深度解密lncRNA研究策略及注意事项
一文参透：lncrna研究思路、模式和数据库应用知识讲解
一文参透：l n c r n a研究思路、模式和数据库应用一文参透：lncRNA研究思路、模式和数据库应用...作者：解螺旋.老谈导语当很多小伙伴还徘徊在miRNA时，lncRNA已经横空出世，还没得来得及反应过来lncRNA到底是怎么回事时，circRNA又开始崭露头角了。
科研就是这样，你落后一步，便步步落后，跟娶媳妇生孩子是一样一样的。
说回正题，应部分解螺旋粉丝的要求，今天老谈帮大家整体梳理了曾经红极一时、目前热度不减的IncRNA的研究思路和模式以及相关工具，希望能对那些想在IncRNA研究上有所作为的小伙伴能助上一臂之力。
lncRNA研究思路IncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。
很多人看到lncRNA的热度还没有过去，经常会问老谈如果没有相关的工作基础，如何开始lncRNA的研究?今天我们就褪去虚伪外衣，研究的大方向是这样子的：1. 寻找到lncRNA分子2. lncRNA分子表型研究3. lncRNA 通过何种机制调节表型？老谈将这些研究方向及实验手段按层次的方式绘成流程图，如下所示：首先，是样本的准备与收集。
高质量的样本是实验结果具有可靠性的前提。
其次，是lncRNA检测。
可以先通过芯片的方式高通量筛选到目的基因，然后通过q-PCR或Northern blot的方法验证所得到的芯片结果。
再次，其研究方向根据研究目的而定。
如果是研究生物标志物，那么可以通过收集更多的临床样本，研究lncRNA对疾病的指示作用。
如果是研究其功能，则是研究其细胞表型、分子表型及机制。
小伙伴们是不是觉得这和miRNA的总体研究思路相似呢？这时可以根据各自的实验平台条件选择相应的研究。
值得注意的是，lncRNA的功能研究并不像miRNA一样通过3’UTR影响翻译套路，总的来说lncRNA机制研究套路还不成熟。
对于很多科研工作者而言，lncRNA分子的获得及其细胞表型的获得并非难事，关键在于如何进行下一步研究，这时候就要涉及到对功能研究的定位。
LncRNA的研究策略
lncRNA研究策略转载请注明来自丁香园发布日期：2012-09-21 14:47 文章来源：丁香园分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网关键词：RNA miRNA 技术专题锐博生物丁香通丁香园点击次数：34471、差异表达筛选通过lncRNA芯片或RNA-seq测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA 表达谱分析。
2、生物信息分析通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA 的靶基因。
3、细胞分子水平研究（1）功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体（2）功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响（3）可通过RNA pull down、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。
4、动物实验（1）构建移植瘤或原位瘤模型，转移模型（2）导入siRNA或者lncRNA表达质粒（3）检测肿瘤生长曲线（4）通过免疫组化、RT-PCR、Western Blot等方法检测相关指标变化。
小知识RNA-RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation)是一种高通量检测细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。
RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip，帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化。
CHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一种检测与RNA绑定的DNA和蛋白的高通量测序方法。
方法是通过设计生物素或链霉亲和素探针，把目标RNA拉下来以后，与其共同作用的DNA染色体片段就会附在到磁珠上，最后把染色体片段做高通量测序，这样会得到该RNA能够结合到在基因组的哪些区域；如果结合物是蛋白质，可以通过将蛋白质打断成短肽再通过质谱进行鉴定，从而或者与RNA结合的蛋白质。
lncRNA研究策略与技术
lncRNA研究策略与技术研究背景：长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200 bp 以上，起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能；近期的研究说明lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控，尤其在肿瘤当中发挥了重要的调控角色，如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调解以及作为miRNA的诱导分子干扰基因的表达等，图1所示。
随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。
图1. lncRNA参与肿瘤生物学调控，红色线状图表示lncRNA锐博生物提供研究思路：差异lncRNA筛选的研究方法：案例解读：案例(一)RNA seq发现lincRNA1. 2011年，Rinn研究小组对24种组织样本进行RNA测序发现了8000多个人的lincRNAseq预测lincRNAlincRNA的数量及交集及用软件组装的结果2. lincRNA的表达具有组织特异性图3. lincRNA和mRNA在不同组织当中的表达情况案例(二)lncRNA可以成为各种肿瘤的生物标志物2012斯坦福大学医学院研究人员进行首个大型的癌症lncRNA表达谱分析。
对64个肿瘤样品高通量测序，在各种肿瘤类型之间找出差异表达的1065个已知的以及1072新的lncRNA。
lncRNA表达谱分析案例(三)lncRNA表达谱芯片结合lncRNA-mRNA共表达网络筛选关键lncRNA第二军医大学的研究人员利用2/3肝部分切除(PH)小鼠在不同的时间点，针对肝脏再生过程进行了全基因组lncRNA芯片表达谱分析。
通过lncRNA和mRNA共表达网络分析找到了一个非常有意义的长链非编码RNA(lncRNA-LALR1)，并结合体内外实验证实在肝再生过程中lncRNA-LALR1通过激活Wnt/β-Catenin信号加速细胞周期进程，促进了肝细胞增殖。
lncRNA课题设计和方法探究
个人建议：目前做lncRNA最好加入部分表观遗传，因为表观遗传是热点， 基金项目每年接近300项，如：lncRNA启动子区域甲基化，组蛋白修饰，或 者用Cas9的方法进行敲出基因。
为什么作者选择lncRNA TCF7
在读这个文章的时候，我一直在思考这个问题，那样多的lncRNA ，为什么单单 选择了这个呢，个人认为存在的原因如下：1这三组对照细胞的RNA-SEQ ，结合 lncRNA分析，发现lncRNATCF7和调控的TCF7存在一致性。（牛B实验室，很有 钱，花钱如流水的实验室）2si rna小分子库针对筛选出来的差异性的lncRNA(同 样是牛B实验室所为） 3 屌丝做法：（1:查找文献，看看与表型发生一致的基因， 在该基因上下游去寻找关键的lncRNA;2确定几个差异性大的lncRNA，然后si 干 扰该lncRNA,表型做出来，然后寻找该lncRNA周围关键的基因，如果和si 后，存 在一致性，这个lncRNA就是我们要寻找的） TCF7在胚胎发育，肿瘤耐 药中，起到关键作用，作者 就是通过这种方法把两者建 立关系的。
细胞软琼脂克隆实验，以及原代细胞建立细胞系干扰lncRNATCF7，克隆 能力明显减弱，动物试验中，干扰以后，肿瘤的大小明显降低。 实验建议：先做表型，机制只要能解释表型， 论文就可以发表。
lncRNATCF7是肝癌干细胞保持更新所必须的
肿瘤研究中，一般干扰和过表达某一个基因都要独立进行实验的，接下来过表达 lncRNATCF7检测，检下图分别是检验过表达效率，过表达后，干性基因的RT和WB水 平检验，过表达lncRNATCF7后，干性基因的表达量明显的上调。
课题选择之研究方法
1：lncRNA结合转录因子，通过影响基因的启动子区域，调控基因的表达， 从而调控细胞的表型 ，这个实验最大的难点在于RIP技术，rna-pull-down 技术，这几个都是难度系数是9多的拦路虎，慎重进入
一文参透：lncrna研究思路、模式和大数据库应用
一文参透：lncRNA研究思路、模式和数据库应用...作者：解螺旋.老谈导语当很多小伙伴还徘徊在miRNA时，lncRNA已经横空出世，还没得来得及反应过来lncRNA到底是怎么回事时，circRNA 又开始崭露头角了。
科研就是这样，你落后一步，便步步落后，跟娶媳妇生孩子是一样一样的。
说回正题，应部分解螺旋粉丝的要求，今天老谈帮大家整体梳理了曾经红极一时、目前热度不减的IncRNA的研究思路和模式以及相关工具，希望能对那些想在IncRNA研究上有所作为的小伙伴能助上一臂之力。
lncRNA研究思路IncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。
很多人看到lncRNA的热度还没有过去，经常会问老谈如果没有相关的工作基础，如何开始lncRNA的研究?今天我们就褪去虚伪外衣，研究的大方向是这样子的：1. 寻找到lncRNA分子2. lncRNA分子表型研究3. lncRNA 通过何种机制调节表型？老谈将这些研究方向及实验手段按层次的方式绘成流程图，如下所示：首先，是样本的准备与收集。
高质量的样本是实验结果具有可靠性的前提。
其次，是lncRNA检测。
可以先通过芯片的方式高通量筛选到目的基因，然后通过q-PCR或Northern blot的方法验证所得到的芯片结果。
再次，其研究方向根据研究目的而定。
如果是研究生物标志物，那么可以通过收集更多的临床样本，研究lncRNA对疾病的指示作用。
如果是研究其功能，则是研究其细胞表型、分子表型及机制。
小伙伴们是不是觉得这和miRNA的总体研究思路相似呢？这时可以根据各自的实验平台条件选择相应的研究。
值得注意的是，lncRNA的功能研究并不像miRNA一样通过3’UTR影响翻译套路，总的来说lncRNA机制研究套路还不成熟。
对于很多科研工作者而言，lncRNA分子的获得及其细胞表型的获得并非难事，关键在于如何进行下一步研究，这时候就要涉及到对功能研究的定位。
探测长非编码RNA功能的研究策略
探测长非编码RNA功能的研究策略长非编码RNA（lncRNA）是一类超过200个核苷酸的RNA分子，没有编码蛋白质的能力，但在细胞中扮演着重要的调控角色。
研究lncRNA功能的策略主要包括以下几个方面：1. 高通量测序分析：利用RNA测序技术对lncRNA在不同组织和发育阶段的表达进行全面分析。
通过比较不同条件下lncRNA的表达变化，可以发现与特定生物过程或疾病相关的lncRNA。
2. lncRNA与DNA互作研究：采用染色质免疫共沉淀（ChIP）和DNase I超敏感性测定等技术，确定lncRNA与DNA之间的相互作用。
这些研究可以揭示lncRNA在染色质结构和基因转录调控中的功能。
3. lncRNA与蛋白质相互作用研究：运用RNA免疫沉淀（RIP）、RNA 结合蛋白质免疫共沉淀（RIP-Chip或RIP-Seq）和蛋白质质谱分析（MS）等技术，鉴定lncRNA与蛋白质之间的相互作用。
通过这些研究，可以发现lncRNA与转录因子、染色质修饰蛋白等的相互作用，揭示lncRNA在调控基因表达中的作用机制。
4. RNA干扰研究：采用RNA干扰技术或CRISPR-Cas9系统，通过敲除或过表达特定lncRNA，检验其对细胞功能和生理过程的影响。
同时，还可以利用CRISPR-Cas9系统对lncRNA进行定点突变，以研究lncRNA功能域和调控序列。
5. lncRNA亚细胞定位研究：利用细胞定位技术，如原位杂交、亚细胞分离等方法，研究lncRNA的亚细胞定位，进一步了解lncRNA的功能和调控机制。
6. 系统生物学方法：运用数学建模和计算模拟等系统生物学方法，研究lncRNA在细胞信号传导和调控网络中的作用。
通过结合基因表达数据和调控网络信息，可以预测和验证lncRNA的功能和调控机制。
总之，研究lncRNA功能的策略是多样化的，融合了实验和计算方法。
这些策略的综合应用将为我们进一步揭示lncRNA在基因表达调控和疾病发生机制中的重要作用提供重要的线索。
LncRNA的研究，读这一篇文章就足够了！
LncRNA的研究，读这一篇文章就足够了！1认识一下长非编码RNA 定义非编码RNA (non-coding RNA，ncRNA)指不翻译成多肽的RNA。
按照长度不同，短于200nt的归为小非编码RNA (small ncRNAs，sncRNAs)，长于200nt的归为长非编码RNA (long ncRNAs，lncRNAs)。
分类根据染色体上与编码基因的相对位置将lncRNA分为反义型(antisense lncRNAs)、内含子型(intronic lncRNAs)、反向型(divergent lncRNAs)、基因间型(intergenic lncRNAs)、启动子上游型(promoter upstream lncRNAs)、启动子型(promoter-associated lncRNAs)、转录起始位点型(transcription start site-associated lncRNAs) [1, 2] (图1)。
图1. 根据染色体上与编码基因的相对位置对ncRNA进行分类。
lncRNAs作用范围广泛，机制非常复杂，这里从基因调控的角度重点讲一讲。
为了方便大家的理解，咱们来看看lncRNA的特点。
简单讲，lncRNA的本质是RNA，是由核苷酸组成的长链，有以下几个优势：(1) 可以轻松的与同源DNA序列(转录lncRNA的基因以及序列相似的基因)结合；(2) 可以轻松的与同源RNA序列结合；(3) 其丝带般的特点可以折叠成复杂的二级结构，轻松与多种蛋白质结合。
也就是说，lncRNA情商极高，与上层领导(DNA)关系暧昧，与同事(RNA)关系很铁，与下属(蛋白质)关系紧密。
这样八面玲珑的lncRNA那肯定是相当吃得开啊。
2lncRNA参与转录前调控顾名思义，转录前调控就是对转录事件发生之前的准备阶段进行调控，主要指染色质开放或关闭状态的调控——想要使原来不转录的基因开启转录，就需要染色质从关闭状态转换为开放状态；想要使原来转录的基因不再转录，就需要染色质从开放状态转换为关闭状态。
lncrna研究方案
引言长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一类RNA分子，其长度通常超过200个核苷酸，并且不具备翻译成蛋白质的能力。
在过去的几年中，越来越多的研究表明lncRNA在调控基因表达、细胞生命周期以及疾病发生发展等方面起到重要的作用。
本文旨在介绍一种lncRNA的研究方案，包括实验设计、数据分析以及结果解读等方面。
实验设计样本采集首先，需要选择适当的样本进行研究。
根据研究目的和研究对象的不同，可以选择不同的样本来源，如细胞系、动物组织或者患者样本。
确保样本的来源和特性与研究问题相匹配。
RNA提取和测序在获得样本后，需要进行RNA的提取。
根据样本类型的不同，可以使用不同的方法进行RNA提取，如RNA提取试剂盒、酚/氯仿法等。
提取到的RNA质量和纯度需要进行评估，可以使用比色法、琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测。
提取到RNA后，可以选择不同的测序方法进行lncRNA的定量分析。
常见的测序方法包括转录组测序（RNA-Seq）和全长转录组测序（full-length transcriptome sequencing）等。
根据研究目的，选择合适的测序方法进行分析。
数据分析数据预处理在进行数据分析之前，需要对得到的测序数据进行预处理。
这一步骤包括去除低质量序列、去除接头序列、去除重复序列等。
常用的工具包括Trimmomatic、Cutadapt等。
数据比对和定量在预处理后，将得到的序列数据进行比对到参考基因组或转录组上。
选择合适的比对工具，如Bowtie、STAR等。
根据比对结果，可以对lncRNA进行定量分析，根据差异表达水平进行筛选。
功能分析对于不同表达的lncRNA，可以进行生物学功能的分析。
根据研究问题，可以选择不同的功能分析方法，如通路富集分析、功能注释等。
常用的工具包括GSEA、DAVID等。
结果解读根据上述的分析，可以得到不同lncRNA的表达差异结果，并进行生物学功能解读。
lncRNA功能研究手册
lncRNA功能研究手册随着生物技术检测手段的发展，我们发现人类基因组中90%的转录产物并不能翻译蛋白。
其中包含一类序列长度大于200 nt的非编码RNA——lncRNA。
这些年来的研究表明，lncRNA以多种调控方式决定了生物体发育，疾病发生等过程。
从目前发现的lncRNA 数目来说，已有5万余条。
但是，到目前为止，真正已知功能的lncRNA不到1000条。
所以，我们可以看到，lncRNA研究领域，还是一个充满了潜力的大宝库。
每一个研究领域，研究方向都有发现新的lncRNA功能的可能性。
1，lncRNA的研究策略汇总2．1 高通量筛选并确认ncRNA为非编码RNA经典的实验设计中，大多是通过高通量芯片或测序筛选差异表达的lncRNA，并通过各种生物信息学分析（GO、Pathway、cis-target、trans-target、co-expression、IPA、GSEA、WGCNA等）确认首选的lncRNA，并qRT-PCR验证表达，Northern blot 去验证高通量筛选的结果，并通过/ 或/ 或CPAT：/cpat/index.php等预测编码能力。
2.2 3’RACE、5’RACE 实验确认其全长目前，模式动物lncRNA数据库中收录的lncRNA 的cDNA序列相对比较准确，如果想针对某条lncRNA开展表观遗传方面的启动子、转录因子等研究，或者准备做miRNA与lncRNA的双荧光素酶实验，来验证某条miRNA可以调控lncRNA，则需要获取5’UTR、3’UTR 的序列。
2.3 细胞定位可以帮助找到lncRNA 作用方式的方向找到lncRNA 后，接下来的重要工作就是研究其调控方式。
从目前已有研究来说，lncRNA的调控方式是多种多样的，染色质调控，转录调控，转录后调控，只要你想得到的，都有它的身影。
那么，当我们知道某一条lncRNA 在细胞中特异性表达时，该怎么入手呢？“脑袋跟着屁股走”，在什么位置，担当着什么样的角色。
lncRNA研究
lncRNA研究技术手册一、lncRNA概述lncRNA (Long noncoding RNAs, lncRNAs) 长链非编码RNA，起初被认为是基因组转录的不具有生物学功能的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物。
然而，近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，lncRNA的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。
随着研究的推进，各类 lncRNA 的大量发现，lncRNA 的研究将是 RNA 基因组研究非常吸引人的一个方向，使人们逐渐认识到基因组存在人类知之甚少的“暗物质”。
lncRNA的功能分为3方面：1）通过修饰染色体参与表观调节-与mRNA相互作用；2）通过与转录因子的相互作用参与转录调节-与蛋白（转录因子）相互作用；3）通过影响mRNA处理过程参与转录后调节-ceRNA作用模式。
三种lncRNA机制作用方式，1和2主要发生于细胞核，3则发生在胞质。
从研究难度来说，1>2>3：1）的RNA interaction与array并无成熟的研究模式；2）需要RIP和RNApull-down，实验执行难度大风险高；3）转录后调节的研究方法-ceRNA作用模式可行性及阳性率较高，是目前研究最热门的lncRNA作用方式。
lncRNA的ceRNA作用模式：lncRNA作为竞争性内源RNA(competing endogenousRNA，ceRNA)，与microRNA结合，在细胞中起到microRNA海绵的作用。
从而降低microRNA的活性，间接上调microRNA相关靶基因的表达。
1汉恒生物科技(上海)有限公司 400-092-0065 地址：上海市浦东新区蔡伦路150号1号楼2楼 021-********图：lncRNA的ceRNA作用模式二、汉恒生物-lncRNA研究专家汉恒生物lncRNA研究团队，为您提供基于ceRNA调控机制的lncRNA系统研究方案。
【干货】lncRNA的功能研究关键点验证方法汇总
【干货】lncRNA的功能研究关键点验证方法汇总长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指长度大于200 nt不参与蛋白质编码的DNA 转录产物。
lncRNA与小RNA （如miRNA、siRNA和shRNA）的一个重要差异特征就是长度。
lncRNA 起初被认为是没有功能的转录垃圾。
近年来随着研究的不断深入，大多数lncRNA被确定为转录和翻译过程中的关键调控因子，在细胞正常功能发挥中有着重要影响。
最近人们认识到lncRNA 在许多生理、病理途径中发挥作用，如X染色体的沉默、基因组印记、染色体修饰、转录激活、转录干扰及核内运输等多种重要调控过程。
lncRNA 的生物功能lncRNA作用范围广泛，机制非常复杂，为了方便大家的理解，我们来简单看看lncRNA的特点：1. 在编码蛋白基因的上游启动子区转录，干扰邻近蛋白编码基因的表达2. 与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，调控基因的表达水平3. 结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性4. 作为小分子RNA的前体分子或者miRNA反义抑制分子5. 作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体简单概括就是：抑制基因表达；引导DNA-蛋白质结合；导致染色质重构，影响表观遗传。
lncRNA的功能研究lncRNA研究中非常关键的一步就是发现特定的lncRNA，通过高通量测序筛选候选lncRNA是一种准确快捷的方法。
lncRNA测序分析主要分为三步：利用探针去除核糖体目前针对研究较多的人、大鼠、小鼠，推荐使用 TIANSeq核糖体RNA去除试剂盒 (人/小鼠/大鼠) 进行高效核糖体去除，去除后利用qPCR验证rRNA去除效率，通常要求rRNA去除率高于90% 对富集后的RNA建库推荐使用TIANSeq快速RNA文库构建试剂盒（illumina平台）进行建库，流程如图所示：生物信息学分析lncRNA的生物信息学分析通常分为两部分分别是lncRNA和mRNA，主要包括：1. lncRNA 表达差异分析2. 新lncRNA 预测3. lncRNA-mRNA 共表达分析4. lncRNA 功能预测lncRNA的功能验证验证lncRNA的调控机制，需要对目标lncRNA进行体外验证或体内验证，研究作用分子的变化情况及对研究样本的功能调控影响，主要包括以下两个大类：体外实验功能验证lncRNA 功能验证RNA pull-down, CLIP-seq, ChIRP-seq, RIP-seq等功能获得性、缺失性研究过表达载体或siRNA等lncRNA 检测qPCR, FISH等，因lncRNA的表达丰度低于mRNA，推荐使用TIANGEN为lncRNA量身定做的定量检测试剂盒：lnRcute lncRNA 荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)体内实验验证1构建动物模型2导入过表达载体3检测动物表型变化、生化指标和相关基因表达明星产品推荐TIANSeq快速 RNA文库构建试剂盒（illumina平台），目录号：NR102★可针对mRNA和除rRNA外的非编码RNA（如lncRNA）进行转录组分析。
【原创】解读10分lncRNA文献4步法研究lncRNA功能
【原创】解读10分lncRNA文献4步法研究lncRNA功能今天解读的这篇文章发表在2013年6月的《nature communications》上。
作者利用二代测序研究了单核细胞系受细菌脂多糖应激后lncRNA 的表达变化。
然后通过knock out实验验证了两条lncRNA的潜在功能。
首先，我们来看看这篇文章的思路，其实功能研究文章的核心思路很简单，只有四步。
但是最核心就是第三步：找到目标分子。
而这篇文章找的目标分子是lncRNA，而且是enhance lncRNA，最后还证明的确有功能。
怎么找目标分子，首先分析文章主线：这篇文章是10分的，内容很多。
但文章的主线很简单，只有三步：1）处理和测序：利用细菌脂多糖处理细胞系，激发炎症反应，然后进行lncRNA测序2）lncRNA数据的分析：mRNA差异分析→ 找到关键应答的编码基因→以编码基因为线索找到候选lncRNA3）目标lncRNA功能分析与验证这篇研究之所以能发10分关键在于第二步1）如何将lncRNA 扯到 enhance RNA；2）如何将从大量lncRNA 中筛选有潜在功能意义的lncRNA接下来，我们就从第二步出发，看看作者是怎么一步步找到目标lncRNA的。
文章数据分析主线第二步：lncRNA数据的分析我们都知道，lncRNA是非编码的，要分析推测lncRNA的功能，只能利用编码gene为线索。
所以大部分lncRNA功能研究的文章，都符合“mRNA → lncRNA”的逻辑思路。
最常用的线索其实也就两条：1）lncRNA 和关键编码基因的位置关系；2）共表达关系。
由于这个研究只测了两组数据（处理组和对照组），无法计算相关系数，所以mRNA和lncRNA位置关系就是最核心的信息的。
那么，作者又是如何找到目标lncRNA的呢？1、RNA-seq结果表明细菌脂多糖引起先天免疫应答一个与炎症反应相关的基因IL1β在炎症反应下表达第二高。
两篇文章告诉你lncRNA的主要研究思路
两篇文章告诉你lncRNA的主要研究思路长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）一般指不具有蛋白编码能力，转录本长度超过200 nt的RNA分子，包括intronic/exonic lncRNAs、antisense lncRNAs、overlapping lncRNA和long intergenic ncRNAs（lincRNAs）。
LncRNA与细胞周期和分化、发育、生殖、性别调控、衰老以及多种人类疾病密切相关。
lncRNA数量比较多，大约是为mRNA的3-100倍，但是目前多数lncRNA的功能仍不清楚，有很大的研究空间。
最近，有文章报道lncRNA可以编码微肽并具有特定生物学功能，又拓展了新的研究方向。
因此，lncRNA是目前生物和医学研究中的热点话题之一。
高通量研究lncRNA主要思路1. 利用组学研究LncRNA时空表达模式包括不同发育阶段、疾病发展进程等生物学连续过程中的lncRNA 的种类、数量和表达丰度。
2. 候选lncRNA的功能研究高通量筛选出对照组/处理组、处理不同时间点间以及其它生物学相关差异候选lncRNA，再进行后续功能学研究或作为疾病治疗靶点和biomarker研究。
3. LncRNA-mRNA或LncRNA-lncRNA interaction调控生物学功能研究例如利用Genome-scale RNA interactome analysis（RIA-Seq）分析到TINCR lncRNA与多种mRNA结合调控细胞发育。
4. miRNA-dependent CeRNA研究（转录组层面）。
5. LncRNA的多组学研究（基因组、转录组、表观组学等多层面）。
6. LncRNA编码肽段的研究高通量预测组学lncRNA数据的蛋白编码能力，生信分析流程中保留可以编码的lncRNA进行后续研究。
下面我们通过两篇基迪奥项目文章，看看别人如何研究lncRNA 的表达模式。
lncRNA研究策略与技术
lncRNA研究策略与技术————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：2lncRNA研究策略与技术研究背景：长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200 bp以上，起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能；近期的研究表明lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控，尤其在肿瘤当中发挥了重要的调控角色，如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调解以及作为miRNA的诱导分子干扰基因的表达等，图1所示。
随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。
转录激活 B. A.lncRNA。
染色质重组1. lncRNA图参与肿瘤生物学调控，红色线状图表示诱导分子 E.转录后修饰和抑制 C.蛋白抑制 D.锐博生物提供研究思路：筛选的研究方法：差异lncRNA 3案例解读：lincRNA)RNA seq发现一案例(lincRNA多个人的24种组织样本进行RNA测序发现了8000研究小组对1. 2011年，Rinn的数量及多个参考数据库找到的lincRNA的流程图利用图2. A.RNA-seq预测lincRNA B.交集及用软件组装的结果的表达具有组织特异性2. lincRNA在不同组织当中的表达情况图3. lincRNAmRNA和4可以成为各种肿瘤的生物标志物)lncRNA(二案例2012斯坦福大学医学院研究人员进行首个大型的癌症lncRNA表达谱分析。
对64个肿瘤样。
新的lncRNA在各种肿瘤类型之间找出差异表达的1065个已知的以及1072品高通量测序，表达谱分析4.图肿瘤和对照样品lncRNAlncRNAlncRNA-mRNA共表达网络筛选关键三案例()lncRNA表达谱芯片结合针对肝脏再生过程(PH)小鼠在不同的时间点，2/3第二军医大学的研究人员利用肝部分切除共表达网络分析找到了一个mRNAlncRNAlncRNA芯片表达谱分析。
lncRNA研究策略之RNAPullDown实验技术
【实验技巧】 lncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术lncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术RNA pull-down是检测 RNA结合蛋白与其靶RNA 之间相互作用的主要实验手段之一。
RNA pull-down 使用体外转录法标记生物素RNA探针，尔后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA- 蛋白质复合物。
该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分别。
复合物洗脱后，经过Western Blot实验检测特定的 RNA 结合蛋白可否与RNA 相互作用。
1) lncRNA 精选：经过 lncRNA 芯片或 RNA测序等方法对多对疾病模型和比较样本组织进行lncRNA表达谱解析；经过生物信息学的方法精选出拥有表达差其他lncRNA ，成立共表达网络，展望lncRNA的靶基因；经过 PCR 或 Northern Blot技术对候选lncRNA 考据，确定其表达差异。
2) lncRNA 确定：经过 5' RACE获得 lncRNA 5'全长， 3' RACE获得 lncRNA3'全长，最后拿到完满的lncRNA 序列。
3) 表达解析：细胞水平表达：在细胞水平进行检测表达差异。
组织分布：检测不同样组织、不同样阶段表达特点。
表达水平动力学变化：比较不同样办理条件下，如药物办理、引诱办理下，表达水平差异。
4)功能研究：功能获得性研究：成立 lncRNA 过表达载体 :原那么上是将全长 lncRNA定向克隆到表达载体上实现 lncRNA 的过表达。
可是有些lncRNA 很大或全长还没有分别，这时将视lncRNA 在基因组上的定位采用不同样的研究策略。
功能缺失性研究：可经过 siRNA 、shRNA 、反义核酸等方法默然lncRNA ，干预 lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响；采用 RNA pull down、 RNA-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation)、ChIRP-seq(Chromatin Isolation by RNA Purification)等方法检测与 lncRNA 结合的 DNA 、RNA 、蛋白质。
lncRNA研究的常见思路与策略
lncRNA研究的常见思路与策略lncRNA起初被认为是基因组转录的“噪⾳”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有⽣物学功能。
然⽽⼤量研究表明，lncRNA在细胞核内、核外，通过染⾊质修饰，转录调控，转录后调控等多种⽅式调节基因表达，在肿瘤发⽣发展中具有重要作⽤。
lncRNA功能研究的基本思路⼀般来说，lncRNA功能研究的主线包含3个主要步骤：（1）⾼通量筛选。
全转录组测序和lncRNA芯⽚是⽬前最常⽤的技术⼿段，通过这种⾼通量的筛选⽅法，可以快速获得不同实验组间差异表达的lncRNA和mRNA。
（2）候选lncRNA的确定。
通过⽣物信息学分析，从⼤量lncRNA 中筛选有潜在功能意义的lncRNA。
（3）⽬标lncRNA的功能分析与验证。
根据上述⽣物信息分析推断出lncRNA可能的⽣物学功能，并设计相应的实验来验证假设是否成⽴。
lncRNA研究的基本流程LncRNA的⼀般研究策略1. lncRNA筛选通过lncRNA芯⽚或RNA测序等⽅法对多对疾病模型和对照样本组织进⾏lncRNA表达谱分析；通过⽣物信息学的⽅法筛选出具有表达差异的lncRNA，预测lncRNA的靶基因，构建共表达⽹络；通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。
lncRNA筛选建议根据统计学筛选，⽐如fold-change和p-value，同时表达量⾼的根据lncRNA在基因组上的位置进⾏筛选根据lncRNA的靶基因进⾏筛选，筛选和表型相关的lncRNA根据lncRNA与mRNA在表达上的协同关系进⾏推断，筛选具有hub地位的lncRNA根据lncRNA与protein的关系进⾏筛选根据lncRNA与miRNA的靶向关系筛选2. lncRNA全长克隆可以通过5'RACE获取lncRNA 5'全长，3'RACE获取lncRNA 3'全长，最终拿到完整的lncRNA序列。
lncRNA研究策略之RNAPullDown实验技术
【实验技巧】lncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术lncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。
RNA pull-down使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。
该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。
复合物洗脱后，通过Western Blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。
1) lncRNA筛选：通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析；通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA的靶基因；通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。
2) lncRNA确定：通过5' RACE获取lncRNA 5'全长，3' RACE获取lncRNA3'全长，最终拿到完整的lncRNA序列。
3) 表达分析：细胞水平表达：在细胞水平进行检测表达差异。
组织分布：检测不同组织、不同阶段表达特性。
表达水平动力学变化：比较不同处理条件下，如药物处理、诱导处理下，表达水平差异。
4) 功能研究：功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体:原则上是将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现lncRNA的过表达。
然而有些lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视lncRNA在基因组上的定位采取不同的研究策略。
功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响；采用RNA pull down、RNA-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation)、ChIRP-seq(Chromatin Isolation by RNA Purification)等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。
lncRNA引物设计总结以及注意事项
LncRNA设计引物时，一定要与mRNA区分开来。
点击下方的Nucleotide Blast选项：
把序列复制到框内，点击blast选项：
出来的结果如下：
出来的结果中有这种”mRNA”字样的点进去，看它对应的序列是啥，设计引物的时候避开与mRNA一样的序列。
注意：lncRNA一定要设计巢式引物，因为它本底表达很低。
（设计原则与mRNA引物是一样的）
引物设计为巢式引物，大引物片段为300-400 bp，小引物片段为200 bp左右。
引物条件摸索阶段：
一轮：cDNA为模板，大引物。
跑胶检测。
二轮：一轮产物（稀释倍数10 、100 、1000）为模板，小引物。
跑胶检测。
二轮跑胶检测有单一目的条带的可继续做后续RT-PCR。
RT-PCR：二轮产物（稀释倍数为上一轮确定的最佳倍数）为模板，小引物。
一轮退火：50℃，二轮55℃。
LncRNA调控机制及研究策略
LncRNA调控机制及研究策略长链非编码RNA（long noncoding RNAs，LncRNAs）是一类转录本长度超过200nt的功能性RNA分子，其表达水平相对于蛋白编码基因较低，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达水平。
研究表明：LncRNAs在X染色体沉默、基因组印迹、染色体修饰、转录激活、转录干扰以及核内运输等方面具有重要的功能。
其主要的调控机制如图1所示：图1. LncRNA的调控机制根据所发现的lncRNA的作用机制，lncRNA主要可能具有以下几个方面的功能：1）通过在蛋白编码基因上游启动子区（桔）发生转录，干扰下游基因（蓝）的表达（如酵母中的SER3基因）。
2）通过抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因（蓝）表达（如小鼠中的p15AS）。
3）通过与蛋白编码基因的转录本形成互补双链（紫），进而干扰mRNA的剪切，从而产生不同的剪切形式。
4）通过与蛋白编码基因的转录本形成互补双链（紫），进一步在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA，调控基因的表达水平。
5）通过结合到特定蛋白质上，lncRNA转录本（绿）能够调节相应蛋白的活性。
6）作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体。
7）通过结合到特定蛋白上，改变该蛋白的胞质定位。
8）作为小分子RNA，如miRNA，piRNA的前体分子。
图2. LncRNA的研究策略LncRNA的一般研究策略如图2所示，其过程主要包括LncRNA 筛选、LncRNA确定、表达分析、功能研究和表达调控。
1) LncRNA筛选通过lncRNA芯片或RNA-seq等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析；通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA的靶基因；通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。
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lncRNA
circRNA
2
LncRNA 概述 ——lncRNA的发现
1980s-1990s: Individual lncRNAs are discovered through traditional gene mapping approaches, Xist and H19.
Early 2000s: Development of large scale cDNA sequencing leads to the discovery of a surprising number of lncRNA transcripts.
lncRNA的类别
Knauss and Sun, Neuroscience 2013
lncRNA研究策略
组织，细胞，外周血
lncRNA芯片
RNA-seq
难点
候选lncRNA
差异倍数大的 表达量高的 靶基因功能相关的 共表达网络中的hub 结合TF靶基因数据 结合不同分类
生物标志物
机制研究
• 高通量：包含88,371条circRNA，68,423条lncRNA、18,853条mRNA，让您的筛选范围更广； • 特异性高：环状RNA -特异的反向剪接位点探针设计，保证每个探针检测的特异性，避免与母基因之间的
冗余影响。基于circbase数据库信息;
LncRNA基本特点
• > 200nt • have little or no open reading
frame (ORF) • Polyadenylated are not necessary
(more than 40% of transcripts are non-polyadenylated) • Generally lower expressed than protein-coding genes • more tissue-specific expression patterns, with a large fraction of tissue-specific lncRNAs expressed in the brain. • general long ncRNAs lack strong conservation
技术特点： 1）芯片采用Agilent eArray平台设计，使 用Agilent SurePrint技术合成，探针长 60mer，检出率高，技术重复性高于99%； 2）覆盖主流数据库几乎所有lncRNA和 mRNA，可同时检测lncRNA和mRNA， 并挖掘两者之间的关联； 3）随机引物扩增方式，可同时扩增带 Ploy-A和不带Poly-A的lncRNA，
训练集 验证集 生存分析 ROC曲线
沉默/过表达---功能实验 RIP-seq， pull down ChIP-seq
上海伯豪lncRNA芯片服务（Agilent 平台）
上海伯豪针对广大客户的需求，开发出 全新的SBC-lncRNA芯片，并利用 Agilent公司专利的SurePrint技术制 造。为您提供完善的基因芯片技术服务， 并完成数据分析，提供完整的实验报告。
深度解密lncRNA研究策略及注意事项
张晓娜 上海伯豪生物技术有限公司
共表达网络构建
高通量转录组检测对象
RNA transcripts
Protein-coding RNA(mRNA)
Non-coding RNA(非编码RNA)
Regulatory RNAs
Housekeeping RNAs
miБайду номын сангаасroRNA
上海伯豪lncRNA相关芯片服务
SBC V6版LncRNA芯片，探针合成基于Agilent SurePrint技术，收录的lncRNA涵盖 几大主流数据库（NCBI, UCSC, Ensembl，Gencode，Lncipedia，Noncode）， 助力您的科研工作！
ClariomTM D是昂飞公司最新开发的芯片，为您提供支持所有转录本异构体的全转录组 分析。同时，针对超过540,000个转录本的探针设计，还可帮助您对非编码RNA进行 分析。
技术重复性高于99%；利用芯片碱基互补杂交的方式，能够对整体表达丰度较低的circRNA更灵敏、稳定地 进行检测;
• 超值：覆盖circRNA、lncRNA、mRNA。一份芯片数据同时提供三个层面的表达信息，circRNA和lncRNA
作为典型的内源竞争性RNA，此款芯片可以让您畅游ceRNA调控研究; 。挑战性样本（血清、血浆、外泌体） 同样适用;
lncRNA同时在细胞核和细胞质内发挥功能 http://www.rikenresearch.riken.jp/eng/frontline/5920
lncRNA的功能
Magdalena Losko, Jerzy Kotlinowski, and Jolanta Jura, 2016, Mediators of Inflammation
Mid 2000s: The number of predicted genes in the mammalian genome goes down and the number of detected lncRNA transcripts increases exponentially.
国自然资助lncRNA项目数量逐年上升
产品
lncRNA
SBC lncRNA V6 77,127
mRNA 18,854 (RefSeq)
Human
ClariomTM D (Affymetrix）
SBC lncRNA V6
32,973 58,953
18,818 20,146 (RefSeq)
Mouse
ClariomTM D （Affymetrix）
SBC lncRNA V6
~40,000 23,259
~20,000 16,623 (RefSeq)
Rat
ClariomTM D
~25,000
（Affymetrix）
~20,000
SBC human ceRNA 芯片v1
技术优势：
• 稳定：芯片采用Agilent eArray平台设计，使用Agilent SurePrint技术合成，探针长60mer，检出率高，