一些酶常用活力测定方法
酶活力测定
酶活力测定
酶是一种能够催化生物体内化学反应的蛋白质，广泛存在于动植物、微生物、真菌等
生物体内。
酶在生理代谢、免疫系统、消化系统等方面扮演着重要的角色。
因此，对于酶
的活力测定十分重要。
下面将详细介绍酶活力测定方法。
酶活力测定的基本原理是通过测定一个给定反应体系下酶所催化的底物转化速度来确
定酶的活力。
酶活力的测定通常采用标准曲线法、比色法、荧光法、放射性同位素标记法、酶电极法等多种方法。
其中，比色法和荧光法是最为常用的两种方法。
二、比色法
比色法是通过反应体系中某一底物和产物的比色反应来测定酶的活力。
常用的比色反
应有蛋白质和氨基酸比色法、尿素酶测定法等。
以蛋白质和氨基酸比色法为例，其测定步骤如下：
1. 选定底物，例如眼镜蛇毒素，反应物为酸性的巴氏液
2. 选定测定时点，例如反应20分钟之后
3. 加入颜色试剂，例如Folin验液，使反应产生深色络合体
4. 测定吸光度，根据标准曲线计算出反应深度，从而计算出酶的活力值
三、荧光法
荧光法是通过酶催化的底物转化产生的荧光信号来测定酶活力。
荧光法具有高灵敏度、高精度、高速度、低误差等优点，越来越受到人们的关注。
1. 选择荧光素为底物，荧光素在激发光的作用下会发出荧光信号
2. 酶催化荧光素转化为羟基荧光素，生产出更强的荧光信号
四、注意事项
酶活力测定的过程中需要注意以下几个方面：
1. 选择适当的反应体系、底物和试剂
2. 在测定前保持合适的反应条件（例如pH、温度等）
3. 为了获得比较准确的测定结果，需要进行多次测定
4. 保证测定设备和试剂的质量和准确性。
酶活力测定方法
蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。
纤维素酶DNS酶活力测定方法DNS, 活力, 纤维素酶, 测定1 定义1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。
2 原理纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。
3.试剂和溶液3.1 1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定）3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M 盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。
取滤液100ml，20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。
3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定）4仪器和设备4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃)4.2分光光度计含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。
5测定步骤5.1 标准曲线绘制分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。
各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。
冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。
以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。
酶活力的测定 国标
木瓜蛋白酶活力的测定一、试剂与溶液1. 三氯乙酸称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。
2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL）精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。
吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。
3. 氢氧化钠溶液（20g/L）称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。
待溶液到室温后，以水定容至100mL，搅拌均匀。
4. 盐酸溶液1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。
0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。
5. 酪蛋白溶液（10.0g/L）称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。
冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。
使用前重新确认并调整pH至规定值。
二、分析步骤1. 标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。
L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。
表1 L-酪氨酸标准溶液分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。
以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。
利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。
其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。
2. 样品的测定待测酶液的制备：称取酶样品1g。
然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。
测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：试管A（空白）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度试管B（酶试样，需三个平行样）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度三、计算过程从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。
DNS法测定α-淀粉酶活力的方法
蒸馏水 （mL）2.0 1.6 Nhomakorabea1.2 0.8 0.4 0
麦芽糖含量 （mg）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
DNS试剂 （mL）
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
加入完成混匀后沸水浴5min，定容至25mL混匀比色。
预留发酵液酶活力测定 需要稀释倍数
10、100、1000、10000、 50000…… 对照设置1个就可以，10或100倍； 按照DNS方法测定。
酶 活 力 测 定 步 骤 （ 流 程 ）
1ml稀释酶液 40℃水浴保温5min
加入2.0mlDNS 40℃水浴保温10min
加入1.0ml1%淀粉溶液 （预先40℃水浴保温5min）
沸水浴5min 冷却定容至25ml
540nm作比色调 “0”、“100”用
1ml稀释酶液 40℃水浴保温5min
加入1.0ml1%淀粉溶液 （预先40℃水浴保温5min）
调和浓度稀释——系列溶液的浓度为连续 排列整数的倒数（1，1/2，1/3，1/4， 1/5……）。
α-淀粉酶酶活力测定的原理
底物（反应物）为淀粉——碘比色法（反 应一定量淀粉为糊精的时间） 产物为麦芽糖、糊精等——麦芽糖为还原 糖，可以用测定还原糖的方法来测定其生 成量（如DNS法），从而计算出酶活力单 位。
40℃水浴保温10min
加入2.0mlDNS 沸水浴5min
冷却定容至25ml
540nm比色测定 OD值
代入回归方程计算出麦芽糖生成量
计算公式
酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为40 ℃ ， pH5.6或6.0），1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶 量定义为1个酶活力单位。
α-淀粉酶（酶 U/活 m ）L 麦 力芽糖毫 N 10
纤维素酶的三种活力测定方法
纤维素酶的三种活力测定方法纤维素酶是一种广泛存在于自然界中的酶类，具有重要的降解纤维素的功能。
对于工业生产、环境保护及生物能源等领域都有着极为广泛的应用。
因此，纤维素酶的测定方法也越来越受到研究者的关注。
本文将针对纤维素酶的三种活力测定方法进行详细介绍。
一、滴定法滴定法是最为简单、传统的纤维素酶活力测定方法。
其操作步骤相对较简单，但由于其受试物中的葡萄糖数量较小，因此准确度不如其他测定方法。
滴定法的具体操作步骤如下：1.采用苯酚褐或者硫酸铜-硫氰化钾将葡萄糖转化为光滑葡萄糖2.使用离子交换树脂净化试样3.通过酸水解，将可分离出的光滑葡萄糖转化为葡萄糖4.通过NaOH溶液中添加试样，测定试样所需要的NaOH溶液的体积二、反向相色谱法反向相色谱法是一种基于色谱技术的测定方法。
比滴定法更加准确且可靠。
反向相色谱法可以通过改变样品与固相载体的交互时间，实现对样品组分的分离。
其操作步骤如下：1.使用有机溶剂混合纤维素样品2.净化溶液，分离部分有机溶剂和水3.试样在反向相色谱柱上，随柱子流动4.通过检测器检测滴量，确定样品的浓度三、淀粉-纤维素显色法淀粉-纤维素显色法是一种基于酶法和化学显色技术结合的测定方法。
其同时测定酶反应的数量和反应的速率，可以获得相对准确的数据。
具体操作过程如下：1.样品中的淀粉与纤维素同时与碘反应2.通过求字头光度的变化及测试时间的变化，测定酶的活力3.以酶动力学为基础，通过数据分析得到相应的酶反应速率总结起来，以上三种方法均可用于纤维素酶的活力测定。
针对不同的需求，可以选择适当的方法进行测定。
其中，受试物的纯度和净化程度是影响精度的关键因素，因此在测定前要进行适当的纯化。
在生产过程中，可以选择淀粉-纤维素显色法作为主要测定方法，以保证产物质量的稳定性和可控性。
淀粉酶、α酶、β酶活力的测定
三、材料、仪器与试剂
(2) 0.1MOL/L PH=5.6的柠檬酸缓冲液A液：(0.1MOL/L柠檬酸)： 称取C6H8O7·H2O 21.01克，用蒸馏水溶解并定容至1L。B液： (0.1MOL/L柠檬酸钠)：称取NA3C6H5O7 · 2H2O 29.41克，用蒸馏水 溶解并定容至1L。取A液55毫升与B液145毫升混匀，即为0.1MOL/L PH=5.6的柠檬酸缓冲液。 (3)1%淀粉溶液：称取1克淀粉溶于100ML 0.1MOL/L PH=5.6的柠檬 酸缓冲液中。
Α-淀粉酶活力的测定
一、实验目的 二、实验原理 三、材料、仪器与 试剂 四、操作步骤 五、结果处理 六、思考题
一、实验目的：
• 学习和掌握测定α-淀粉酶活力的原理和方法
二、实验原理：
总淀粉酶活力测定过程中提取的淀粉酶原液主要包括Α-淀粉酶和Β-淀粉酶两种。 两种淀粉酶特性不同，A-淀粉酶不耐酸，在 PH=3.6的环境下以下迅速钝化。 Β 淀粉酶不耐热，在70°C环境下15分钟后就会钝化。根据它们的这种特性，在测定 活力时钝化其中之一，就可测出另-种淀粉酶的活力。 • 实验二采用加热的方法钝化Β -淀粉酶，测出A-淀粉酶的活力。 • 实验三采用加酸的方法钝化A-淀粉酶，测出Β -淀粉酶的活力。
四、操作步骤：
1.淀粉酶液的制备： 称取1g萌发3天的小麦种子(芽长约1cm)，置于研钵中，加入少量石英 砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆转入100mL容量瓶中，用蒸馏水定 容到100mL。在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟摇动1次，使 其充分提取。取适量在3000r/min转速下离心10min，上清液即为淀粉 酶原液，稀释后用于淀粉酶总活力测定(稀释倍数依具体情况而定)。
(2)还原糖测定： 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温。用蒸馏水定容至20mL， 加塞后颠倒混匀。在分光光度计上(波长540nm)进行比色。
酶活性测量的方法有哪几种
酶活性测量的方法有哪几种酶活性测量是评估酶在特定条件下，催化底物转化为产物的能力的一种方法。
根据不同的酶特性和底物/产物的特性，可以使用多种方法来测量酶的活性。
以下是常见的酶活性测量方法：1. 比色法：比色法是最常用的测量酶活性的方法之一。
在酶催化底物转化为产物之后，产生的有色化合物可以通过分光光度计来测量其吸光度。
比色法适用于各种酶的测量，包括氧化还原酶、氨基酸酶等。
2. 荧光法：荧光法是利用酶底物转化为产物之后所产生的荧光来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入荧光染料，通过测量荧光信号的强度来定量酶活性。
荧光法对于具有较高灵敏度要求的酶活性测量非常有用，例如蛋白酶、DNA酶等。
3. 发光法：发光法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的光来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入发光底物或荧光染料，通过测量其发光强度来测量酶活性。
发光法对于对时间分辨率要求较高的酶活性测量非常有用，例如ATP酶、NADH酶等。
4. 放射性法：放射性法是利用酶催化底物转化为产物后所释放的放射性物质测量酶活性的方法。
该方法需要在底物或产物中引入放射性同位素，通过测量其放射性强度来定量酶活性。
放射性法对于具有极高灵敏度要求的酶活性测量非常有用，例如DNA聚合酶、RNA酶等。
5. 电化学法：电化学法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的电流来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入可反应的电活性物质，通过测量电流来定量酶活性。
电化学法对于某些具有电催化酶活性的酶测量非常有用，例如葡萄糖氧化酶、酒精脱氢酶等。
6. 色谱法：色谱法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的物质在色谱柱上的分离来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入特定的标记物质，通过测量标记物质在色谱图谱上的峰面积或峰高度来定量酶活性。
色谱法对于某些底物或产物具有特定的分离性质的酶活性测量非常有用，例如激酶、酮糖酶等。
5酶类药物的分析检验
3.时间对照 若酶制剂不纯(含有产物)和底 物自发分解的情况并存，则必须做一个酶和底物 都加入但反应时间为零的对照，也即先用蛋白沉 淀剂或其它试剂停止反应，再加入底物。 在双底物反应时，对照管可以加入酶制剂和 两种底物中的一种，因缺乏另一种底物，不可能 生成产物，至于应加入两种底物中的哪一种可以 根据预实验决定。 测定管中的产物量必须减去对照管中的产物 才是真正由酶促反应所生成的产物量。
（二）酶活力测定的方法：
酶活力测定要符合两个原则： ①在零级反应期测定，即-〔s〕或〔p〕与 反应时间t成正比， ②反应速度与酶量成线性关系，即 〔E〕= k(-〔s〕/ t) = k〔p〕/ t k(k〔 常用的方法有： 1.定时法 2.连续检测法 3.平衡法
如何测定酶活力？ 如何测定酶活力？
以产物浓度对反应时间作图， 以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反 应速度曲线
产 物 浓 度
注意：初速度的 注意： 测定是关键， 测定是关键，为 什么？ 什么？
0
时间
可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着时间的延长，反应速度逐渐下降 随着时间的延长，
国际单位的应用有利于比较同一样品中不同酶的活力。 但也有不少缺点，如 ：①从惯用单位换算成国际单位比较麻 烦；②某些酶作用于Mr不明的大分子底物(如淀粉酶、胃蛋白 酶等)，采用底物减少法来定量时，无法计算其底物减少的微 摩尔数；③ 同一种酶用不同的方法测定，换算成国际单位时， 其结果仍不相同。欧美各国由于地理条件及实验室内温度的 不同，常采用不同的测定温度，如25℃、30℃、37℃等，这 也导致即使用国际单位表示酶活力，其正常参考范围也是不 同的。
【重点掌握】 重点掌握】
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
6-磷酸-葡萄糖脱氢酶(G6PDH)、苹果酸酶(ME)两种酶酶活测定方法
6-磷酸-葡萄糖脱氢酶(G6PDH)、苹果酸酶(ME)两种酶酶活测定方法(1)6-磷酸-葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活力测定6-磷酸-葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活力测定方法根据文献略有改动6979。
测定反应体系(5ml)为：0.1mI浓度为1M的Tris-HCl缓冲液、0.1ml 浓度为25mM的底物G-6-P溶液、0.1ml浓度为2mM的NADP+、0.1ml 浓度为0. 2 M的氯化镁溶液及2.5ml ddH20，混合均匀后，在340 nm 下测定吸光度值A0，作为空白值。
再加入0.1 ml粗酶液，摇匀后，与25℃条件下保温，每30S于340 nm下测定吸光度值A，连续测定4 min。
以A对时间作图，取反应最初线性部分计算△A值。
根据公式计算酶活力。
酶活力单位(U)定义为：25℃条件下，每分钟G6PDH催化生成1μmol NADH的酶量为一个单位。
式中：△A/min为340 nm处每分钟吸光度的变化值；V为酶促反应体积(mL)；为NADH的摩尔消光系数(6.22×103L／mol·cm-1)；b 为比色皿光程(cm)。
(2)苹果酸酶(ME)活力测定测定反应体系(3ml)为：0.5 mI浓度为0.4 M的Tris-HCl缓冲液、0.1 ml 浓度为30 mM的底物苹果酸溶液、0.2ml浓度为3.4 mM的NADP+、0.1ml浓度为0.12 M的氯化镁溶液及2 ml ddH20，混合均匀后，在340 nm下测定吸光度值A0，作为空白值。
再加入0.1 ml粗酶液，摇匀后，与250C条件下保温，每30s于340 nm下测定吸光度值A，连续测定4 min。
以A对时间作图，取反应最初线性部分计算△A值。
根据公式2-1计算酶活力。
酶活力单位(U)定义为：25℃条件下，每分钟ME催化生成1μmol NADH的酶量为一个单位。
各种酶活力测定方法及注意事项
各种酶活⼒测定⽅法及注意事项碱性蛋⽩酶及各种蛋⽩酶活⼒测定⽅法及测定有感因长期测定碱性蛋⽩酶酶活⼒与⾓蛋⽩酶活⼒与胶原酶活⼒和弹性蛋⽩酶活⼒，碱性蛋⽩酶活⼒测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可⼤⼤减少误差。
其余酶活⼒测定过程中因⽆统⼀标准且底物差异⼤，导致长期酶活⼒测定的混乱，各种酶活⼒测定⽅法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活⼒只能仅作参考。
以下是各种蛋⽩酶活⼒测定⽅法及标曲绘制：碱性蛋⽩酶测定⽅法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋⽩酶活⼒测定福林法以下是⽅法碱性蛋⽩酶的测定⽅法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进⾏，即 1 个酶活⼒单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min ⽔解酪蛋⽩产⽣ 1 µg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。
2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。
表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（µg/mL）取 100 µg/mL 酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取⽔的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使⽤液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃⽔浴锅中显⾊ 20 min，⽤分光光度计于波长 680 nm，10mm ⽐⾊⽫，以不含酪氨酸的反应管作为空⽩，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。
图 2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或⽤回归⽅程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（µg），既为吸光度常数 K 值。
脂肪酶活力测定方法及其比较
脂肪酶活力测定方法及其比较一、本文概述脂肪酶是一类能够催化脂肪酸酯水解的酶类，广泛存在于动物、植物和微生物中，其在生物体内起着重要的代谢作用。
脂肪酶活力测定方法的研究对于了解脂肪酶的催化性质、生物合成、调控机制以及在工业、医药和农业等领域的应用具有重要意义。
本文旨在介绍常见的脂肪酶活力测定方法，包括滴定法、比色法、荧光法、高效液相色谱法等，并比较它们的优缺点，以期为读者提供一个全面、系统的脂肪酶活力测定方法参考。
通过本文的阐述，读者可以了解各种测定方法的基本原理、操作步骤、适用范围以及注意事项，从而根据自身研究需求选择最合适的测定方法。
本文还将探讨脂肪酶活力测定方法的未来发展趋势，以期为相关领域的研究提供有益的参考和启示。
二、脂肪酶活力测定的基本原理脂肪酶活力测定主要基于脂肪酶水解脂肪酸的特性，通过测量水解产物的生成速率来评估酶的活性。
脂肪酶是一种能够催化脂肪酸酯水解的酶，其催化反应可以表述为：脂肪酶 + 脂肪酸酯→脂肪酸 + 醇。
在测定脂肪酶活力时，通常使用特定的底物，如三乙酸甘油酯（p-nitrophenyl butyrate）或橄榄油等，这些底物在脂肪酶的作用下会水解生成相应的脂肪酸和醇。
在测定过程中，通常使用比色法、滴定法或高效液相色谱法等方法来检测水解产物的生成量。
例如，当使用p-nitrophenyl butyrate 作为底物时，水解产生的p-nitrophenol在碱性条件下会呈现黄色，其颜色深浅与浓度成正比，因此可以通过比色法来测定其浓度，从而推算出脂肪酶的活力。
不同的测定方法具有各自的优缺点，比如比色法操作简便，但可能受到颜色干扰和pH值变化的影响；滴定法则需要精确的化学计量和反应条件控制；高效液相色谱法则具有更高的灵敏度和准确性，但设备成本较高，操作相对复杂。
因此，在选择脂肪酶活力测定方法时，需要根据实验条件和目的来综合考虑各种因素。
脂肪酶活力测定的结果还受到多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、反应温度、pH值等。
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法有多种，下面列举常用的几种方法：
1. 比色法：通过测定酶反应产生的可见光吸收或色素形成来间接测定酶活力。
常用的比色法有尼林蓝法、间苯二酚法、对苯二酚法等。
2. 发光法：利用酶催化的氧化还原反应产生的发光信号来测定酶活力。
常用的发光法有荧光发光法、葡萄糖氧化酶法等。
3. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。
4. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。
5. 凝胶电泳方法：通过观察酶在凝胶上的迁移距离或酶活性的带状图案的强度来测定酶活力。
6. 标记物法：利用酶催化与标记物反应产生的物质变化来测定酶活力，常用的标记物有放射性同位素、酶标记物等。
以上是常用的酶活力测定方法，不同方法适用于不同类型的酶和反应体系。
在实
际应用中，需要根据具体情况选择最合适的方法来测定酶活力。
酶活力的测定方法
谢谢大家！
A.4.2
DNS试剂配制标准
A.4.2.1 Ghose法 DNS试剂的配制 甲液：将6.9 g结晶苯酚溶于15.2 mL10%NaOH溶 液，蒸馏水稀释至69 mL，在此溶液中加入6.9 g亚硫酸 氢钠。 乙液：将255 g酒石酸钾钠溶于300 mL10%NaOH 溶液中，再加入880 mL1%的3，5-二硝基水杨酸溶液。 将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，储于棕色瓶中放置710 d后使用。在棕色瓶内保存一年有效。
A.2.3.1 可溶性淀粉标准溶液，按表A2配制。
A.2.3.2 分别取上述溶液各1.0mL(须做平行试验)， 加入到5mL稀碘液中，摇匀，于660nm测定吸光度，以 不含可溶性淀粉的0管为空白对照。以吸光度为纵坐 标，可溶性淀粉的浓度为横坐标，绘制标准曲线（此 线应通过零点）。 根据作图或用回归方程，计算出吸光度为1时可以、 可溶性淀粉的量（mg）,即为吸光度常数K值，其值应 在0.95～1.00范围。
A.4.2.2 轻工业部标准DNS试剂的配制 称取3，5—二硝基水杨酸(10土0.1) g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠10 g，在50 ℃水浴中(磁力) 搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2 g和无水亚硫酸钠5 g，待全部溶解并澄清后，冷却至室 温，用水定容至1000 mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中， 于暗处放置7 d后使用。 A.4.2.3 农业部标准DNS试剂的配制 称取3，5-二硝基水杨酸3.15 g(化学纯)，加水500 mL。，搅拌5 s，水浴至45 ℃。然后逐步加入100 mL 0.2g/ mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。直到溶液清 澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要 超过48℃)。
淀粉酶活力测定方法
1 溶液的配制：轻工业部标准DNS试剂的配制称取3，5-二硝基水杨酸(10土0.1) g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠10 g，在50 ℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2 g和无水亚硫酸钠5 g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000 mL，过滤。
贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7 d后使用。
(1)DNS的配制：DNS（3,5-二硝基水杨酸）：称取10g DNS溶于600mL水中，全部溶解后，逐渐加入20g NaOH，搅拌溶解。
缓慢加入200g 酒石酸钾钠，加热溶解（55℃）后加入2g 苯酚和0.5g 无水亚硫酸钠，加热搅拌至全部溶解，冷却，用水稀释至1000ml，储存于棕色试剂瓶中，一周后使用。
(2)可溶性淀粉底物溶液（1%）：称取1 g可溶性淀粉，溶于80ml煮沸的Tris-HCl(pH6.5)缓冲液中，再煮沸10mins，冷却后定容至100ml。
葡萄糖标准液（1mg/ml）: 取烘箱烘干的葡萄糖0.1g加入到100ml容量瓶中，定容至100ml。
2酶活测定（1）葡萄糖标准曲线的绘制取7支试管编号，分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml的葡萄糖标准液（1 mg/ml），用ddH20补加至2ml，再加入2ml DNS，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，定容至20ml，用第一支试管调零，测定在540 nm处的吸光值。
以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）DNS法取2个试管，分别为对照管和样品管。
将两试管中各加入Tris缓冲液800 μl 和底物溶液100 μl，37℃水浴保温5min，然后在对照管中加入灭活的纯化酶液（沸水浴煮沸10min）100 μl，样品管中加入纯化酶液100 μl，立即混匀计时，在37℃水浴中准确反应30min后加入等体积的DNS(1ml)终止反应，沸水浴显色5min，冷却后，定容至10ml，在540nm分光光度计测定吸光值，每个样品重复三次，取平均值。
酶活力测定的原理和方法
柱法测定：
• 将一定量的固定化酶装进具有恒温装置 的反应柱中，让条件适宜的底物溶液， 以一定的速率流过酶柱，收集流出的反 应液。按常规方法测定底物的消耗量或 产物的生成量。测定方法与游离酶反应 液的测定方法相同。
连续测定
• 利用连续分光光度法等方法可对固定化酶反应 液进行连续测定，从而连续测定酶活力。测定 时，可将振荡反应器中的反应液用泵连续引到 连续测定仪（例如，双束紫外分光光度计等） 的流动比色杯中进行连续分光测定。或者使固 定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进 行连续分光测定。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应
一级反应
Km
[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
酶活性检测
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。
该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。
而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。
下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。
能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。
自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。
欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。
酶工程1-5-7 酶活力测定--
酶的提取 ---- 酶的分离纯化
酶的提取
一般是在一定条件下，用适当的溶剂处理含
酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。
依提取液分类： （T，pH值，离子强度等 ）
盐溶液 取
酶的分离纯化
是采用各种生化分离技术，如离心分离、过滤与 膜分离、萃取分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离 以及浓缩、结晶、干燥等，使酶与各种杂质分离，达 到所需的纯度，以满足使用的要求。
酶的生产是指通过人工操作获得所需酶的 技术过程。
酶的生产方法可以分为3种：
提取分离法（最早采用、沿用至今）
生物合成法（20 世纪50 年代以来）
化学合成法（实验室阶段）
（1）提取分离法
定义：
是采取各种提取、分离、纯化技术从动物、 植物的组织、器官、细胞或微生物细胞中将酶提 取出来，再进行分离纯化的技术。
模拟酶
是在分子水平上模拟酶的活性中心的结构特
征和催化作用机制、设计并合成的仿酶体系。
小分子仿酶体系
环状糊精模型、冠醚模型、卟啉模型、环芳烃模
型等大环化合物模型。
大分子仿酶体系
分子印迹模型和胶束酶模型
第七节 酶工程的发展概况
酶工程（enzyme engineering）是在1971年第一
届国际酶工程会议上才得到命名的一项新技术。 酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、 酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫 生和理论研究等方面的应用。 根据研究和解决问题的手段不同将酶工程分为化 学酶工程和生物酶工程。
（三）酶的转换数和催化周期
酶的转换数KP，指每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的摩 尔数，又称摩尔催化活性（mol catalytic activity）。即每摩尔 酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数，是没催化效率的一 个指标。 KP通常用每摩尔酶的酶活力单位数表示，单位min-1。
酶活力测定
胰蛋白酶和木瓜蛋白酶活力测定
(1)胰蛋白酶活力的测定:将1.0mL胰蛋白酶底物溶液与1.0mL硼酸盐缓冲液混合。
调温至25℃、调pH至8.0后加入0.05mL胰酶溶液，用浓度为0.10mol/L的NaOH溶液滴定，使其pH值稳定在7.9～8.0范围内。
反应8min时读取NaOH溶液的消耗量(uL)，以每分钟水解1.0umol/L BAEE所需的酶量定义为一个胰蛋白酶活力单位。
胰蛋白酶活力(U·g-1)=V×0.10×1000/(m×8)
式中，V为NaOH溶液的消耗量(uL)，0.10为NaOH溶液浓度(mol·L-1)，m为0.05mL酶液的酶量(mg)。
(2)木瓜蛋白酶活力的测定:将5.0mL木瓜蛋白酶的激活液和5.0mL
底物溶液混合，调温至25℃后加入0.lmL木瓜蛋白酶溶液，用浓度为0.02mol·L-1的NaOH溶液滴定，使其pH恒定在7.0左右。
反应5min 时读取NaOH溶液的消耗量(uL)，在上述条件下每分钟水解1.0 umol BAEE所需的酶量定义为一个木瓜蛋白酶活力单位。
木瓜蛋白酶活力(U·g-1)=V×0.02×1000/(m×5)
式中，V为NaOH溶液的消耗量(uL)，0.02为NaOH溶液浓度(mol·L-1)，m为0.lmL酶液的酶量(mg)。
两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(FPA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlOOO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。
N：为酶液稀释总倍数。
T：为反应时间。
M：为样品的体积。
4、葡萄糖标准曲线绘制方法标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
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D 量热法
• 由于在反应过程中有反应热的变化，用 非常灵敏的量热计可以测定酶反应速度。
该法灵敏，无干扰，且很通用，近年来
逐渐引起了人们的重视。
E 旋光法
• 在某些酶催化的反应中，底物和产物的旋光有 所不同，这时就可以根据旋光的变化来跟踪酶 反应过程。在某些情况下，可通过形成络合物 来提高旋光度。如乳酸与钼酸盐反应形成高比 旋络合物，故可用旋光计跟踪 LDH 催化的乳酸 和丙酸之间的转换。然而，在通常情况下，由 于该法与其它方法相比灵敏度低，因而很少采 用
• 经同位素标纪的底物在酶活力测定中有很重要 的价值，用于标记的同位素一般有：
• 当同位素衰变时放出β 射线（粒子）。 • 放射性化学法原理与化学法相似，但反应终止 后，必须把放射标记的底物与产物分离，多用 层析和电泳法，然后测定产物（或底物）的放 射性，就可得知酶的活性。
3、酶偶联法
• 有一些酶促反应的产物不易直接测定，需加入一指 示酶转变成可测定的产物如测定葡萄糖氧化酶的反 应速度： • β —D—葡萄糖+ O2 →葡萄糖酸内酯+H2O2
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应一级反应Βιβλιοθήκη Km[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
酶活力的测定
• 酶活力的测定就会是测定酶促反应速度。 • 必须测定酶反应的初速度。 • 底物浓度必须足够的大，至少为Km的10 倍。 • 酶浓度必须适合。
1、化学法
• 化学法是利用化学反应使产物变成一个 可用某种物理方法测定的化合物。如根 据比色、酸碱滴定、量热、量气法等来 计算酶的活性。
2、放射性化学法
酶的分析检测技术
• 酶促反应分析 • 酶活力测定方法 • 常见酶类的活力测定方法
維持酵素活性緩衝液
• 緩衝液可維持溶液的恆定酸鹼度及離子 濃度，兩者都會影響酵素的活性 • 經常在緩衝液中加入一些物質，以增加 酵素安定或保持活性 • 溫度的影響 • 濃度的影響
試劑的保存
• • • • 避免潮解 分裝凍藏: 甘油凍藏 避光防菌
术主要基于酶促反应的初速度原理，下
面介绍两种方法。
定时法
• 定时法是指在线性范围内，定时记录反 应过程中读数的变化（如吸光度），由 于这一变化值直接正比于初速度，故可 分析出相应的物质浓度。 • 这种分析仪多用分光光度法检测或选用 离子选择性电极，对大批量样品进行单 一成分分析或对每一样品进行多因素分 析，效率很高。
2、偶联的连续法
• 偶联的连续法就是将指示酶直接加到待 测酶反应系统中，将其产物直接或间接 转变成一个可用光谱吸收仪检测的化合 物。连续的偶联反应必须在酶反应相同 条件（ pH ，温度等）下进行，且加入的 指示酶，以及其他各种物质不能干扰原 来的酶活力。
四、酶分析的自动化
• 所谓酶分析的自动化是指从加样，启动 反应，检测、数据记录及结果处理等整 个过程都由仪器自动操作。自动分析技
B 电化学法
• 很多不同类型的电化学法已用于酶反应测定中， 最重要之一是电位计技术。其基本原理是溶液 的电势取决于被测物的浓度和性质，采用这一 原理制成的离子选择性电极，如pH电极可测定 酶反应过程中反应液pH值的变化，从而得知参 与反应的酶的活力。
C 量气法
• 在酶反应中底物或产物之一为气体时，可以通 过测量反应系统中气相的体积或压力的改变， 计算出气体释放或吸收的量。根据气体变化和 时间的关系，即可求得酶反应速度。最常用的 气 体 测 量 仪 为 瓦 （ 勃 ） 氏 测 压 仪 （ Warburg manometric apparatus ）。用测压仪测定酶活 力的优点是可以连续取得读数，以了解整个酶 反应的过程，缺点是灵敏度低。准确程度都较 光谱吸收法低。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
此反应可用量气法或氧电极法测定，但通过一指示酶二过 氧化物酶催化的反应测定吸收光谱的变化更为方便准确。
• H2O2 +色原（如愈创木脂）→H20+O2+染料
测定酶活力
• 中止反应法或连续反应法进行 • 中止反应法 • 在恒温反应系统中进行酶促反应，间隔一 定的时间，分几次取出一定容积的反应液，使 酶即刻停止作用，然后分析产物的生成量或底 物的消耗量。这是最古典的但仍是经常使用的 方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理，设 计测定其活力的具体方法。
切勿反復 凍結-解凍。
酵素失活的原因
• • • • • 可歸類成如下的物理性或化學性原因。 (1) 蛋白質 變性： (2) 酵素 活性區 破壞： (3) 蛋白脢 水解： (4) 酵素 抑制劑：
酶反应速度曲线
产 物 浓 度 斜率＝浓度/时间＝V 时间
酶反应速度可以通过单位时间内，单位体积中底物的减少量 或产物的增加量来表示。
1、一般的连续法
• A 光谱吸收法 • 该法主要指分光光度法和荧光法。分光 光度法是利用反应物和产物在紫外和可 见光部分光吸收不同，选择一适当的浓 度，连续测定读出反应过程中光吸收的 变化。该法适用于一些反应速度较快的 酶。自动记录仪的普遍使用使该法更容 易被人们接受。
• 脱氢酶以NAD+或NADP+或作为辅酶，反应中形成 NADH或NADPH ，340nm处可以观察到光吸收的变 化。 • NAD （ P ） H 在 340nm 处吸收光后发射出 460nm 的 光。因而，需这两个辅因子的任何反应都可用 荧光法测定。