细胞培养过程中谷氨酰胺检测方法汇总

细胞培养过程中谷氨酰胺检测方法汇总

谷氨酰胺是一种基本的氨基酸,为其它氨基酸、脂类、细胞内蛋白质、抗体和核酸的合成提供碳源和氮源。谷氨酰胺还可刺激抗体的转录后翻译过程。在许多细胞的培养过程中,均发现了细胞生长对谷氨酰胺有依赖性,如在杂交瘤细胞培养过程中,谷氨酰胺浓度为零时,细胞快速死亡。有一些细胞经过适应后,能在不含谷氨酰胺的培养基中生长,但细胞株之间的适应速率存在较大的差异。细胞生长是否依赖于谷氨酰胺的关键在于细胞是否含有内源的谷氨酰胺合成酶,即是否具有将谷氨酸转化生成谷氨酰胺的能力;另外,谷氨酸的运输速率及谷氨酰胺的生成速率限制是导致细胞在无谷氨酰胺培养基中生长速率减慢的主要原因。因此细胞培养中检测谷氨酰胺浓度具有重大价值，本文就目前常见的谷氨酰胺的检测方法做一个全面的汇总。

一、滴定法

1.原理谷氨酰胺分子结构中既有羧基，又有胺基，但其酸碱性都较弱，故只有在非水溶剂中才能滴定其羧基或胺基。为此，以乙酸（冰醋酸）为溶剂，用高氯酸滴定其胺基。

2电位滴定法称取预先在105℃干燥至恒重的样品0.15g ，精确至0.0001g ，置于干燥的烧杯中，加无水甲酸3mL 溶解后，再加入50mL 冰乙酸，用高氯酸标准溶液滴定，用电位滴定仪滴定至终点，滴定的结果用空白试验校正。

3.指示剂法取本品干燥品约0.15g ，精确至0.0001g ，加无水甲酸3mL 溶解后，加乙酸(冰醋酸)50mL ，加结晶紫指示液1滴，以高氯酸标准滴定溶液(0.1mol/L)缓缓滴定至显蓝色即为终点，记录滴定液消耗体积。同法做空白试验，记录。

计算X%=()1001000

14.1460⨯⨯⨯-⨯m V V C 式中：X ——L-谷氨酰胺含量，%；

C ——高氯酸标准滴定溶液浓度(mol/L)；

V ——滴定样品时消耗高氯酸标准滴定液体积数(mL)；

V 0——空白试验时消耗高氯酸标准滴定液体积数(mL)；

m ——样品质量(g)；

146.14——L-谷氨酰胺的摩尔质量（g/mol ）。

允许误差平行测定结果绝对值之差不得超过0.3%；取算术平均值为分析结果。

高氯酸标准溶液浓度校正当滴定样品与标定高氯酸标准溶液时，温度之差可超过10℃，则应重新标定高氯酸标准溶液的浓度：温度之差不可超过10℃可按下式加以校正。

C 1=）

010

t -t (0011.01⨯+C 式中：C 1——滴定样品时高氯酸的浓度，mol/L ；C 0—标定标准溶液时高氯酸的浓度，mol/L ；

t 1——滴定样品时高氯酸的温度，℃；t 0——标定标准溶液时高氯酸的温度，℃；

0.0011——冰乙酸的膨胀系数

二、试剂盒比色法

1.检测原理：谷氨酰胺和羟胺在谷氨酰胺合成酶的作用下生成谷氨酰氧肟酸和氨，通过显色反应可测定谷氨酰胺的含量。

2.操作步骤：

3.计算公式：

（1）.血清（浆）中谷氨酰胺的计算：

谷氨酰胺（mmol/L=（测定管OD值-空白管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准浓度（2mmol/L）×样本测定前稀释倍数

（2）组织中谷氨酰胺的计算：

谷氨酰胺浓度(mmol/gprot)*=(测定管OD值-空白管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准浓度（2mmol/L×样本测定前稀释倍数÷蛋白含量（gprot/L）**

*mmol/gprot=毫摩尔/克蛋白

**gprot/L=克蛋白/升

三、高效液相色谱法（HPLC）

1.原理：通过谷氨酰胺与双（1，1-三氟乙酸基）碘苯（BTI）反应后酸水解，再用异硫氰酸苯酯衍生后，用HPLC检测

2.操作步骤

2.1样品制备将各种乳制品稀释10倍，进行检测。

2.2Gln残基保护反应取100μL标准肽（2.5mg/mL）或样品溶液，加入100μL新配制的BTI乙腈溶液，并加入25μL的吡啶水溶液（50μmol/mL），混合均匀后充氮，50℃反应4h，室温吹干备用。

2.3蛋白质的酸水解向BTI处理过的样品中加入浓度为6mol/L的HCl200μL，置于管内，高温封管后，110℃水解24h，水解后切开封管口，室温氮气吹干备用。

2.4异硫氰酸苯脂（PITC）衍生酸水解样用100μL的乙腈-吡啶-三乙胺-水（10∶5∶2∶3）缓冲液溶解，氮气吹干后加入250μL的同样缓冲液，并加20μL PITC，50℃反应1h后，加入正己烷200μL，混匀，封置分层，从下层吸取200μL移入3mL样品管中，加入2800μL稀释液，混匀后即可上机分析。

四、酶膜电极法

1.原理：利用谷氨酰胺合成酶能将谷氨酰胺转变成谷氨酸和氨的特性，检测谷氨酸的含量记为A值，再利用谷氨酸电极去检测细胞培养液中谷氨酸的含量记为B值，A-B的差值即为细胞培养液中谷氨酰胺的含量。

2.操作步骤详见仪器使用说明书

五、总结

在细胞培养中谷氨酰胺参与能量代谢时的脱氨反应和谷氨酰胺的自然降解导致氨的产生。多数人认为,当氨浓度大于4mmol/L时,可抑制细胞的生长,这一数据主要来自不同氨浓度条件下的细胞培养实验。但Martineell和Hgagsrtom认为细胞代谢过程中产生的氨比培养基中添加的氨对细胞毒性更大,即使氨浓度小于4mmol/L也可能对细胞生长产生明显的抑制作用。因此选择一种高效、快速、简便、准确的检测方法成为细胞培养能否成功的关键因素。通过以上几种方法的介绍我们发现滴定法具有简单、投资小等优点，但是一般针对高纯度谷氨酰胺的检测，对于组分复杂的细胞培养液，检测结果偏差较大；高效液相色谱作为实验室常规仪器，实验室必备，多数细胞实验室可以采用该方法准确检测谷氨酰胺浓度，但是存在操作复杂、前处理时间长等问题，严重制约细胞培养过程的调控和预判。

酶膜电极法作为一种简单、快速、准确的检测方法，广泛应用于临床诊断。西尔曼科技公司作为一家创新型公司推出了M100、M800、M900等不同规格、配置的产品来满足不同客户的需求。酶电极法可以在20秒内检测出细胞培养液中谷氨酰胺的浓度，误差和准确性在2%以内，单次检测成本只有0.18元，是细胞培养过程生化指标检测的理想之选。