石蜡切片冰冻切片超薄切片

石蜡切片技术虽然21世纪医学高科技迅猛发展、日新月异，新的诊断方法层出不穷，但迄今为止，即使是世界上最发达国家，疾病的确诊主要还是通过病理诊断。

病理诊断是所有其他诊断(包括临床诊断、影像诊断、实验室检查诊断乃至分子诊断)的金标准。

因此学习相关病理诊断技术具有重要意义。

病理技术不仅可以作为临床诊断的金标准，还可以帮助临床查明死因，对研究生来说还可以提供教学、科研的资料。

病理学科是一门基础与临床之间起着桥梁作用的重要学科，病理研究方法在技术工作上又是多方面的，有尸体解剖，大体标本的制作、制片技术（石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片、半薄切片、超薄切片）组织化学方法，免疫酶标技术、荧光技术、摄影技术等。

硕士研究生学习的课题研究阶段，往往需要自己设计并亲自动手操作，为满足研究生的实际需要，本章简要介绍常用的病理学有关技术，并注意尽量做到：①突出实用性：以行之有效的病理学常用技术为主线，围绕硕士研究生的实际需要，对病理学技术的原理、相关理论及具体操作方法、步骤等进行阐述。

②反映进展性：充分反映病理学的时代性与进展性。

第一节组织制片的概述组织制片技术的应用，从1665年由HOOk发现细胞开始，已有300多年的历史。

最早应用冰冻切片；随后又进一步利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织，制成石腊切片；后来又利用明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等物质的韧性，以其包埋组织而制作切片。

组织制片技术随着生物学和医学的发展而发展。

切片染色方法可以显示不同细胞和组织形态，以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化。

因此，组织制片技术是教学、医学和科研中不可缺少的一个组成部分。

第二节制片的种类一、组织切片法：任何组织切片必须依靠切片机将组织切成薄片（厚度以μm计），再进行染色而得到结果。

在切成薄片以前必须设法使组织内部渗入足够的支持物质，使组织保持一定的硬度，然后使用切片机进行切片。

渗透到组织中的支持剂（物质）有多种，如石腊、明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等。

病理学研究中最常用的组织切片技术是常规石蜡切片和冷冻切片。

其要点是将研究的组织进行切片，然后进行各种染色。

冰冻组织切片法是直接利用快速冷冻法进行切片。

二、组织非切片法不用切片机，不经过切片手续而制成组织切片的方法，包括整体封藏法、浮片法、压碎法和组织直接印片法。

这些方法操作简单而快，可根据制片的需要进行选择使用。

第三节石蜡切片技术石蜡切片法组织切片的主要程序：一、取材取材是根据实验目的及临床活检、尸解组织的病变程度而合理取得组织材料。

为了制作优质的切片，取材时组织愈新鲜愈好，并应及时固定。

（一）病理标本的来源及分类：病理标本的来源有临床活检、尸体解剖、实验动物、培养细胞。

主要病理标本大致可分类如下：1、手术标本2、内镜取材标本3、穿刺取材标本4、细胞学标本可分为：痰、尿、阴道分泌物、胸水腹水、穿刺细胞学标本、内镜刷取标本、其它等。

（二）取材的一般原则1、认真观察，取准标本病变部位，切勿漏取。

2、要能全面反映出器官有无病变，显示病变全貌(最大面积)，包括肿瘤转移部位、切缘等。

3、根据临床或肉眼所见及病史提示对病变组织多取材，主要病变与相关组织多取材，特殊病变要尽量多取材。

4、若取材大小受限，应尽量取包含病变周边相对正常组织。

5、应避免选取凝血块、坏死组织及粘液成分。

6、要全面描述病变状况，由表及里，测重量、部位、体积等。

（三）取材方法常见标本取材方法如下：1、阑尾炎标本2、肿瘤标本3、胃标本4、肠标本5、肺、肾脏标本6、乳腺癌根治标本7、子宫标本8、卵巢与输卵管囊肿标本9、淋巴结标本10、一般小标本（四）取材注意事项1、新鲜2、配合3、目的4、部位5、避免挤压6、大小7、数量8、方向9、标记10、手术11、小标本12、交叉污染（五）临床病理取材注意事项姓名、样本、件数二、组织固定（一）固定的作用：1、保持细胞与生活时的形态相似。

2、保持细胞内特殊的成分转变成不溶性物质。

3、使组织中的各种物质沉淀和凝固起来，以便染色后易于区别和观察。

4、固定剂兼有硬化作用，使组织硬化增加组织硬度，便于制片。

（二）原理：使组织及细胞内蛋白凝固；使有关成分沉淀、变性，成为不溶性物质。

（三）方法：浸泡、灌注（局部灌注、全身灌注）、蒸汽熏蒸（四）固定时间: 一般固定液在24小时内不能穿透厚度大于2~3mm的实体组织或0.5cm的多孔疏松组织。

常规组织病理学：可长时间固定细胞病理学：可长时间固定细胞化学：不宜过长，约1小时为宜（五）固定注意事项1. 固定液有毒性，注意自身防护2. 及时，尽可能新鲜。

3. 超微结构观察：低温固定4. 注意不同研究目的对固定液的特殊需要5. 固定液用量：足，必要时及时更换。

一般应为组织块总体积的4~5倍，也可达15~20倍。

（六）常用的固定液：1、单纯固定液：甲醛、乙醇、丙酮、戊二醛、醋酸、4%多聚甲醛2、混合固定液：乙醇-甲醛液（AF液）、B5固定液（醋酸钠-升汞-甲醛）、Bouin氏液、Carnay氏液、Zenker固定液、氯化汞、苦味酸、重铬酸钾、AAF 液、甲醛-生理盐水等。

三、固定后处理：（一）固定后处理的目的：及时洗去固定液，有利于脱水、切片和染色，并防止染色中甲醛色素的产生。

（二）固定后处理的注意事项：洗涤注意固定剂是否含乙醇或以水配制。

四、脱水：（一）脱水的目的：利用脱水剂置换及驱除组织中的水分，以利于透明和浸蜡。

（二）脱水的步骤：一般大小约为1.5cm×l.8cm×0.2cm的组织，其脱水步骤和时间如下：70％乙醇1～2h80％乙醇2～4h90％乙醇2～4h95％乙醇2～4h无水乙醇2～4h（三）脱水的注意事项：1、浓度梯度2、彻底干净3、时间适度4、有盖瓶子5、达到无水6、其它五、透明（一）透明的目的组织块在浸蜡前，必须通过透明以便使石蜡浸入组织内，起充分支持硬化组织块的作用，以便完整切片。

通常根据透明时间与肉眼观察相结合判断透明程度。

（二）常用透明剂的种类和使用方法最常用的是二甲苯，另外还有甲苯、苯、氯仿、香柏油、松节油、汽油等。

六、浸蜡（一）浸蜡的目的组织经过脱水、透明后要用石蜡、火棉胶、碳蜡等支持剂透入内部，使其变硬并将组织包埋进去以利于切片和观察，这个过程称为“透入（浸蜡）”或“包埋”。

（二）浸蜡的方法将组织经过透明以后立即投入到液体石蜡中去。

在浸蜡时组织必须经过数次纯石蜡（石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），这样可以使石蜡中剩余的透明剂完全除尽，以免影响切片质量。

（三）浸蜡剂的种类1、石蜡石蜡有高熔点和低熔点之分，一般普遍应用熔点为56℃以上的石蜡。

低熔点在54℃以下，用于酶的显示和保存抗原活性。

2、火棉胶目前使用火棉胶透入组织较少，用于染色前的覆盖液较多。

3、碳蜡4、明胶七、包埋（一）包埋的目的：用石蜡将经过固定、脱水、透明、浸蜡后的组织包绕成长方体块状以便于切片。

石蜡是动物植物、人体组织制片技术中极重要且应用最广的包埋剂。

包埋蜡须在温箱内经多次熔化沉淀后的干净蜡，包埋较为理想，其包埋蜡熔点为56℃～58℃。

将经过固定、脱水、透明、浸蜡后的组织用石蜡埋入，待组织冷却、变硬，这样组织可以获得一定的硬度，以便切成薄片。

（二）石蜡包埋的注意点：1、动作要迅速。

2、注意切面。

3、加温镊子。

4、组织不能重叠。

5、包埋用蜡一般为工业蜡。

八、切片（一）切片前的准备工作1、修块：石蜡切片前应先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，组织四周留2mm的石蜡边。

2、粘块（二）切片操作包括切片、展片和烤片。

1、切片：将包埋好的组织块用切片机切成一定的厚度(一般为4μm)的薄片称为切片。

切片机多为轮转式切片机或平推式滑动切片机。

2、展片：将已切妥的切片在温水中铺展平整后，用载玻片捞起附贴其上称为展片。

3、烤片稍晾干后再用烤片机烤片，使其牢固附着，称为烤片。

冰冻切片技术冰冻切片在组织学技术中应用范围较广，对病理学中的临床手术的快速诊断其意义更大。

冰冻切片多用于新鲜组织，甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。

组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。

一、冷冻切片的目的1、在手术进行中的病理确定。

2、了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或转移的程度。

3、了解恶性肿瘤手术范围。

4、诊断剖腹探查时所发现的异样组织。

5、显示组织中的脂肪和脂类物质。

如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。

6、某些酶的显示。

7、神经病理学技术中的某些染色法。

8、免疫荧光的研究。

二、实验方法1、准备：将仪器打开，样品台温度调至-40℃。

2、取材：组织必须新鲜，尽可能不经水洗。

取材时应避免组织挤压，防止人为假象。

样品大小5×5×3mm。

3、速冻：将样品放在样品台上，样品四周加水加固，冷冻5～10min。

4、切片：升高温度至- 15℃（视样品而定），约5min后开始切片，厚度6～15μm。

5、制片：将切片直接放在载玻片上。

6、固定液（丙酮）中固定1～2min。

7、染色观察8、记录：将观察的结果记录实验报告上。

切片温度的设定原则：1、柔软、含水较多的组织设定温度高。

2、致密、富含脂肪的设定温度低。

冰冻切片的特点：优点：1、简便。

2、快速。

3、组织变化不大。

4、能很好保存脂肪，类脂等成分。

5、较完好地保存各种抗原活性及酶类。

不足：1．不容易做连续切片。

2．切取的组织不能过大。

3．不容易制作较薄的切片。

4．组织结构不如石蜡切片清晰。

超薄切片的制作技术简介一、透射电镜样品制作操作流程取材——漂洗（生理盐水）——前固定（2.5%戊二醛，4ºC冰箱2小时以上）——漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）——后固定(1%锇酸1小时左右)——漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）——块染（1%醋酸铀2小时）——梯度脱水（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分钟， 100% 2次，各10分钟）——浸透（丙酮：包埋液=1：1，37 ºC烘箱2小时；丙酮：包埋液=1：4， 37ºC 烘箱过夜；纯包埋液45ºC烘箱2小时）——包埋聚合（45ºC烘箱3小时，65ºC 烘箱48小时）。

二、扫描电镜样品制备操作流程取材（做好样品观察面的标志）——漂洗（生理盐水或缓冲液）——固定（2.5%戊二醛2小时以上）——漂洗（0.1M磷酸缓冲液，3次，45分钟）——后固定（1%锇酸，2小时）——脱水（ 50%、70%、80%、90%、95%各15分钟，换醋酸异戊酯15分钟或叔丁醇15分钟）——干燥（零界点干燥或冷冻干燥）——镀膜（真空镀膜仪或离子溅射仪）。