酶联免疫

分子生物学与生物化学课程论文

酶联免疫（ELISA）检测方

法

学院:山西农业大学信息学院

系部:农业与生命科学系

专业:生物技术

班级:102班

学号:2010010229

姓名:高淼

时间:2013年5月5日

酶联免疫（ELISA）检测方法

摘要：酶联免疫法简称ELISA，是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。

关键词：ELISA基本方法抗体抗原

前言：

1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。尽管早期的ELISA 由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。

一、基本原理

将抗原或抗体结合到某种固相载体，并保持其免疫活性，将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留酶的活性，也不会改变抗体的免疫学特性。而常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酶（AKP)等。①在测定时，把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体反应；滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

二、其原理的免疫学基础

抗原、抗体：抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig 分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD 和IgE。与免疫测定有关的Ig 主要为IgG 和IgM。②

抗原抗体反应：抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，具有特异性、可逆性、敏感性3个重要性质。

用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP 应用最广。

1、辣根过氧化物酶（HRP）

过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18％），分子量约40000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH 值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50％饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm 和403nm。辣根过氧化物酶催化反应对Ｈ２Ｏ２具有很高的专一性。在ＨＲＰ催化荧光分析中讨论荧光底物的结构，将有助于揭示酶催化反应机一，对提高分析方法，灵敏度将有着极其重要的应用价值和深远意义。③

2、碱性磷酸酶

系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。酶解产物呈黄色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg 磷酸苯二钠为一个单位。④AP 也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA 作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。

三、基本方法

ELISA 的分类至今尚无统一的标准。有些学者根据有关的交献,提出以下三种常用的测定方法（1）测定抗体的间接法；(2)测定抗原的双抗体夹心法；(3)测定抗原的竞争法。⑤

1、间接法测抗体

间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下⑥：

⑴将抗原包被在固相载体上，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。

⑵若样品中含有抗体，则结合为抗原-抗体复合物，经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

⑶再加入酶标二抗体，则结合为抗原-抗体-酶标抗体复合物，洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。

⑷酶催化底物并显色，颜色深度代表标本中受检抗体的量。

本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。

2、双抗体夹心法测定抗原

双抗体（原）夹心法检测抗原（体）的常见方法，应用针对抗原两个不同决定族的⑦两种单抗分别作为固相载体和酶标抗体检测溶液中的抗原。操作步骤如下：

⑴将抗抗体包被在固相载体上，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。

⑵如样品中含有抗体，则结合为抗抗体-抗体复合物，洗涤除去其他未结合的物质。

⑶加入抗原及酶标抗体，则结合为抗抗体-抗体-抗原-酶标抗体复合物，彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。