第六章致突变作用及其评价
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阳性只能说明精子发生过程受到干扰或损害，即间 接推断其原因可能与控制精子形成过程的基因突变有关， 故必须结合其它诱变试验结果综合考虑。
三、试验结果的评定
盲法观察 阴性对照 阴性结果的判定条件是：最高剂量应包括受试物溶 解度许可或灌胃量许可的最大剂量，如该剂量毒性很大， 则体内试验和细菌试验应为最大耐量； 各剂量组间差距 不应过大，以防漏检仅在狭窄范围内才有致突变能力的 某些外来化合物。 阳性对照 阳性结果应当有剂量反应关系，即剂量越大，致突 变效果越大，并在一组或多组的观察值与阴性对照之间 有显著差异。
优缺点：
Ames试验48～72小时可观察结果，费用较低。
与哺乳动物体内突变实际情况可能有差异，
如：微生物细胞中遗传密码仅为哺乳动物1／6，数 量少而简单。哺乳动物DNA修复系统远较微生物为复杂 而精巧。微生物无免疫机能，而哺乳动物则具备。 肝微粒体酶虽然是外来化合物在体内代谢转化中最 重要的酶类。但也有少数外来化合物代谢转化不在肝脏 进行。 例如致癌物苏铁素是在肠道中被活化，单独用Ames 法则不能检出其致突变性。
染色后呈桔红色），微核与细胞核一致，呈紫红色或紫兰
色。 每只小鼠要求观察1000个PCE，记录其微核发生率， 结果阳性说明受试物具有致突变作用。 正常小鼠PCE发生率为1～3‰。
6 精子畸形试验
原理：
Krzzanowska认为“Y-性连锁基因控制畸形精子的 数量，常染色体控制精子的表形，如上述基因发生突变， 或性-常染色体易位，就是化合物诱发精子畸形率增高的主 要因素。
3 姊妹染色单体交换（sister chromatid exchange， SCE） 试验
遗传学终点：①染色体完整性改变②DNA重排或交换
4 显性致死突变试验（dominant lethal mutation test）
遗传学终点：染色体完整性改变 原理：通过哺乳动物生殖细胞染色体畸变进行的致 突变作用试验。哺乳动物生殖细胞染色体发生突变时，往 往不能与异性生殖细胞正常结合，易出现受精卵在着床前 死亡和胚胎早期死亡。显性致突变的机理可能是生殖细胞 染色体的断裂和易位。 1. 试验动物：多用雄性大鼠或小鼠进行。
二、化学诱变的分子机理
(一)直接以DNA为靶的诱变
1、碱基类似物（base analogue）取代 2、烷化剂的影响 3、改变或破坏碱基的化学结构 4、平面大分子嵌入DNA链 (二)不以DNA为靶的间接诱变 1、纺锤体抑制 2、对酶促过程的作用
三、 突变的后果
（一）体细胞突变的后果
1．致癌问题 2．导致畸形 3．可能与动物粥样硬化症有关 4．可能是衰老的起因：
第六章 外来化合物致 突变作用及其评价
一、诱发突变的类型 （一）基因突变（gene mutation）
（二）染色体畸变
基因突变是染色体上一个或几个基因的变化，
即遗传物质在分子水平上的改变，有碱基置换， 移码和大段损伤
1．碱基置换：是某一碱基对性能改变或脱落而引 起的突变
转换（transition）：原来的嘌呤被另一种嘌
胎盘 红色
较大
灰红 较小 暗紫
早期 死胎
吸收 台
未完整成 形
不能辨认 胚胎和胎 盘
——
——
不能辨认
5 微核试验
遗传学终点：：①染色体完整性改变②染色体分离改变 原理： 正常细胞在有丝分裂中期时，染色体均排列在赤道
板附近，分裂后期便分成两份向两极移动，并在末期形成
两个子细胞核。微核是由于某些物理或化学因素的作用， 使细胞内染色体断裂产生无着丝点断片或纺锤体受影响而
2 Ames试验： 指鼠伤寒沙门氏菌／哺乳动物微粒 体酶试验，由Ames首先建立。 原理：在细菌回变试验的基础上，首先将受试 物与肝微粒体在体外进行代谢活化，再以营养缺 陷型鼠伤寒沙门氏菌作为指示微生物进行观察。
肝微粒体制备： 大鼠生前一般用多氯联苯进行肝微粒体酶诱 导，然后取肝脏组织制备匀浆，9000g离心，上 清液为S-9组分。使用时，再加入微粒体酶催化 作用中的辅助因子，即辅酶Ⅱ与6-磷酸葡萄糖， 此种混合物简称S-9混合液。
（二）生殖细胞突变
1、致死性影响
A、显性致死：突变配子与正常配子结合后，在着床前 或着床后的早期胚胎死亡
B、隐性致死：需要出现纯合子或半合子，才能出现死 亡之效应。
2、非致死性
可能出现显性或隐性遗传性疾病，包括先天性畸形， 在遗传性疾病频率与种类增多的同时，突变的基 因以及染 色体的损伤将使基因库（gene pool）的遗传负荷（gentic load）增加。
* 基因库：指一种物种的群体中，在生殖细胞具有，并能遗 传给下一代的全部基因的总和。
* 遗传负荷：指一种物种的群体中每一个体携带的可遗传给 下一代的有害基团的平均 水平。
四、化学致突变物的检测
（一）遗传学终点和试验配套 1 遗传学终点（genetic end point）： 指试验观察到的现象所反映的事件。 国际环境致突变物致癌物防护委员会 （ICPEMC）于1979年曾把致突试验按其观察的 遗传学终点分为四类：
呤置换或一种嘧啶置换另一嘧啶。
颠换（transversion）：一种嘌呤被一种嘧啶
置换或与此相反。 2．移码：是DNA中增加或减少了一对或几对 不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。 3．大段损伤：是DNA链大段缺失或插入。
（二）染色体畸变
1、染色体结构异常
A、染色体型畸变：两条染色单体同一位点受损 B、 染色单体型畸变：某一位点损伤只涉及姐妹 染色单体中一条。 （1）裂隙和断裂。
在有丝分裂时，使遗传物质滞留在核外而产生的细胞中主
核之外的遗传物质的颗粒，染色与细胞核一致，大小相当 于细胞直径的1／20～1／5。多数呈圆形，也有椭圆形，肾
形、环形等结构，边缘光滑整齐。
观察对象：嗜多染红细胞（PEC）中的微核发生率， PEC是红细胞成熟发育过程中的一个阶段，此时红 细胞主核已经排出，因细胞质内含有核糖体，Giemsa染色 后呈兰灰色，便于与成熟红细胞鉴别（成熟红细胞Giemsa
结构改变和数目改变。
2
配套的原则：
原核细胞与真核细胞相结合
生殖细胞与体细胞相结合
体内试验与体外试验相结合
其中心原则就是遗传学终点的齐全。
（二）重要的致突变试验
1 细菌回变试验 遗传学终点：基因突变 指示微生物： 突变的组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌与 突变的色氨酸缺陷型大肠肝菌。 原理： 特点：快捷、简便，48h左右即可得到结果， 且费用较低 。但没有动物体内代谢酶对受试物 的生物转化 。
试验时将被检化学物质、指示微生物、S-9混 合液混合，在琼脂培养基上培养，同时设不加被检 物的对照组。
试验组平皿上菌落数目为对照组自然突变数目 2倍以上者，才可作为阳性结果。根据一些化学物 试验结果，可检出1～500mg的致突变物质或致癌 物，较为灵敏。 推荐的菌株：1975年Ames推荐TA98、 TA100、TA1535、TA1537、TA1538.最低限度应 包括TA98、TA100。 1983年改为推荐TA97、TA98、TA100、 TA102
早期死Fra Baidu bibliotek胚胎数
致突变指数= 总着床数 早期死亡胚胎数 早期死亡胚胎率= 受孕雌性动物数 ×100% ×100
胎仔活产、死亡和吸收的特征
颜色 活产 胎仔 晚期 死胎 肉红色 灰红色 乌紫色 暗紫或 浅紫点 块 器官外形 完整成形 完整成形
自然 运动
有 无 无
对机械刺激的反应 有运动反应 无运动反应 ——
2. 动物接触被检物的时间：可为一次、5～7天或3个月。 其中3个月者效果较好。然后将雄性与雌性动物按1：2比例 交配，雌性动物不接触化学受试物。小鼠连续交配6周，大 鼠8周，每周更换一批雌鼠。
3. 观察指标
雌鼠受孕后12～13天剖腹取出子宫，检查并记录活胎数、 早期死亡胎数、晚期死亡胎数，并计算总着床数（可按早 期与晚期死亡胎数和活胎数计算）以及每只受孕动物平均 着床数。
（2）无着丝粒断片和缺失。
（3）环状染色体。 （4）倒位。 （5）插入、重复。
2、染色体数目异常
A、整倍性畸变：单倍体、三倍体、四倍体等
B、非整倍性畸变 ：比二倍体多或少一条染
色体。 如：缺体：缺少一对同源染色体。 2n－2
单体：指某一对同源染色体少一个。 2n－1 三体：指某一对同源染色体多一个。 2n＋1 四体：比同源染色体多一对。 2n＋2
（1）基因突变；
（2）染色体畸变； （3）不分离； （4）原发性DNA损伤。
1983年重新提出将致突变试验所反应的遗传学终点 分为5类： （1）DNA完整性的改变（形成加合物断裂、交 联）；
（2） DNA重排或交换；
（3）DNA碱基序列改变；
（4）染色体完整性改变；
（5）染色体分离改变。
其中（3）实际指基因突变，而（4）、（5）依次 指染色体
三、试验结果的评定
盲法观察 阴性对照 阴性结果的判定条件是：最高剂量应包括受试物溶 解度许可或灌胃量许可的最大剂量，如该剂量毒性很大， 则体内试验和细菌试验应为最大耐量； 各剂量组间差距 不应过大，以防漏检仅在狭窄范围内才有致突变能力的 某些外来化合物。 阳性对照 阳性结果应当有剂量反应关系，即剂量越大，致突 变效果越大，并在一组或多组的观察值与阴性对照之间 有显著差异。
优缺点：
Ames试验48～72小时可观察结果，费用较低。
与哺乳动物体内突变实际情况可能有差异，
如：微生物细胞中遗传密码仅为哺乳动物1／6，数 量少而简单。哺乳动物DNA修复系统远较微生物为复杂 而精巧。微生物无免疫机能，而哺乳动物则具备。 肝微粒体酶虽然是外来化合物在体内代谢转化中最 重要的酶类。但也有少数外来化合物代谢转化不在肝脏 进行。 例如致癌物苏铁素是在肠道中被活化，单独用Ames 法则不能检出其致突变性。
染色后呈桔红色），微核与细胞核一致，呈紫红色或紫兰
色。 每只小鼠要求观察1000个PCE，记录其微核发生率， 结果阳性说明受试物具有致突变作用。 正常小鼠PCE发生率为1～3‰。
6 精子畸形试验
原理：
Krzzanowska认为“Y-性连锁基因控制畸形精子的 数量，常染色体控制精子的表形，如上述基因发生突变， 或性-常染色体易位，就是化合物诱发精子畸形率增高的主 要因素。
3 姊妹染色单体交换（sister chromatid exchange， SCE） 试验
遗传学终点：①染色体完整性改变②DNA重排或交换
4 显性致死突变试验（dominant lethal mutation test）
遗传学终点：染色体完整性改变 原理：通过哺乳动物生殖细胞染色体畸变进行的致 突变作用试验。哺乳动物生殖细胞染色体发生突变时，往 往不能与异性生殖细胞正常结合，易出现受精卵在着床前 死亡和胚胎早期死亡。显性致突变的机理可能是生殖细胞 染色体的断裂和易位。 1. 试验动物：多用雄性大鼠或小鼠进行。
二、化学诱变的分子机理
(一)直接以DNA为靶的诱变
1、碱基类似物（base analogue）取代 2、烷化剂的影响 3、改变或破坏碱基的化学结构 4、平面大分子嵌入DNA链 (二)不以DNA为靶的间接诱变 1、纺锤体抑制 2、对酶促过程的作用
三、 突变的后果
（一）体细胞突变的后果
1．致癌问题 2．导致畸形 3．可能与动物粥样硬化症有关 4．可能是衰老的起因：
第六章 外来化合物致 突变作用及其评价
一、诱发突变的类型 （一）基因突变（gene mutation）
（二）染色体畸变
基因突变是染色体上一个或几个基因的变化，
即遗传物质在分子水平上的改变，有碱基置换， 移码和大段损伤
1．碱基置换：是某一碱基对性能改变或脱落而引 起的突变
转换（transition）：原来的嘌呤被另一种嘌
胎盘 红色
较大
灰红 较小 暗紫
早期 死胎
吸收 台
未完整成 形
不能辨认 胚胎和胎 盘
——
——
不能辨认
5 微核试验
遗传学终点：：①染色体完整性改变②染色体分离改变 原理： 正常细胞在有丝分裂中期时，染色体均排列在赤道
板附近，分裂后期便分成两份向两极移动，并在末期形成
两个子细胞核。微核是由于某些物理或化学因素的作用， 使细胞内染色体断裂产生无着丝点断片或纺锤体受影响而
2 Ames试验： 指鼠伤寒沙门氏菌／哺乳动物微粒 体酶试验，由Ames首先建立。 原理：在细菌回变试验的基础上，首先将受试 物与肝微粒体在体外进行代谢活化，再以营养缺 陷型鼠伤寒沙门氏菌作为指示微生物进行观察。
肝微粒体制备： 大鼠生前一般用多氯联苯进行肝微粒体酶诱 导，然后取肝脏组织制备匀浆，9000g离心，上 清液为S-9组分。使用时，再加入微粒体酶催化 作用中的辅助因子，即辅酶Ⅱ与6-磷酸葡萄糖， 此种混合物简称S-9混合液。
（二）生殖细胞突变
1、致死性影响
A、显性致死：突变配子与正常配子结合后，在着床前 或着床后的早期胚胎死亡
B、隐性致死：需要出现纯合子或半合子，才能出现死 亡之效应。
2、非致死性
可能出现显性或隐性遗传性疾病，包括先天性畸形， 在遗传性疾病频率与种类增多的同时，突变的基 因以及染 色体的损伤将使基因库（gene pool）的遗传负荷（gentic load）增加。
* 基因库：指一种物种的群体中，在生殖细胞具有，并能遗 传给下一代的全部基因的总和。
* 遗传负荷：指一种物种的群体中每一个体携带的可遗传给 下一代的有害基团的平均 水平。
四、化学致突变物的检测
（一）遗传学终点和试验配套 1 遗传学终点（genetic end point）： 指试验观察到的现象所反映的事件。 国际环境致突变物致癌物防护委员会 （ICPEMC）于1979年曾把致突试验按其观察的 遗传学终点分为四类：
呤置换或一种嘧啶置换另一嘧啶。
颠换（transversion）：一种嘌呤被一种嘧啶
置换或与此相反。 2．移码：是DNA中增加或减少了一对或几对 不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。 3．大段损伤：是DNA链大段缺失或插入。
（二）染色体畸变
1、染色体结构异常
A、染色体型畸变：两条染色单体同一位点受损 B、 染色单体型畸变：某一位点损伤只涉及姐妹 染色单体中一条。 （1）裂隙和断裂。
在有丝分裂时，使遗传物质滞留在核外而产生的细胞中主
核之外的遗传物质的颗粒，染色与细胞核一致，大小相当 于细胞直径的1／20～1／5。多数呈圆形，也有椭圆形，肾
形、环形等结构，边缘光滑整齐。
观察对象：嗜多染红细胞（PEC）中的微核发生率， PEC是红细胞成熟发育过程中的一个阶段，此时红 细胞主核已经排出，因细胞质内含有核糖体，Giemsa染色 后呈兰灰色，便于与成熟红细胞鉴别（成熟红细胞Giemsa
结构改变和数目改变。
2
配套的原则：
原核细胞与真核细胞相结合
生殖细胞与体细胞相结合
体内试验与体外试验相结合
其中心原则就是遗传学终点的齐全。
（二）重要的致突变试验
1 细菌回变试验 遗传学终点：基因突变 指示微生物： 突变的组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌与 突变的色氨酸缺陷型大肠肝菌。 原理： 特点：快捷、简便，48h左右即可得到结果， 且费用较低 。但没有动物体内代谢酶对受试物 的生物转化 。
试验时将被检化学物质、指示微生物、S-9混 合液混合，在琼脂培养基上培养，同时设不加被检 物的对照组。
试验组平皿上菌落数目为对照组自然突变数目 2倍以上者，才可作为阳性结果。根据一些化学物 试验结果，可检出1～500mg的致突变物质或致癌 物，较为灵敏。 推荐的菌株：1975年Ames推荐TA98、 TA100、TA1535、TA1537、TA1538.最低限度应 包括TA98、TA100。 1983年改为推荐TA97、TA98、TA100、 TA102
早期死Fra Baidu bibliotek胚胎数
致突变指数= 总着床数 早期死亡胚胎数 早期死亡胚胎率= 受孕雌性动物数 ×100% ×100
胎仔活产、死亡和吸收的特征
颜色 活产 胎仔 晚期 死胎 肉红色 灰红色 乌紫色 暗紫或 浅紫点 块 器官外形 完整成形 完整成形
自然 运动
有 无 无
对机械刺激的反应 有运动反应 无运动反应 ——
2. 动物接触被检物的时间：可为一次、5～7天或3个月。 其中3个月者效果较好。然后将雄性与雌性动物按1：2比例 交配，雌性动物不接触化学受试物。小鼠连续交配6周，大 鼠8周，每周更换一批雌鼠。
3. 观察指标
雌鼠受孕后12～13天剖腹取出子宫，检查并记录活胎数、 早期死亡胎数、晚期死亡胎数，并计算总着床数（可按早 期与晚期死亡胎数和活胎数计算）以及每只受孕动物平均 着床数。
（2）无着丝粒断片和缺失。
（3）环状染色体。 （4）倒位。 （5）插入、重复。
2、染色体数目异常
A、整倍性畸变：单倍体、三倍体、四倍体等
B、非整倍性畸变 ：比二倍体多或少一条染
色体。 如：缺体：缺少一对同源染色体。 2n－2
单体：指某一对同源染色体少一个。 2n－1 三体：指某一对同源染色体多一个。 2n＋1 四体：比同源染色体多一对。 2n＋2
（1）基因突变；
（2）染色体畸变； （3）不分离； （4）原发性DNA损伤。
1983年重新提出将致突变试验所反应的遗传学终点 分为5类： （1）DNA完整性的改变（形成加合物断裂、交 联）；
（2） DNA重排或交换；
（3）DNA碱基序列改变；
（4）染色体完整性改变；
（5）染色体分离改变。
其中（3）实际指基因突变，而（4）、（5）依次 指染色体