B-内酰胺酶的检测方法

牛乳中非法添加β-内酰胺酶检测方法

随着国家对食品安全问题的关注和部分乳制品企业2010年无抗奶目标的提出，抗生素残留问题成为影响乳制品安全的重要因素之一。目前，青霉素作为β- 内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选药物，是牛奶中最常见的残留抗生素。由于国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购的原则，出于经济利益的驱动，一些不法奶站为了谋求自己的经济利益，人为的使用一些生物制剂去降解牛乳中残留的抗生素，生产人造“无抗奶”。2005年至今，已有数家公司公开宣称出售分解牛乳中残留抗生素的解抗剂。迄今为止，还没有针对这种人造“无抗奶”的相应检测方法、检测标准，无法从源头上监测、把控原奶质量。
奶制品中三聚氰胺问题出现后，检科院按照国家局科技司的安排，对奶制品中可能的添加物进行了调查。经过前期的调研工作，初步判断市售解抗剂的主要成分是β-内酰胺酶，它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的β- 内酰胺类抗生素。β-内酰胺酶为我国不允许使用的食品添加剂,该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。β-内酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费者的身体健康带来危害。
微生物方法和理化方法均利用β-内酰胺酶能够裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸的原理检测乳制品中是否添加解抗剂。
一、 理化方法
（一）高效液相色谱法
1、间接法
方法原理：利用β-内酰胺酶能够酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定浓度的β-内酰胺酶，那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度会减少，从而判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶。
实验步骤：称取20 g试样，在4℃、16000rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管，并将塑料离心管置于37℃水浴锅中振荡孵育30 min。向孵育后的离心管中加入无水乙醇15 mL。振荡提取30 min后离心，将上层清液过滤纸后收集于梨形瓶中。减压浓缩蒸发掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸盐缓冲液（pH=8.5），涡旋1 min后调节pH为8.5。以1 mL/min的速度将提取液通过经过预处理的Oasis HLB固相萃取柱，用2 mL磷酸缓冲液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2 mL水淋洗。最后用3 mL乙腈洗脱。将洗脱液在40℃下氮气吹干，用0.025 M磷酸盐缓冲液（pH=7.0）定容残渣至1 mL,待上机测定。
色谱条件：色谱柱 Agilent Zorbax SB C18，4.6mm×150mm×5μm；
流动相 甲醇/0.004 M磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60；
检测波长

268 nm
讨论：该方法只能给出定性结论即牛奶中是否含有β-内酰胺酶，而无法给出确切定量结果即牛奶中含有β-内酰胺酶的量（U/ml）；前处理方法相对复杂、费时。

2、直接法
方法原理：牛乳中的青霉素钾在β-内酰胺酶的作用下，主要生成青霉噻唑酸钾，并伴随生成少量的青霉胺、青霉醛等物质。经去脂肪、蛋白等前处理后，可以将青霉噻唑酸钾提取出来，经高效液相色谱仪检测确认其是否存在，从而判定该牛乳是否为人造“无抗奶”。
实验步骤：称取20 g试样，在4 ℃、16000 rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管，加入无水乙醇15 mL，振荡提取30 min后离心，取清液经0.45 μm的滤膜过滤，用高效液相色谱仪检测。
标准溶液配制：称取0.01 g（精确至0.001 g）青霉素钾于100 ml容量瓶中，加入1ml市售抗生素分解剂，室温放置2h使青霉素钾酶解完全后用去离子水定容，得到青霉噻唑酸钾标准溶液，浓度100 μg/mL。根据实际情况稀释后使用。
色谱条件：色谱柱 Agilent Zorbax SB C18，4.6mm×150mm×5μm；
流动相 甲醇/0.004 M磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60；
检测波长 230 nm
讨论：该方法通过检测酶解产物青霉噻唑酸，只能给出定性结论即牛奶中是否含有β-内酰胺酶，而无法给出确切定量结果即牛奶中含有β-内酰胺酶的量（U/ml）；青霉噻唑酸钾稳定性尚需进一步考察；实验成本较生物学方法高。
二）碘量法
方法原理：如果牛奶中含有β-内酰胺酶，β-内酰胺酶分解青霉素后产生的青霉噻唑酸与淀粉竞争游离碘，破坏了碘与淀粉的蓝色复合物，使蓝色变为无色，从而判断牛奶中是否掺有抗生素分解酶。
实验步骤：取1 ml 牛奶于一小试管中，加入不同浓度β-内酰胺酶溶液，加入250 ppm青霉素V钾磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钾2.0g、磷酸二氢钾8.0g，蒸馏水定容至1L，在115℃灭菌30分钟）40 μl，在37℃水浴中放置30分钟，不时摇动，加入1%淀粉溶液500 μl，摇匀，加入碘液(碘化钾20g，碘5g，蒸馏水定容至250ml )20 μl，在37℃水浴中放置2分钟观察结果。同时做空白对照实验。
结果判定：在2分钟内能使蓝色完全消退的为β-内酰胺酶阳性，不消退者为阴性。即蓝色为阴性，白色为阳性。
讨论：碘量法作为快速筛选方法，每次实验均需要阳性和阴性对照；对反应时间等条件要求较严格，否则容易造成误判；不同牛奶样品实验现象差别较大，还需进一步研究。

二、 微生物方法
1 材料
1.1 菌株 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001购自国家医学菌种保藏管理中心，在营养琼脂上传代培养备用。
1.2 培养基 营养琼脂培养基、抗生素检测用培养基Ⅱ（低PH）购

自陆桥。
1.3 试剂 试验用10U青霉素药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；舒巴坦、青霉素G、β-内酰胺酶标准品、生鲜牛乳抗生素分解剂、脱脂奶粉、生理盐水
1. 4 主要仪器 牛津杯（外径8mm）
2 方法
2.1 预试验
2.1.1 抗生素检测用培养基制备
90mm培养皿铺10ml抗生素检测用培养基Ⅱ（含1×108CFU/ml藤黄微球菌）。
2.1.2 生鲜牛乳抗生素分解剂活性分析
将10U青霉素药敏纸片均匀贴在抗生素检测用培养基表面，其中3片纸上滴加20ul不同稀释度的抗生素分解剂（500万U/ml，50万U/ml，5万U/ml），同时做生理盐水和青霉素药敏纸片对照。37℃培养18-22小时。测量抑菌圈直径。
将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。10天后重复试验。
2.1.3 青霉素G浓度的选择
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul含有不同浓度（0IU/ml，0.005IU/ml，0.05IU/ml，0.5IU/ml，5IU/ml）青霉素G的生理盐水，37℃培养18-22小时。测量抑菌圈直径，以确定青霉素G使用浓度。
2.1.4 β-内酰胺酶对菌生长的影响
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul含有不同浓度（0U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml，50万U/ml，75万U/ml，125万U/ml，250万U/ml）β-内酰胺酶的生理盐水，37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。
2.1.5 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G和不同浓度β-内酰胺酶（0U/ml，4U/ml，40U/ml，200U/ml，300U/ml，400U/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。
将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。10天后重复试验。
2.1.6 脱脂奶对实验效果的影响
使用10%（w/v）脱脂奶代替生理盐水重复2.1.3、2.1.4、2.1.5实验。观察实验结果。
2.1.7 舒巴坦浓度的选择（未完成，实验参数待验证）
有实验表明，在10%脱脂奶中添加12.5-800ug/ml舒巴坦进行测试发现，含有200ug/ml舒巴坦的脱脂奶在抗生素检测用培养基上不产生抑菌圈；含有25ug/ml舒巴坦可有效抑制10%脱脂奶中400U/mlβ-内酰胺酶对0.5ug/ml青霉素G的分解作用。
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同浓度舒巴坦（0ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，400ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察是否产生抑菌圈，以确定舒巴坦最高可适用浓度。
在青霉素G浓度（～0.5ug/ml）和舒巴坦最高适用浓度（～200ug/ml）确定的基础上，在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G、400U/mlβ-内酰胺酶（高

于推荐使用浓度100倍）和不同浓度舒巴坦（0ug/ml，25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察产生抑菌圈情况，以确定舒巴坦最终适用浓度。
2.1.8 脱脂奶中β-内酰胺酶的测定（未完成，实验参数待验证）
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶（添加成分见表1），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。
表1
编号 0.5ug/ml青霉素G 400U/mlβ-内酰胺酶 25ug/ml舒巴坦 结果预测
（是否产生抑菌圈）
1 ＋ － － 有
2 ＋ － ＋ 有
3 ＋ ＋ － 无
4 ＋ ＋ ＋ 有
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶（添加成分见表1），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。

2.1.9 β-内酰胺酶检测限的测定（未完成）
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素、25ug/ml舒巴坦和不同浓度β-内酰胺酶（0.4U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。
2.2 牛奶样品中β-内酰胺酶的测定
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶（添加成分见表2），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。同时做脱脂奶中β-内酰胺酶的测定。
表2
编号 0.5ug/ml青霉素G 400U/mlβ-内酰胺酶 25ug/ml舒巴坦 抑菌圈 与1号比直径差异 结果预测
1 ＋ － － 有
2 ＋ － ＋ 有 ≥3mm
≤3mm 含β-内酰胺酶
不含β-内酰胺酶
3 ＋ ＋ － 无
4 ＋ ＋ ＋ 有
5 － － ＋ 无
6 － － － 有/无 含抗生素/不含抗生素

3 实验结果与分析
3.1 预实验结果与分析
3.1.1 生鲜牛乳抗生素分解剂活性结果观察与分析

第一次实验 10天后第二次实验 青霉素对照
第一次实验5万U/ml抗生素分解剂部分分解青霉素，与青霉素对照组比较抑菌圈明显变小；50万U/ml抗生素分解剂可以完全分解青霉素，不产生抑菌圈。
10天后第二次实验50万U/ml抗生素分解剂部分分解青霉素，与青霉素对照组比较抑菌圈明显变小。
第一次实验和第二次实验结果比较，抗生素分解剂活性下降至少1个数量级。

3.1.2

青霉素G浓度的选择

0.5IU/ml青霉素产生抑菌圈约为22mm，符合实验要求。

3.1.3 β-内酰胺酶对菌生长的影响

极高浓度β-内酰胺酶不影响菌生长。

3.1.4 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响

第一次实验结果 10天后第二次实验结果
第一次实验中，4U/mlβ-内酰胺酶即可部分分解0.5IU/ml青霉素，与对照组比较抑菌圈明显减小。
10天后第二次实验，200U/mlβ-内酰胺酶可部分分解0.5IU/ml青霉素，与对照组比较抑菌圈明显减小。但4U/mlβ-内酰胺酶组产生的抑菌圈与对照组比较无明显区别。
通过第一次实验和第二次实验结果比较，说明抗生素分解剂活性下降。