酶联免疫
酶联免疫检测方法
酶联免疫检测方法
酶联免疫检测是一种常用的生物技术方法，它结合了酶标记和免疫反
应的原理，可用于检测生物样品中特定分子的含量，如蛋白质、抗体、激
素等。
具体步骤如下：
1.准备样品：从生物样品中提取目标分子，例如血液、尿液、细胞等。
2.免疫反应：将一定浓度的目标分子加入到反应孔中，并加入与目标
分子特异性的抗体，使两者发生免疫反应。
3.洗涤：对反应孔进行洗涤，以去除未与抗体结合的杂质以及剩余的
抗体。
4.添加荧光标记的二抗：向反应孔中加入荧光标记的二抗，使其与已
结合的抗体形成复合物。
5.洗涤：对反应孔进行再次洗涤，以去除未结合的荧光标记的二抗。
6.酶标记：向反应孔中加入用酶标记的物质（如酶标记的抗体），使
其与已结合的荧光标记的二抗形成复合物。
7.洗涤：对反应孔进行最后一次洗涤，以去除未结合的酶标记化合物。
8.反应染色：向反应孔中加入染色物质，使其与酶标记化合物发生颜
色反应，形成分析结果。
最终，检测结果可以通过测量反应孔中染色物质的光密度或荧光强度
来评估样品中目标分子的浓度。
酶联免疫检测方法具有高灵敏度、高特异
性和高通量等优点，广泛应用于医学、生物工程、食品安全等领域。
酶联免疫吸附法原理
酶联免疫吸附法原理酶联免疫吸附法（ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，广泛应用于医学诊断、生物学研究和生物制药等领域。
该技术通过酶标记的抗体与特定抗原结合，再通过酶底物的反应产生可定量测定的色素或荧光信号，从而实现对抗原或抗体的检测和定量分析。
酶联免疫吸附法的原理主要包括固相酶联免疫吸附法和溶液相酶联免疫吸附法两种类型。
固相酶联免疫吸附法是最常见的类型，其原理是将抗原或抗体固定在微孔板上，再加入酶标记的抗体或抗原进行反应，最后通过底物的反应来测定结果。
而溶液相酶联免疫吸附法则是将酶标记的抗体或抗原与待测物体系中的抗原或抗体反应，再通过固相进行分离和检测。
酶联免疫吸附法的操作步骤一般包括以下几个关键步骤，包被、孵育、洗涤、检测和计量。
首先是将待检测的抗原或抗体包被在固相载体上，形成固相复合物。
然后加入酶标记的抗体或抗原，让其与待检测物发生特异性结合，形成夹心复合物。
接着进行洗涤步骤，以去除非特异性结合物质。
随后加入底物，使酶与底物发生反应，产生可测定的信号。
最后通过光度计或荧光计等设备对信号进行测定和计量，从而得出待检测物的含量或浓度。
酶联免疫吸附法具有高灵敏度、高特异性、操作简便、快速、经济等优点，因此被广泛应用于临床医学、生物学研究和生物制药等领域。
在临床医学中，ELISA技术常用于检测各种疾病的标志物，如肿瘤标志物、感染病原体抗体、药物残留等。
在生物学研究中，ELISA技术常用于蛋白质的定量分析、细胞因子的检测等。
在生物制药领域，ELISA技术常用于药物的质量控制和稳定性研究。
总之，酶联免疫吸附法作为一种重要的实验技术，在科研和临床领域发挥着重要作用。
随着生物技术的发展和进步，相信酶联免疫吸附法将会在更多领域展现出其巨大的应用潜力。
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）
是一种常用的免疫学实验技术，用于检测样本中特定蛋白质或其他
分子的存在。
酶联免疫法通过利用特异性抗体与特定抗原结合的原
理来进行检测。
这种方法的原理是将待检测的抗原或抗体与特定的
酶标记的抗体或抗原结合，然后通过酶的底物来检测酶的活性，从
而确定待检测物质的存在或浓度。
酶联免疫法主要分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间
接竞争ELISA等几种类型。
直接ELISA直接将被检测的抗原或抗体
吸附在固相载体上，然后加入与其特异性结合的酶标记的抗体或抗原，通过酶的底物来检测酶活性。
间接ELISA则是在固相载体上吸
附抗原后，再加入特异性抗体和酶标记的抗体，以增强检测的灵敏度。
竞争ELISA则是将待检测的抗原与酶标记的抗原竞争结合，通
过竞争程度来检测待检测物质的浓度。
间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的特点，可以用于检测抗体的浓度。
酶联免疫吸附试验法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感和特异性的实验技术，广泛应用于医学诊断、生物学研究和生物制药工业等领域。
它的优点包括操作简便、成本
低廉、高通量性和可定量性等，因此被广泛用于检测疾病标志物、药物残留、植物病原体和基因工程产品等。
同时，酶联免疫法也有一些局限性，比如可能受到干扰物质的影响、需要一定的实验条件和设备等。
因此，在使用酶联免疫法时需要综合考虑其优缺点，并结合具体的实验要求来选择合适的方法和条件。
酶联免疫吸附的原理及应用
酶联免疫吸附的原理及应用原理酶联免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是一种基于抗体与抗原的特异性结合反应和酶的活性产生关系，用于检测、定量和鉴定生物分子的方法。
ELISA的原理基于酶作为信号发生物，可通过酶的催化作用产生可测量的信号，从而实现对目标物质的检测。
抗体与抗原结合ELISA的基本原理是利用抗体与抗原特异性结合的特性进行目标物质的检测。
首先，在固定在试孔或试管表面的抗体上，加入待测样品，样品中的目标物质（抗原）与抗体特异性结合形成免疫复合物。
检测抗原经过一系列的洗涤步骤后，加入与抗体特异性结合的第二抗体，该第二抗体已与酶特异性结合。
这样，在试管或试孔中就形成了另一种特异性的结合，即抗体-抗原-二抗-酶。
信号产生加入了特定底物后，酶会催化底物的反应产生可测量的色或荧光信号。
信号测量信号的测量通常使用光谱仪器，例如酶标仪或荧光仪，对产生的色或荧光量进行测量，从而得到目标物质的浓度。
应用ELISA作为一种敏感、特异且相对快速的检测方法，在许多领域有着广泛的应用。
医学诊断ELISA在医学诊断中用于检测某些特定疾病的标志物。
例如，用于检测某些感染性疾病的抗体或抗原，如HIV、乙肝病毒等。
同时，ELISA也可用于监测某些自身免疫疾病的标志物，如自身抗体。
由于ELISA技术对抗体和抗原高度特异性，能够提供高度准确的诊断结果。
药物研发ELISA在药物研发领域中也有广泛应用。
例如，ELISA可用于检测药物在体内的代谢产物，从而了解药物的药代动力学特性。
此外，ELISA还可用于检测药物在体内的浓度，评估药物的安全性和疗效。
农业检测ELISA在农业领域中也有重要应用。
例如，ELISA可用于检测农作物中的农药残留，从而保障农产品的质量和安全。
此外，ELISA还可用于检测农作物中的病原体，及时发现植物病害并进行控制。
环境监测ELISA在环境监测中也有一定的应用。
酶联免疫法 半定量
酶联免疫法半定量
酶联免疫法（ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，用于检
测样品中特定蛋白质的存在。
该方法利用酶标记的抗体与待检测物
质结合，然后通过酶的底物转化产生可测量的信号。
酶联免疫法可
以分为定性和半定量两种，定性用于确定样品中是否存在特定抗原，而半定量则可以测量样品中抗原的相对浓度。
在酶联免疫法半定量中，通常会利用标准曲线来确定待测样品
中抗原的浓度。
首先，制备一系列已知浓度的标准溶液，然后将它
们与相同的酶标记抗体反应，生成标准曲线。
接下来，将待测样品
与酶标记抗体反应，测量其信号强度，并通过标准曲线确定其浓度。
酶联免疫法半定量具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，因此在临床诊断、生物医学研究和生物制药等领域得到广泛应用。
然而，该方法也存在一些局限性，如对样品的处理和操作技术要求
较高，以及可能受到干扰物质的影响等。
总的来说，酶联免疫法半定量是一种重要的生物化学分析方法，能够准确、快速地测量样品中特定抗原的相对浓度，为科研和临床
诊断提供了有力的工具。
随着技术的不断进步和改进，相信这一方法在未来会有更广泛的应用和发展。
酶联免疫吸附的原理和步骤
酶联免疫吸附（ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，广泛应用于医学、生物学、生物化学、环境监测等领域。
它主要是通过酶标记抗体或抗原与待检测样品中的特定分子发生特异性反应，利用酶的催化作用来检测目标物质的存在量和浓度。
一、酶联免疫吸附的原理酶联免疫吸附的原理是基于免疫学和酶学的原理。
它利用抗体和抗原之间的特异性结合关系来检测待测物质的存在和浓度。
ELISA的原理主要分为两种类型：直接ELISA和间接ELIS A。
直接ELISA是将酶标记的抗体或抗原直接与待检测物质结合，然后用底物检测酶的活性，从而测定待检测物质的存在和浓度。
间接ELISA是将待检测物质与特异性抗体结合，再加入酶标记的二抗与第一抗体结合，最后用底物检测酶的活性，从而测定待检测物质的存在和浓度。
二、酶联免疫吸附的步骤酶联免疫吸附的步骤主要分为以下几个方面：1.涂层：将抗体或抗原涂在微孔板上，使其与微孔板表面结合。
2.阻断：用蛋白质或其他物质阻止非特异性结合。
3.样品加入：加入待测样品，使其与涂层的抗体或抗原发生特异性结合。
4.洗涤：用缓冲液洗去未结合的物质。
5.酶标记的抗体或抗原加入：加入酶标记的抗体或抗原，使其与待测物质结合。
6.洗涤：用缓冲液洗去未结合的物质。
7.底物加入：加入底物，使其与酶发生反应，产生可测量的信号。
8.停止反应：加入停止反应剂，停止底物的反应。
9.测量：用酶标仪或光度计测量信号的强度，从而计算出待测物质的存在量和浓度。
三、酶联免疫吸附的实际应用酶联免疫吸附在医学、生物学、生物化学、环境监测等领域都有广泛的应用。
1.医学应用：酶联免疫吸附可以检测血清中的病原体抗体，如乙肝病毒、艾滋病毒等；检测血清中的肿瘤标志物，如癌胚抗原、前列腺特异性抗原等；检测血液中的药物浓度，如抗生素、抗癌药物等。
2.生物学应用：酶联免疫吸附可以检测细胞因子、酶、蛋白质等生物分子的存在和浓度，用于研究生物学过程和疾病机制。
3.环境监测应用：酶联免疫吸附可以检测水、土壤、空气中的污染物，如重金属、有机物、农药等，用于环境监测和污染物的快速检测。
酶联免疫吸附试验过程
酶联免疫吸附试验过程一、什么是酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的免疫学检测技术。
它通过利用酶标记的抗体或蛋白质与待测物或已知的抗原/抗体结合反应，在底物的作用下产生可定量检测的颜色反应，从而确定待测物的含量。
二、酶联免疫吸附试验的基本原理酶联免疫吸附试验主要涉及以下几个关键步骤：1. 固相抗原/抗体的固定将待测物（如抗原或抗体）吸附于固相材料（如微孔板或磁珠）表面，形成固定点。
一般采用非特异性吸附（如通过静电相互作用或亲和力学吸附）将蛋白质固定于固相材料上。
2. 样品或标准品的加入将含有待测物的样品或已知浓度的标准品加入至固相材料上，使待测物与固相抗原/抗体产生特异性结合。
3. 特异性抗体的结合加入与待测物特异性结合的酶标记抗体（如HRP标记的抗体），使其与待测物（抗原或抗体）形成复合物。
4. 用底物发生化学反应加入底物（如TMB或ABTS）作用于酶标记的抗体，使其发生特异性的化学反应，产生可定量检测的颜色反应。
5. 反应终止通过加入反应终止剂（如酸溶液或碱溶液）停止底物的反应。
终止后，颜色反应的强度与待测物的浓度呈正相关。
6. 光密度的测定使用酶标仪或分光光度计测定底物发生反应后的光密度值，通过比较标样/标准曲线，确定待测物的浓度。
三、酶联免疫吸附试验的优点和应用酶联免疫吸附试验具有以下优点：1.高灵敏度：能够检测到非常低浓度的待测物，通常在ng/mL至pg/mL的范围内。
2.高特异性：通过特异性抗体的配对，能够准确鉴定待测物与特定抗原/抗体的结合。
3.高通量性：在微孔板上可以同时检测多个样品，提高了检测效率。
4.易操作性：试验步骤相对简单，不需要复杂的仪器设备。
5.可定量性：通过与标准曲线比较，能够准确测定待测物的浓度。
酶联免疫吸附试验在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用：1.免疫学研究：可用于研究各类抗体的水平、亲和力、免疫反应动力学等，揭示免疫系统的功能和机制。
酶联免疫胶体金法
酶联免疫胶体金法（enzyme-linked immunogold assay，ELIGA）是一种常用的免疫试验方法，用于检测特定抗原或抗体的存在。
它结合了酶标技术和胶体金技术的优点，具有高灵敏度和高特异性的特点。
酶联免疫胶体金法的原理是将与特定抗原或抗体结合的胶体金标记物用作检测信号。
标记的胶体金微粒具有良好的稳定性和可视性，能够在光学显微镜下观察到。
该方法主要包括以下步骤：
1. 样品处理：对待检样品进行处理，如提取目标抗原或抗体。
2. 固相吸附：将处理后的样品加入固相吸附物（如酶标板、膜片等），使目标物质固定在上面。
3. 阻断：用适当的阻断液封闭非特异性吸附位点，减少假阳性反应。
4. 孵育：加入特异性原抗体或特异性标记的抗原，使其与固相上的目标物质结合。
5. 清洗：通过洗涤的方式去除未结合的物质，减少背景干扰。
6. 标记：加入胶体金标记物，使其与特异性抗体或抗原结合。
7. 可视化：使用适当的显色底物，使得胶体金变成颜色或形成可见沉淀。
8. 停止反应：加入停止液或停止酶作用，使反应停止。
9. 分析：使用光学显微镜或分光光度计等设备对结果进行观察和分析。
酶联免疫胶体金法广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程领域，可用于检测病原微生物、肿瘤标记物、抗体、激素等生物分子的存在和定量分析。
酶联免疫吸附原理
酶联免疫吸附原理酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的免疫学分析方法。
它基于免疫反应的原理，利用酶的活性来检测目标物质的存在或浓度。
ELISA的原理可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA等几种。
本文将以间接ELISA为例来介绍酶联免疫吸附的原理。
间接ELISA由两个主要步骤组成：涂层和检测。
首先，将需要检测的抗原分子固定在固相（如微孔板）上，这一步骤被称为涂层过程。
涂层完毕后，孔板中未被抗原吸附的位点将被阻断以避免非特异性吸附。
接下来，将待测样品加入孔板中，并与固相上的抗原分子相互作用。
如果样品中存在目标抗原，则目标抗原与固相抗原会发生特异性结合。
此时，加入特异性抗体（如兔抗人抗体）与抗原结合，并形成免疫复合物。
为了检测免疫复合物的存在，通常会使用与兔抗体特异性结合的酶标记抗体，如辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，简称HRP）。
酶标记抗体与免疫复合物结合后，将其余的非特异性物质洗去。
最后，加入底物（如TMB，即3,3',5,5'-四甲基联苯胺）与酶发生反应，形成可测量的产物。
该产物颜色呈现与底物反应时间和酶标记抗体的结合程度成正比的变化。
通过测量底物反应的颜色强度或光密度，可以间接反映出待测样品中目标抗原的存在或浓度。
总的来说，酶联免疫吸附原理是通过利用酶标记抗体的活性来间接检测目标抗原的存在或浓度。
它具有高灵敏度、高特异性和易操作等优点，广泛应用于生命科学研究和临床诊断领域。
酶联免疫吸附试验的原理及分类
酶联免疫吸附试验的原理及分类酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种广泛应用于生命科学领域的实验技术，用于检测和定量分析一系列分子，如蛋白质、抗体、荷尔蒙和细胞因子等。
ELISA具有高灵敏度、高特异性和高通量的优势，被广泛应用于医学诊断、生物医药研发和农业科学等领域。
ELISA的核心是利用抗原与抗体结合的特异性反应，通过酶标记的系统，检测目标物质的存在量。
具体步骤如下：1.固相抗体：将特异性抗体（捕获抗体）固定在固相支持物上，例如多孔板或微球。
这些抗体可以通过亲和层析、制备融合蛋白或是克隆单克隆抗体的方式获得。
2.样本孵育：将待测样本或控制样品加入到固相抗体包被的孔中，使得目标分子与固相抗体结合。
3.洗涤：通过洗涤，将未结合的物质从孔中清除，以减少背景信号的干扰。
4.二抗结合：加入标记有酶的二抗，即辅助抗体。
这些二抗能够与固相抗体或捕获抗体上的抗原结合。
5.再次洗涤：洗去未结合的二抗。
6.底物添加：加入适当的底物，例如染色底物或荧光底物。
底物将与酶反应，产生可视化的信号。
7.反应终止：通过添加特定的终止剂，停止酶的反应。
8.信号测量：测量底物反应产生的光学信号，例如吸光度或荧光强度。
这些信号与目标分子在样本中的浓度成正相关。
根据标记的物质，酶联免疫吸附试验可以分为多种不同类型。
常见的分类有如下几种：1.直接ELISA：在固相抗体上直接标记酶或检测物质，例如酶标化的抗原或抗体。
2.间接ELISA：在固相抗体上结合与待测物质特异结合的二抗。
这种方法可以提高灵敏度。
3.竞争ELISA：待测物质与已知浓度的标准品竞争与固相抗体上结合的二抗。
4.桥联ELISA：通过两种或两种以上的抗体与待测物质形成一个桥联复合物，然后用标记物检测抗原或抗体。
5.双抗体ELISA：通过两种不同特异性的抗体与待测物质结合。
一种抗体被固定在固相上，另一种抗体被标记。
简述酶联免疫吸附测定的原理
简述酶联免疫吸附测定的原理酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感、高通量的免疫技术，常用于检测微量生物分子或抗体的存在与浓度。
ELISA的原理基于抗体与抗原之间高度特异性的结合，以及酶底物反应的可见色素反应。
ELISA的基本原理如下：1. 酶联：先将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板）上。
最常用的固相载体是聚丙烯酸酯（polystyrene），可以牢固地吸附抗原或抗体。
2.结合：在固相载体上固定的抗原与样品中的分子结合，以形成特异性的抗原-抗体复合物。
3.洗涤：为了去除非特异性结合的物质，需要进行反复的洗涤步骤。
4.检测：加入与目标分子相关的抗体，这些抗体经过标记，通常是酶标记。
这些标记的抗体与复合物中的目标分子结合。
5.洗涤：再次进行洗涤步骤，以去除非特异性结合的物质。
6.底物-酶反应：加入合适的底物，底物与酶标记的抗体发生反应，并产生可见的色素物质。
7.读数：用光度计测量反应物的吸光度，吸光度的强度与样品中目标物的浓度成正比。
ELISA的优点是具有高度的特异性和敏感性，可以检测极低浓度的物质。
此外，ELISA还可以同时检测多个样品，并且操作相对简单，不需要昂贵的设备。
ELISA的应用广泛，特别是在医学诊断领域。
例如，ELISA可以用来检测一些疾病的标志物，如乳腺癌、艾滋病、流感等。
此外，ELISA还用于酶抗体检测、药物监测、细菌和病毒的检测等领域。
虽然ELISA是一种非常有用的技术，但也存在一些局限性。
ELISA对样品中的杂质比较敏感，可能会导致假阳性结果。
此外，ELISA只能检测已知的抗原或抗体，无法发现新的目标分子。
此外，ELISA需要时间较长（通常需要2-4小时）。
综上所述，酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种重要的免疫技术，通过抗原与抗体的特异结合和酶底物反应，可以准确、敏感地检测微量生物分子或抗体的存在与浓度。
酶联免疫法
酶联免疫法酶联免疫法是一种灵敏度非常高的检测技术，它可以用来检测微量物质，广泛应用于各种生物学研究中。
酶联免疫法的这种特殊特性，使它在医学检验、环境污染监测、食品安全检测以及其他科学研究中得到了广泛的应用。
一、酶联免疫法简介酶联免疫法，又称酶连接免疫吸附测定（ELISA），是一种常见的生物分子检测技术，可以检测出极低的抗原浓度。
它是一种免疫学技术，它通过特异性抗体和酶的特殊反应，以达到非常灵敏的检测效果。
酶联免疫法的基本原理是：首先，将要检测的样品（抗原或抗体）和特异性抗体在反应板上发生反应，然后，将一种酶修饰的抗原特异性抗体溶解液加入，反应结束后，再加入酶的底物溶液，底物溶液中的特异性酶会与反应板上的抗原特异性抗体结合，形成抗原-酶复合物，最后用测定仪测定抗原-酶复合物的光谱，从而得到检测结果。
二、酶联免疫法的应用1、医学检验酶联免疫法在医学检验方面，可以用于检测各种病毒、细菌及其抗原，如肝炎、梅毒、登革热等；也可以用于检测抗体，如抗体检测、免疫球蛋白检测等；还可以用于检测放射性标记的抗原或抗体，用于免疫学研究与临床诊断。
2、食品安全检测酶联免疫法可以用于检测各种污染物，如残留农药、重金属、疾病菌等，以确保食品安全。
3、环境污染监测酶联免疫法可以用于环境污染监测，可以检测出游离态的污染物，如氨、氯、硫酸盐等，以及致病菌、抗药性菌等，为控制环境污染提供重要的参考数据。
4、其他科学研究除了上述应用外，酶联免疫法还可以用于其他科学研究，如生物化学、分子生物学、遗传学、细胞生物学等，可以用来研究蛋白质、核酸、糖蛋白等生物物质。
三、酶联免疫法的优缺点1、优点a) 酶联免疫法的灵敏度很高，可以检测出极低的抗原浓度；b) 反应快速，结果准确；c) 操作简单，容易稳定；d) 可以同时检测多个抗原或抗体，效率高；e) 反应条件可以调整，可以根据不同的样品进行调整。
2、缺点a) 需要一定的抗体，而抗体的生产时间较长；b) 对抗原的特异性较弱；c) 稀释抗体可能会引起误差；d) 检测时，可能会受到干扰物的影响。
酶联免疫吸附试验
技术创新：新型的酶联免疫吸附试验技术不断涌现如荧光标记技术、量子点标记技术等提高了检测的灵敏度和特异性。
市场需求：随着生物技术的不断发展酶联免疫吸附试验在临床诊断、食品安全、生物医药等领域的需求不断增长。
发展趋势：随着检测技术的不断进步酶联免疫吸附试验将朝着更快速、更准确、更自动化的方向发展。
应用领域拓展：酶联免疫吸附试验的应用领域不断拓展如肿瘤标志物检测、病毒检测、食品安全检测等为各领域的发展提供了有力支持。
荧光标记技术：提高灵敏度降低背景干扰
磁珠分离技术：快速分离抗原抗体提高试验速度
酶联免疫吸附试验在交叉学科领域的应用前景
酶联免疫吸附试验在生物医学领域的应用
酶联免疫吸附试验在环境监测领域的应用
酶联免疫吸附试验在农业科技领域的应用
酶联免疫吸附试验在食品安全检测领域的应用
酶联免疫吸附试验的市场需求与发展趋势
联合检测：将酶联免疫吸附试验与其他检测方法相结合提高检测的灵敏度和特异性。
标准化和规范化：建立酶联免疫吸附试验的标准化和规范化操作流程确保试验结果的准确性和可靠性。
酶联免疫吸附试验的发展趋势
PRT SIX
酶联免疫吸附试验的技术创新与突破
自动化技术：提高试验效率降低人为误差
微孔板技术：简化操作减少样本用量
PRT TWO
酶联免疫吸附试验的定义
酶联免疫吸附试验是一种常用的免疫分析技术
通过酶与抗体或抗原的结合实现对目标分子的定量或定性检测
酶可以放大信号提高检测的灵敏度和特异性
酶联免疫吸附试验广泛应用于生物学、医学等领域
酶联免疫吸附试验的原理
洗涤去除未结合的成分后加入底物显色通过颜色反应判断待测物的浓度。
阻断酶联免疫吸附试验：将抗体先固定在固相载体上再用酶标记的抗原进行检测最后加入底物显色。
简述酶联免疫技术的基本原理
简述酶联免疫技术的基本原理
酶联免疫技术（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是一种高灵敏度、高特异性的实验方法。
其基本原理是利用酶的特异性催化反应作为检测方法。
酶联免疫技术通过将特异性抗体固定在微孔板上，封闭与抗原的结合位点，再加入被检样品，使得被检分子与抗体发生特异性结合，去除未结合的分子，再加入与抗体结合的酶标记二抗，允许其与样品充分反应形成复合物。
洗涤步骤将未结合的酶标记物清洗掉，加入底物，使得酶催化底物的色变反应。
色素依此减少，将被检分子的浓度与底物反应酶标记分子的浓度联系在一起，可用光谱仪测量读数从而量化被检分子的浓度。
总之，酶联免疫技术基于抗体与抗原的特异性结合，通过酶标记的二次抗体识别该特异性结合，并通过酶的催化产生着色反应来实现对被检测物质的定量检测。
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附试验ELISA一种酶联免疫技术。
用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。
即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。
酶联免疫吸附试验（以下简称ELISA）:是酶免疫测定技术中应用最广的技术。
其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。
目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。
1•辣根过氧化物酶（HRP）过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最咼，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%）,分子量约40000,约由300个氨基酸组成，等电点为pH3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH5左右。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
酶联免疫法
酶联免疫吸附实验ELISA一．实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
二．实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。
用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。
ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
《酶联免疫分析法》课件
酶联免疫分析法广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
分类：直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等 应用：临床诊断、药物研发、食品安全检测、环境监测等领域 优点：灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等 局限性：存在假阳性和假阴性结果，需要标准化操作和严格的质量控制
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CONTENTS
PART ONE
PART TWO
酶联免疫分析法（ELISA）是一种免疫学检测方法，用于检测样品中的抗原或抗体。
原理：利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过酶催化底物产生颜色反应，从而定量或定性检测样品中的抗原或 抗体。
优点：灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作简便 缺点：成本较高，需要专业人员操作，容易受到环境因素影响
PART THREE
抗原选择：选择合适的抗原，如蛋 白质、多肽等
抗原标记：将抗原与酶或荧光素等 标记物结合
添加标题
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抗原纯化：通过离心、层析等方法 纯化抗原
抗原保存：将标记好的抗原保存在 适当的条件下，如低温、避光等
检测水中有机污染物：如农药、多 环芳烃等
检测土壤中的污染物：如重金属、 有机氯农药等
添加标题
添加标题
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检测空气中的污染物：如二氧化硫、 氮氧化物等
检测生物体内的污染物：如农药残 留、重金属等
蛋白质定量分析：通过酶联免疫分析法检测蛋白质的浓度 抗体检测：通过酶联免疫分析法检测抗体的存在和浓度 细胞因子检测：通过酶联免疫分析法检测细胞因子的存在和浓度 基因表达分析：通过酶联免疫分析法检测基因的表达水平和调控机制
酶联免疫吸附试验的原理及分类
酶联免疫吸附试验的原理及分类一、引言酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是一种常用的生物化学分析技术，用于检测特定抗原或抗体在样本中的存在量。
ELISA技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，已广泛应用于医学、生物学等领域。
本文将详细介绍ELISA的原理及分类。
二、ELISA的原理ELISA技术基于抗原与抗体之间的特异性结合反应，通过标记化酶使其可定量检测。
通常情况下，ELISA试剂盒包括以下组分：微孔板、标准品或样本、特异性抗体和标记化二抗。
1. 固相法固相法是ELISA技术最常用的方法之一，其基本原理是将特异性抗体固定在微孔板上，使其与待测物质发生结合反应，并通过标记化酶进行检测。
具体步骤如下：（1）将特异性抗体加入微孔板孔中，并在37℃下孵育2小时，使其与微孔壁表面结合。
（2）去除未结合的抗体，并加入待测物质或标准品，使其与抗体结合。
（3）去除未结合的待测物质或标准品，并加入标记化二抗，使其与抗体结合。
（4）去除未结合的标记化二抗，并加入底物，使其与酶发生反应并产生颜色。
（5）停止反应，并通过读板仪器检测吸光度值，计算出待测物质或标准品的浓度。
2. 液相法液相法是ELISA技术中另一种常用的方法，其基本原理是将特异性抗体与待测物质或标准品在溶液中进行反应，并通过标记化酶进行检测。
具体步骤如下：（1）将特异性抗体加入试管中，并在37℃下孵育2小时，使其与待测物质或标准品结合。
（2）去除未结合的待测物质或标准品，并加入标记化二抗，使其与抗体结合。
（3）去除未结合的标记化二抗，并加入底物，使其与酶发生反应并产生颜色。
（4）停止反应，并通过读板仪器检测吸光度值，计算出待测物质或标准品的浓度。
三、ELISA的分类ELISA技术根据不同的检测目标和标记化酶种类，可分为以下几种分类。
1. 直接ELISA直接ELISA是一种检测待测物质的方法，其基本原理是将特异性抗体固定在微孔板上，使其与待测物质直接发生结合反应，并通过标记化酶进行检测。
酶联免疫吸附试验基本原理
酶联免疫吸附试验基本原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的生物学实验方法，广泛应用于医药、生物学和生命科学研究中。
ELISA的基本原理是通过特异性抗原和抗体的结合反应，检测样品中目标物质的存在和定量。
ELISA实验分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等多种类型，下面将对这些类型的基本原理进行详细阐述。
1.直接ELISA直接ELISA是一种将待测抗原直接与酶标记的抗体结合的方法。
首先，在试酶板上涂覆纯化的抗原，然后将待测样品加入，样品中的抗原与被固定在试酶板上的抗原结合。
接着，加入与抗原特异性结合的酶标记的抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。
最后，加入可以与酶标记抗体结合的底物，使酶催化底物产生可测定的颜色变化，通过测量吸光度来确定样品中抗原的浓度。
2.间接ELISA间接ELISA是一种利用一抗和二抗的结合反应检测抗原的方法。
首先，在试酶板上涂覆纯化的抗原，然后将待测样品加入，样品中的抗原与被固定在试酶板上的抗原结合。
接着，加入与被固定抗原特异性结合的一抗抗体，形成抗原-一抗复合物。
然后再加入与一抗特异性结合的二抗抗体，形成抗原-一抗-二抗复合物。
最后，加入可以与二抗结合的底物，使酶催化底物产生可测定的颜色变化，通过测量吸光度来确定样品中抗原的浓度。
3.竞争ELISA竞争ELISA是一种利用抗原和抗体竞争结合的原理测定样品中抗原浓度的方法。
首先，在试酶板上涂覆固定量的纯化抗原。
然后，向试酶板中加入已知浓度的酶标记抗体和待测样品。
酶标记抗体中的抗原与被固定的抗原竞争结合，待测样品中的抗原同样与被固定的抗原竞争结合。
接着，加入可以与酶标记抗体结合的底物，使酶催化底物产生可测定的颜色变化，通过测量吸光度来确定待测样品中抗原的浓度。
4.间接竞争ELISA间接竞争ELISA是一种将待测抗原与固定的抗原竞争结合抗体的方法。
酶联免疫吸附实验ELISA
酶联免疫吸附实验ELISA
第3页
再加入酶标识抗原或抗体, 也经过反应而结合在固 相载体上。此时固相上酶量与标本中受检
物质量呈一定百分比。加入酶反应底物后, 底物被 酶催化成为有色产物, 产物量与标本中受检物质量 直接相关, 故可依据呈色深浅进行定性或定量分析 。因为酶催化效率很高, 间接地放大了免疫反应结 果, 使测定方法到达很高敏感度。
酶联免疫吸附实验ELISA
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2.1.2 包被方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。
换言之, 包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面 过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸 附结合, 靠是蛋白质分子结构上疏水基团与固相载 体表面疏水基团间作用于。这种物理吸附是非特 异性, 受蛋白质分子量、等电点、浓度等影响。
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惯用检验方法为: 以一定浓度人IgG（普通为 10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每 孔内加入适当稀释度酶标抗人IgG抗体，保温后 洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分 别测每孔溶液吸光度。控制反应条件，使各孔读 数在吸光度0.8左右。计算全部读数 平均值。全部单个读数与全部读数均数之差，应 小于10%。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫吸附实验ELISA
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1. ELISA原理 ELISA基础是抗原或抗体固相化及抗原或抗
体酶标识。结合在固相载体表面抗原或抗体仍保
持其免疫学活性, 酶标识抗原或抗体既保留其免疫 学活性, 又保留酶活性。
酶联免疫吸附实验ELISA
第2页
在测定时, 受检标本（测定其中抗体或抗原）与固相 载体表面抗原或抗体起反应。用洗涤方法使固相 载体上形成抗原抗体复合物与液体中其它物质分 开。
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分子生物学与生物化学课程论文酶联免疫（ELISA）检测方法学院:山西农业大学信息学院系部:农业与生命科学系专业:生物技术班级:102班学号:2010010229姓名:高淼时间:2013年5月5日酶联免疫（ELISA）检测方法摘要：酶联免疫法简称ELISA，是酶免疫测定技术中应用最广的技术。
其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
关键词：ELISA基本方法抗体抗原前言：1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)。
ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。
由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。
尽管早期的ELISA 由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。
一、基本原理将抗原或抗体结合到某种固相载体，并保持其免疫活性，将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留酶的活性，也不会改变抗体的免疫学特性。
而常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酶（AKP)等。
①在测定时，把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体反应；滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
二、其原理的免疫学基础抗原、抗体：抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。
抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。
Ig 分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD 和IgE。
与免疫测定有关的Ig 主要为IgG 和IgM。
②抗原抗体反应：抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，具有特异性、可逆性、敏感性3个重要性质。
用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。
目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP 应用最广。
1、辣根过氧化物酶（HRP）过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18％），分子量约40000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH 值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。
此酶溶于水和50％饱和度以下的硫酸铵溶液。
酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm 和403nm。
辣根过氧化物酶催化反应对Ｈ２Ｏ２具有很高的专一性。
在ＨＲＰ催化荧光分析中讨论荧光底物的结构，将有助于揭示酶催化反应机一，对提高分析方法，灵敏度将有着极其重要的应用价值和深远意义。
③2、碱性磷酸酶系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。
它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。
酶解产物呈黄色，可溶，最大吸收值在400nm。
酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg 磷酸苯二钠为一个单位。
④AP 也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA 作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。
三、基本方法ELISA 的分类至今尚无统一的标准。
有些学者根据有关的交献,提出以下三种常用的测定方法（1）测定抗体的间接法；(2)测定抗原的双抗体夹心法；(3)测定抗原的竞争法。
⑤1、间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。
操作步骤如下⑥：⑴将抗原包被在固相载体上，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
⑵若样品中含有抗体，则结合为抗原-抗体复合物，经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。
其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
⑶再加入酶标二抗体，则结合为抗原-抗体-酶标抗体复合物，洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。
⑷酶催化底物并显色，颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。
虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。
2、双抗体夹心法测定抗原双抗体（原）夹心法检测抗原（体）的常见方法，应用针对抗原两个不同决定族的⑦两种单抗分别作为固相载体和酶标抗体检测溶液中的抗原。
操作步骤如下：⑴将抗抗体包被在固相载体上，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。
⑵如样品中含有抗体，则结合为抗抗体-抗体复合物，洗涤除去其他未结合的物质。
⑶加入抗原及酶标抗体，则结合为抗抗体-抗体-抗原-酶标抗体复合物，彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
⑷酶催化底物并显色，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，（适用于二价以上抗原,不能测小分子半抗原）例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等⑧。
只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。
如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。
这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体。
3、竞争法检测抗原或小分子半抗原、抗体，以测抗原为例，使待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。
标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。
以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。
操作步骤如下：⑴将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
洗涤。
⑵待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。
如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。
如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。
参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。
洗涤。
⑶加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。
竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。
另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。
抗HBe的检测一般采用此法。
四、注意事项：在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：⑴固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。
其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。
目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。
不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
⑵包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。
吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响，一般多采用4℃18～24小时。
蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。
选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。
对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。
⑶酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定；然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
⑷酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。
有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。
底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。
通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。
底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
五、前景ELISA是一种非均相的酶免疫检测技术，具有敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，以及既适宜于大规模筛查试验又可以用于少量标本的检测，既可以做定性试验也可以做定量分析等优点，已广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和细胞因子等领域⑨。
ELISA的影响因素较多，加强质量管理才能充分发挥其方法学的优点。
测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。
目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。
参考文献：①ELISA在食品动植物及其产品安全检测中的应用《口岸卫生控制》2003年第5期孙永江任立新②王重庆,分子免疫学基础,北京:北京大学出版社,1997③辣根过氧化物酶催化反应在荧光分析中的应用《天津化工》1999年第3期杜建云唐波④碱性磷酸酶辣根过氧化物酶结合物在包虫病Elisa中对比应用李华苏东明温博贵《江西医学院学报》1988年01期⑤细胞-酶联免疫吸附试验及其应用[期刊论文]《检验医学》ISTIC PKU-2006年z1期朱晴晖⑥生物技术概论，周选国，第七章，生物技术与食品，食品检测⑦临床输血与检验>2001年4期>双抗原夹心法与间接法检测抗-HIV(1+2)的比较⑧Reen DJ.1994.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Methods Mol Biol.32:461-6.⑨李金明．定量聚合酶链反应技术．中华检验医学杂志，2002（2），123。