脓毒症大鼠肝组织基因表达变化的研究

脓毒症大鼠肝组织基因表达变化的研究
摘要】目的应用基因芯片技术初步分析脓毒症大鼠肝脏组织细胞基因表达谱的
变化。

方法健康Wistar 大鼠40 只，随机分为模型组和假手术组，每组各20 只。

通过盲肠结扎穿孔术（CLP）制备大鼠脓毒症模型，应用含有22523 个大鼠基因cDNA 克隆的表达谱基因芯片进行检测，筛选差异表达基因，用计算机软件分析
脓毒症大鼠肝脏组织术后24 小时的基因表达变化。

结果与假手术组比较，共筛
选出差异表达基因共285 条，占基因芯片总点数的1.26%，其中已知基因180 条，93 条基因表达上调，87 条基因表达下调。

涉及到一系列与细胞生长调节相关基因，物质能量代谢相关基因，信号转导、炎症、应激反应相关基因，转录调控及
蛋白质翻译、修饰、加工、降解相关基因等相关的基因异常表达。

结论脓毒症导
致的多脏器功能不全（MODS）是多种基因作用的结果，采用基因芯片技术全面
揭示脓毒症肝脏基因表达的模式，有利于发现新的研究目标和治疗途径。

【关键词】脓毒症肝基因表达基因芯片
【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）08-0053-03
脓毒症(Sepsis) 及其所导致的多脏器功能不全（MODS），在临床上发病率高，病死率高，临床救治棘手，源于其发病机制非常复杂。

目前多数认为是过度的炎
症反应与代偿性抗炎反应失衡，出现免疫系统功能紊乱的病理生理过程，并与机
体多系统、多器官病理生理改变密切相关，涉及感染、炎症、免疫、凝血及组织
损害等一系列基本问题[1]。

国内外已有学者运用基因芯片技术对经C L P 或腹腔
注射脂多糖制备小鼠脓毒症模型的多个脏器组织的基因差异表达分别进行研究，
其结果初步显示了这些组织中部分基因表达的特异性改变，但并未对脓毒症机制
和治疗的研究提出新的看法。

本实验再次运用基因芯片技术研究分析脓毒症时肝
脏相对应的基因表达谱变化，旨在进一步探讨脓毒症的研究治疗新途径。

1 材料和方法
1.1 实验动物及模型制备
雄性健康Wi s t a r 大鼠40 只，体重180 － 220g，购自上海斯莱克实验动物
有限公司。

实验前在清洁级环境下饲养2 周，常规饲料喂食、正常饮水。

按随机
数字表法分组：假手术组（n ＝ 20 只）、模型组（n ＝ 20 只）。

模型组：采用
盲肠结扎穿孔术（CLP）方法建立大鼠肠源性脓毒症模型。

实验前大鼠禁食过夜，自由饮水，称体重后以氯胺酮（100mg/ kg）腹腔麻醉固定，消毒铺巾，沿中下腹正中线切开2cm 开腹提出盲肠，7 号丝线距盲肠根部1c m 处血管弓内结扎盲肠；用9 号无菌针头刺穿盲肠3次，使肠内容物流出，避免伤及肠系膜血管，然后将
盲肠放回腹腔，缝合腹部切口。

假手术组：不结扎和穿刺盲肠外，其余操作同CLP组。

两组术毕皮下注射平衡液5ml/kg以补充术中丢失的体液并抗休克治疗，
术后正常饮食、自由饮水。

1.2 肝组织的留取和处理
两组大鼠（n＝40只）24h断颈活杀迅速开腹摘取肝脏，置入液氮罐中骤冷保存，温度－70℃，备用。

1.3 基因芯片杂交及检测分析
用一步法总RNA提取试剂（Trizol）抽提液氮中肝组织总RNA。

反转录并标记探针，与RatRef-12大鼠表达谱基因芯片(由联合基因技术有限公司制作，每个芯
片含有22523个大鼠基因cDNA克隆)杂交过夜，洗片、晾干后扫描，采用Scan
Arrav 4000型激光共聚焦扫描仪以两种不同波长扫描芯片，应用Gene Pix Pro 3.0
图像处理软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值，以两次芯片两种荧光
信号强度结果比值（Ratio值）均>2.0或均<0.5的基因为差异表达基因，前者示模型组的基因表达显著上调，后者示模型组的基因表达显著下调 [2]。

通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库查询基因功能并加以分类。

2 结果
肝脏基因表达谱差异分析：在模型组中共筛选出差异表达基因共285条，占
基因芯片总点数的1.26%，其中已知基因180条，93条基因表达上调，87条基因表达下调；未知基因105条，58条基因表达上调，47条基因表达下调。

2．2．1脓毒症组肝脏组织出现表达上调的部分已知差异基因(见表1)：表1脓毒症组肝组织出现表达上调的部分已知差异基因
2.2 脓毒症组肝脏组织出现表达下调的部分已知差异基因（见表2）：
表 2 脓毒症组肝脏组织出现表达下调的部分已知差异基因
3.讨论
肝脏是营养物质、炎症介质、激素及内毒素的主要代谢器官。

在脓毒血症的
发生发展中，肝功能障碍往往在肺、肾功能衰竭发生后出现，可以加速肺脏和肾
脏等器官的损伤和功能障碍，从而影响整个机体的新陈代谢，增加脓毒症的救治
难度和病死率。

Roule和Kettlewell发现，脓毒症患者肝功能异常表现为：白蛋白和胆固醇的
降低，以及碱性磷酸酶和血清谷草转氨酶的升高 [3]。

死于脓毒血症的患者，其肝脏组织学改变为：肝小叶中带和外带坏死，有急性炎症反应和胆汁淤积。

肝细胞
坏死似乎成了脓毒血症的特征之一。

本实验对 CLP脓毒症模型大鼠晚期(24小时)肝脏组织中的差异表达基因按其
所编码的蛋白质功能予以聚类分析，初步显示了脓毒症是肝脏组织中部分基因表
达的特征性改变：
①各种基本营养物质代谢及生物转化酶类相关基因表达明显异常： a. Pdp2 (调节糖有氧氧化代谢的关键酶)、UgP2（调节糖原合成的催化酶）等基因的表达
量发生了下调；Sds、Got1（糖异生途径中的丙酮酸转运）等基因表达上调，说
明机体处于糖异生旺盛状态，葡萄糖有氧氧化途径受限，糖氧化功能减少，无氧
酵解供能使机体能量代谢处于衰竭状态。

b. Bhmt（蛋氨酸循环代谢）、Oat（鸟氨酸代谢）、Hspa14(热休克蛋白)、MVd（胆固醇合成限速酶）、Plala（甘油磷脂降解途径）、Fabp2（肠道脂肪酸转运）、Lpl（脂肪分解代谢）等基因表达均上调；Acbd6、Slc22a5（脂酸氧化关键
酶和转运载体）、Fabp7、Hacl1（脂肪酸合成代谢酶）等基因表达均下调，提示：机体处于蛋白质代谢旺盛状态，急性期蛋白合成增加。

脂肪动员状态，脂肪分解
增加，脂肪的氧化供能尚未受到充分抑制。

c . E p h x1、U g t 家族、A l
d h l a1、G l y a t、G s t m3、A k r7a3、CyP450 家族等基因，以及Gclc、Gclm（谷胱甘肽生物合成）等基因均表达下调，提示肝脏的
氧化还原及生物转化功能严重受损，药物、毒物及内源性物质（如激素、神经递质、胺类）等非营养性物质的代谢障碍。

本实验以上基因表达情况，说明全身炎
症反应使机体处于一种严重的物质能量代谢紊乱状态，物质合成及生物转化的抑
制和高分解代谢是其主要特点，这种高代谢的净效应将导致机体细胞群进行性丢失，并最终导致MODS。

肝细胞根据其结构和功能的异质性分为三个带。

其中，Ⅲ带（小叶中心带）
是接近中央静脉的肝细胞，其营养条件最差，主要负责糖原生成、糖酵解、脂类
生成、氨解毒、生物转化作用等。

该实验中，与这些功能相关的基因表达均明显
下调，提示肝小叶中心带肝细胞的生理功能严重受损，这与病理标本的光镜下表
现一致。

脓毒症肝损害的机理目前尚不完全清楚，可能的机理有：1、脓毒症时
高排低阻的循环特点使肝脏供血减少，局部的高代谢，导致氧债增加，肝小叶中
央或局部出现缺血[4、5]；2. 细胞因子或介质介导及氧化剂可能是导致肝损害的
另一原因。

3、肝脏不仅因原发病因素受损，而且受损的肝脏本身可能参与维持
这种损害的存在，如肝Kupffer 细胞所释放的细胞因子可能发挥这种作用[6]。

对
于目前的认识，进行快速充分的复苏，保持内脏高血流量仍是预防肝细胞缺血坏
死的最好办法，进一步研究肝小叶中心带细胞坏死的机制，可能为脓毒症的治疗
提供新的靶点。

② 调控转录相关的基因有12 个表达上调，6 个表达下调；信号转导相关基
因有13 个上调，11 个下调。

显示脓毒症时肝细胞的D N A 转录与信号转导处于
紊乱状态。

其中，类固醇激素受体相关基因N r1i3 表达下调，可能与脓毒症时核
因子-κB(NF-κB) 的过度表达有关，可导致脓毒症时的类固醇激素抵抗。

S O C S 家
族蛋白是一类可被多种细胞因子诱导产生，反过来又能以负反馈方式对信号转导
途径进行抑制调节的蛋白分子。

虽然SOCS 蛋白被首先证明是JAK-STAT 路径的抑
制剂，但其家族中也有参与提升信号蛋白退化的细胞信号，并且与其他许多信号
转导因子都有联系。

在脓毒症的免疫反应中，S O C S 蛋白在T 细胞分化为T 辅助
细胞分型时有着重要的作用[7]，它还可通过调节B C L -2 家族成员来调节细胞凋
亡[8]。

因此，Socs2 表达下调可导致炎症因子的量产生与释放，进一步促进了脓
毒症的发展。

③ 与炎症反应相关的基因中，有7 个促炎症相关基因表达上调，如： Fabp4、Cxcl1、Cxcl9、A2m、Dusp1、Il18bp、Nfil3，2 个表达下调, 如： Kikb1、Sectmla；
抗炎症相关基因表达上调5 个，如：S100a8、Btg2、Danjb4、Sgk、Procr，2 个表
达下调，如：Hspb1、Il15。

表明脓毒症时机体同时存在炎症反应和抗炎反应。

临
床中有一部分脓毒症患者致炎因素强于抗炎因素，表现为全身炎症反应综合征(SIRS)；也有相当一部分患者抗炎因素强于致炎因素，表现为代偿性抗炎反应综合征（C A R S）和免疫抑制[9]，但实际上在I C U 中更常见的是另一种不协调的促
炎症反应和抗炎症反应同时存在的混合拮抗反应状态（MA R S）[10]。

脓毒症是
由致炎、抗炎细胞因子和细胞因子拮抗物间复杂的相互作用而发生发展的。

就目
前认识的水平来看，促炎症反应和抗炎症反应因素在数量和时间上的关系将决定
脓毒症患者的免疫状态，任何一方的过度反应都对患者造成不良影响，特别由于MA R S 的存在，使获得一种适当的协调关系成为艰难的治疗挑战，故而任何试图
去封闭、抑制或中和炎症及其调节过程的单一因素，势必矫枉过正导致新的炎症
紊乱，如果能更好的了解促炎反应和抗炎反应之间的协调或失调的关系，可能寻
找到脓毒症合并MODS 的有效治疗方法。

④ 该实验中发现细胞凋亡相关基因上调5 个包括：D d i t4、Ho mx1、Lcn2、Sgk、Tnfrsf12a，下调5 个包括：Aldhla1、Dnase1l3、O s g i n l、R n d3、T n f s f10；抗凋亡相关基因上调7 个包括：I g f b p1、Ntf3、Pref1、Timp1、Tspan31、S100a8、Myc，下调4 个包括：Hs pb1、Il15、Prlr、Socs2。

表明脓毒症时肝脏细胞的生长
调控处于紊乱状态。

凋亡是一种严密调节的能量依赖性的细胞死亡过程。

这一过
程普遍存在，但在脓毒症时对免疫系统有特殊重要性。

有证据表明免疫细胞和实
质细胞的凋亡与器官功能改变及伤后多种反应有关，致炎因子（TNF、IL-1、IL-6 等）及内毒素已经证实可减少或推迟离体免疫细胞的凋亡，使之进一步刺激炎症
反应，使炎症反应延长。

而实体细胞可上调局部损伤的凋亡途径，反应去除因炎
症导致的功能严重受损细胞，同时不刺激炎症反应，这是细胞过度损伤的一种反应。

在脓毒症条件下，实质细胞的凋亡增加或减少均可削弱脏器的功能，可见脓
毒症脏器实质细胞的凋亡，是一种适应性反应的结果。

除上述已知基因外，实验还检测到大量的未知基因也存在差异表达，这些基
因在小鼠脓毒症进展中扮演的角色，以及它们对人类脓毒症研究的意义，还有待
进一步研究。

综上所述, 该实验初步揭示了脓毒症小鼠肝脏损伤的病理变化以及相关基因表
达谱的变化特点：脓毒症导致的多脏器功能不全（MO D S）是多种基因作用的结果，各基因表达的产物相互作用、相互影响，保持动态平衡，形成错综复杂的网
络系统。

目前的研究普遍遵循雷内. 笛卡尔的简化论方法，即：理解所有自然现
象的路径是将其分解成各个组成部分，直至不可再分[11]。

网络系统中每个因素
的功能及相互关系的研究，固然有助于全面了解脓毒症时MODS 的发生发展机理，但其项目繁多，事倍功半，故任重而道远。

在治疗上，可尝试以西医脏器支持保
持内环境稳定为基础，结合中医整体理念，用中草药、针灸等措施，个体化调节
各脏器功能。

参考文献
[1]. 张福清，陈国忠. 脓毒症的新认识. 临床军医杂志，2007，35（3）： 450 － 452.
[2] . 李志军、李银平、盖慧荣，等脓毒症大鼠肝组织基因表达的研究 Chin Crit Care
Med ,March 2007,vol.19,No.3:156-158.
[3].Royle GT,Kettlewell MGW:Liver function tests in surgical infection and malnutrition.Ann Surg 1980;192:192-194.
[4].Dahn MS:Hepatic dysfunction in the critically ill and injured.Intensive Care World 1994;11(1):9-14.
[5].Dahn MS,Mitchell RA,Lange P,Smith S,Jacobs LA:Hepatic metabolic response to injury and
sepsis .Surgery 1994;117:520-530.
[6].Bankey PE:Hepatic regulation of systemic inflammation following acute injury .Curr Opin Crit Care 1996;2:280-286.
[7].Egwuagu CE,Yu CR,Zhang M,et al.Suppressors of cytokine signaling proteins are differentially expressed in Th1 and Th2 cells:implications for Th cell lineage commitment and maintenance [J].J Immunol, 2002, 168(7): 3181-3187.
[8].Ketteler R,Moghraby C S,Hsiao J G,et al.The cytokine-inducible scr homology domain-containing protein negatively regulates signaling by promoting apoptosis in erythroid progenitor cells[J].J Biol Chem ,2003,278(4):2654-2660.
[9] . B o n e RC: Si r Is a a c N e wt o n , s e p s i s , S IRS , a n d CA RS . Cr i t Ca r e Me d
1996;24:1125-1128.
[10].Bone RC,Grodzin CJ,Balk RA:Sepsis:a new hypothesis for pathogenesis of the disease process.Chest 1997;112:235-243.
[11].Descartes R:Rules for the Direction of the Mind,Rule IX..。