤压

6、大小

7、数量

8、方向

9、标记

10、手术

11、小标本

12、交叉污染

（五）临床病理取材注意事项

姓名、样本、件数

二、组织固定

（一）固定的作用：

1、保持细胞与生活时的形态相似。

2、保持细胞内特殊的成分转变成不溶性物质。

3、使组织中的各种物质沉淀和凝固起来，以便染色后易于区别和观察。

4、固定剂兼有硬化作用，使组织硬化增加组织硬度，便于制片。

（二）原理：使组织及细胞内蛋白凝固；使有关成分沉淀、变性，成为不溶性物质。

（三）方法：浸泡、灌注（局部灌注、全身灌注）、蒸汽熏蒸

（四）固定时间: 一般固定液在24小时内不能穿透厚度大于2~3mm的实体组织或0.5cm的多孔疏松组织。

常规组织病理学：可长时间固定

细胞病理学：可长时间固定

细胞化学：不宜过长，约1小时为宜

（五）固定注意事项

1. 固定液有毒性，注意自身防护

2. 及时，尽可能新鲜。

3. 超微结构观察：低温固定

4. 注意不同研究目的对固定液的特殊需要

5. 固定液用量：足，必要时及时更换。一般应为组织块总体积的4~5倍，也可达15~20倍。

（六）常用的固定液：

1、单纯固定液：甲醛、乙醇、丙酮、戊二醛、醋酸、4%多聚甲醛

2、混合固定液：乙醇-甲醛液（AF液）、B5固定液（醋酸钠-升汞-甲醛）、Bouin氏液、Carnay氏液、Zenker固定液、氯化汞、苦味酸、重铬酸钾、AAF 液、甲醛-生理盐水等。

三、固定后处理：

（一）固定后处理的目的：及时洗去固定液，有利于脱水、切片和染色，并防止染色中甲醛色素的产生。

（二）固定后处理的注意事项：洗涤注意固定剂是否含乙醇或以水配制。

四、脱水：

（一）脱水的目的：利用脱水剂置换及驱除组织中的水分，以利于透明和浸蜡。

（二）脱水的步骤：

一般大小约为1.5cm×l.8cm×0.2cm的组织，其脱水步骤和时间如下：

70％乙醇1～2h

80％乙醇2～4h

90％乙醇2～4h

95％乙醇2～4h

无水乙醇2～4h

（三）脱水的注意事项：

1、浓度梯度