B-Cas9敲进小鼠
构建诱导型CRISPRCas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究
Vol.41No.3Mar.2021上海交通大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE)构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究赵艳娜1*，邱荣2*，沈南1，唐元家11.上海交通大学医学院附属仁济医院风湿病科，上海市风湿病学研究所，上海200127；2.中国科学院上海营养与健康研究所，上海200031［摘要］目的·结合Dox 诱导型单链导向RNA （single guide RNA ，sgRNA ）表达载体和Cas9转基因小鼠，构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。
方法·根据四环素诱导表达系统原理，基因合成U6-TetO-sgRNA 和EF1α-T2A-Puro-BFP-T2A-TetR 片段。
通过同源重组将2个片段组装进反转录病毒载体骨架，获得Dox 诱导型sgRNA 反转录病毒载体。
为了验证系统有效性，分离Cas9转基因小鼠骨髓细胞并诱导其向巨噬细胞方向分化。
设计对照（non-targeting control ，NC ）组和实验组（靶向F4/80）的sgRNA ，利用反转录病毒感染细胞，分化条件设置添加Dox 组（Dox +）和不添加Dox 组（Dox -）。
通过流式细胞术和T7核酸内切酶Ⅰ（T7endonuclease Ⅰ，T7E Ⅰ）实验检测基因敲除效果。
结果·①成功构建Dox 诱导型sgRNA 反转录病毒表达载体和Cas9转基因小鼠。
②流式结果显示，在NC Dox -组、NC Dox +组和F4/80Dox -组中，几乎无F4/80阴性细胞群体；而在F4/80Dox +组中，F4/80阴性细胞群体高达50%。
③T 7E Ⅰ结果显示，在F4/80Dox -组中，DNA 条带完整，而在F4/80Dox +组中发生基因突变，DNA 条带被切开。
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，CRISPR-Cas9系统已成为一种强大的工具，用于在生物医学研究中精确地编辑基因组。
DUSP9基因作为一种重要的基因，其功能在多种生物学过程中起着关键作用。
因此，构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，对于研究DUSP9基因的功能及其在疾病发生发展中的作用具有重要意义。
本文旨在详细介绍利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的过程。
二、材料与方法1. 材料小鼠胚胎干细胞（mESCs）、CRISPR-Cas9系统、相关基因编辑工具、培养基、生长因子等。
2. 方法（1）设计CRISPR-Cas9系统：根据DUSP9基因的序列信息，设计合适的CRISPR-Cas9系统，包括sgRNA和Cas9蛋白。
（2）制备mESCs细胞：培养mESCs细胞至合适的状态，以便进行基因编辑。
（3）转染与编辑：将CRISPR-Cas9系统转染至mESCs细胞中，利用Cas9蛋白对DUSP9基因进行切割。
（4）筛选与鉴定：通过PCR、Western blot、qRT-PCR等方法，筛选出成功敲除DUSP9基因的mESCs细胞，并进行鉴定。
三、实验过程1. 设计并构建CRISPR-Cas9系统，选择合适的sgRNA序列和Cas9蛋白表达载体。
2. 培养mESCs细胞至合适的状态，进行转染。
3. 观察转染后的细胞生长情况，确保Cas9蛋白的表达。
4. 利用PCR、Western blot、qRT-PCR等方法筛选出成功敲除DUSP9基因的mESCs细胞。
5. 对筛选出的细胞进行扩增培养，并保存于液氮中备用。
四、结果与讨论1. 结果（1）成功构建了CRISPR-Cas9系统，并将其转染至mESCs 细胞中。
（2）成功筛选出敲除DUSP9基因的mESCs细胞，并通过PCR、Western blot、qRT-PCR等方法进行了鉴定。
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，CRISPR-Cas9系统已成为现代生物医学研究中常用的基因编辑工具之一。
它为科研人员提供了强大的基因敲除、插入或突变的能力，在多种模型动物制备及疾病研究领域具有广泛的应用前景。
本文旨在介绍利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的过程，为相关研究提供技术参考。
二、材料与方法1. 材料(1) CRISPR-Cas9系统相关组件（包括Cas9蛋白、sgRNA 等）；(2) 小鼠胚胎干细胞系；(3) DUSP9基因特异性敲除载体；(4) 培养基、试剂及其他实验耗材。
2. 方法(1) 设计并构建DUSP9基因敲除载体；(2) 准备小鼠胚胎干细胞系并进行细胞培养；(3) 将DUSP9基因敲除载体与胚胎干细胞共培养，实现基因编辑；(4) 筛选并扩增成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞；(5) 对敲除细胞进行鉴定及保存。
三、实验过程1. DUSP9基因敲除载体的构建根据DUSP9基因序列，设计并合成sgRNA序列，构建DUSP9基因敲除载体。
通过PCR扩增获得目的片段，将其克隆至载体中，构建成功后的载体通过测序验证其准确性。
2. 小鼠胚胎干细胞的培养与准备将小鼠胚胎干细胞置于适宜的培养条件下进行培养，待细胞生长至适宜状态时进行后续实验。
3. 基因编辑及筛选将DUSP9基因敲除载体与小鼠胚胎干细胞共培养，通过CRISPR-Cas9系统实现DUSP9基因的敲除。
随后，通过PCR、测序等方法筛选出成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞。
4. 鉴定与保存对筛选出的成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞进行鉴定，包括细胞形态观察、生长曲线绘制、基因型鉴定等。
将鉴定合格的细胞进行保存，以备后续实验使用。
四、结果与讨论1. 结果通过CRISPR-Cas9系统成功构建了DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，并筛选出成功敲除DUSP9基因的细胞。
crispr-cas9基因敲除小鼠原理
CRISPR—CAS9基因敲除原理
CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。
CRISPR 是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。
在这一系统中,crRNA（CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。
Cas9结合gRNA，gRNA 的长度约为80个核苷酸,包含两个区域:gRNA 5' 端前20个核苷酸对应于靶标DNA，能结合在靶DNA 上的约60个核苷酸（gRNA 长度取决于表达gRNA 的质粒）形成一个发夹结构，这个结构能帮助gRNA 与Cas9结合,并由此指导与DNA 的结合.
通过gRNA上的靶点序列，在目标基因组上找到靶点序列，并揭开双螺旋，Cas9将剪切DNA双链，造成DNA双链断裂。
Cas9使用简单，可满足多个靶点同时操作。
Insertion /deletion NHEJ HDR
gRNA
Cas9
Donor vector
基因敲除小鼠流程：。
使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案
使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案虽然近年来已经开发了几种基因组编辑工具，包括锌指结构和 TALENs（转录激活物样效应物核酸酶），但没有一种能像CRISPR/Cas9系统那样高效，该系统由一个RNA引导的DNA内切酶 (Cas9) 和对应的引导RNA(CRISPR) 组成。
利用该系统，研究人员能够实现一步敲除多个基因的等位基因的突变小鼠1。
只需两三周的时间，即可创造出子携带条件性等位基因和报告基因的小鼠2，并且该方案。
特别要注意的是，该过程不需要创建修改的小鼠ES细胞过程，该过程有时会十分困难3。
随着 Cas9 敲入和敲除小鼠的发展，预计越来越多的实验室将选择 CRISPR/Cas9 系统来生成转基因小鼠模型。
使用CRISPR-Cas9创建转基因小鼠的方案动物学研究。
2016 年 7 月 18 日；37(4): 205–213.利用 CRISPR/Cas9 和单倍体胚胎干细胞系统产生基因修饰的小鼠。
图 1.在小鼠胚胎上使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑创建转基因小鼠的示意图。
通过共注射 Cas9 mRNA 和向指导 RNA，多个基因靶标可以在小鼠胚胎中一次敲除。
（改编自Yang H，Wang H 和 Jaenisch R. Nat Protoc。
2014 年 8 月；9(8):1956-68.）Sigma-Aldrich 是为基因组编辑提供工具和定制服务的领导者，包括 ZFN 和CRISPR/cas9。
默克还提供了广泛的小鼠胚胎验证培养基和试剂组合，用于储存、转移和扩增用于在EmbryoMAX™名下创建转基因小鼠模型的小鼠胚胎。
浏览所有的基因组编辑产品浏览所有经小鼠胚胎验证的试剂小鼠胚胎和ES细胞培养基小鼠ES细胞培养基实验方案和过程成功的小鼠模型项目的提示1.了解实验目的并开展研究。
生成正确的小鼠需要完全理解被测试依据的假设。
例如，研究者可能希望验证这样的假设：突变肝脏中的转运蛋白可能会减轻特定药物的肝毒性作用。
基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠(Cas9-KO)的制作方法-2018-2-28
基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠（Cas9-KO）的制作方法一、CRISPR/Cas9靶向基因敲除小鼠制作的基本技术原理：通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合，形成双链RNA。
这一tracrRNA:crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切双链DNA。
在与crRNA引导序列互补的位点，Cas9蛋白的HNH核酸酶结构域剪切互补链而Cas9 RuvC-like 结构域剪切非互补链，实现敲除目的基因的功能，制备基因敲除小鼠模型。
二、具体步骤如下：一）模型制作策略制作：利用生物信息学手段(NCBI&IMPC&MGI)，分别仔细分析目的基因敲除后小鼠的生存能力及繁育能力，并结合邻近基因的影响，最终选择合适的敲除区域进行敲除方案的设计，出具相应的制作策略。
二）载体的设计和构建：使用麻省理工学院的CRISPR Design工具（/），依据中靶Score的高低及脱靶Score的高低设计一对长度为20bp的针对靶标DNA的寡聚核苷酸链序列用于制备sgRNA，并在该靶区域设计引物用于后续阳性小鼠的基因鉴定。
1、制备sgRNA的实验方法步骤：1）线性化pUC57-GDNA-T7载体中提pUC57-GDNA-T7载体，用BsaI线性化过夜。
胶回收保存备用。
2）引物退火及加磷酸将上下游引物（干粉）稀释，再进行引物退火及加磷酸。
3）连接&阳性菌落筛选取步骤二中的加磷酸产物与线性化载体pUC57-GDNA-T7进行连接，该连接反应在干式恒温器中进行。
对连接产物进行转化，涂板，37°C培养箱过夜培养。
再用PCR&测序的方法筛选阳性克隆，再将测序正确的克隆进行甘油菌保种，-80°C保存备用4）制备转录模板以构建好的sgRNA载体为模板进行PCR扩增，将PCR产物切胶回收，回收产物离心后倒掉上清留DNA沉淀，再溶解DNA。
《2024年利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言在生物学研究领域，基因编辑技术日益显示出其巨大的潜力和应用前景。
CRISPR-Cas9系统作为一种强大的基因编辑工具，已在多个物种中成功用于构建基因敲除模型。
本文旨在介绍如何利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，为相关研究提供参考。
二、材料与方法1. 材料（1）小鼠胚胎干细胞（mESCs）；（2）CRISPR-Cas9系统相关试剂；（3）DUSP9基因敲除载体；（4）显微操作设备及试剂；（5）实验动物（小鼠）。
2. 方法（1）设计并构建DUSP9基因敲除载体；（2）将载体与mESCs共转染，使DUSP9基因发生双链断裂；（3）利用CRISPR-Cas9系统对断裂的DUSP9基因进行修复，形成基因敲除突变；（4）筛选并扩增基因敲除的mESCs；（5）将基因敲除的mESCs注射到小鼠囊胚中，生成转基因小鼠。
三、实验过程1. 载体构建及转染首先，设计并构建DUSP9基因敲除载体。
该载体应包含靶向DUSP9基因的识别序列、切割位点及修复模板。
随后，将载体与mESCs共转染，使DUSP9基因发生双链断裂。
此过程需在显微操作下进行，确保转染效率和准确性。
2. CRISPR-Cas9系统修复及筛选利用CRISPR-Cas9系统对断裂的DUSP9基因进行修复。
通过非同源末端连接或同源重组等方式，使基因发生突变，形成DUSP9基因敲除的突变体。
随后，通过PCR、测序等方法筛选并扩增基因敲除的mESCs。
3. 转基因小鼠生成及鉴定将扩增得到的基因敲除的mESCs注射到小鼠囊胚中，通过胚胎移植技术生成转基因小鼠。
随后，通过PCR、免疫组化等方法对转基因小鼠进行鉴定，确认DUSP9基因是否成功敲除。
四、结果与讨论1. 结果利用CRISPR-Cas9系统成功构建了DUSP9基因敲除的小鼠胚胎干细胞系。
通过PCR、测序等方法验证了DUSP9基因的敲除效率及准确性。
《2024年利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言在生物学研究中，基因敲除是一种重要的技术手段，能够精确地操控特定基因的表达，进而研究基因在生物体中的功能。
近年来，随着基因编辑技术的发展，尤其是CRISPR-Cas9系统的广泛应用，基因敲除技术得到了极大的推进。
本文旨在探讨利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的方法和步骤，为进一步研究DUSP9基因的功能提供技术支持。
二、CRISPR-Cas9系统简介CRISPR-Cas9系统是一种基于细菌免疫系统的基因编辑技术，具有高效、精确的基因编辑能力。
该系统通过设计特定的RNA 引导序列与Cas9蛋白结合，形成复合物，识别并切割靶点DNA 序列，从而实现基因的敲入、敲除或替换等操作。
三、DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的构建1. 靶点设计：首先需要确定DUSP9基因的敲除靶点，设计相应的sgRNA和Cas9蛋白序列。
通过分析DUSP9基因的序列，找到合适的位置作为靶点。
2. 胚胎干细胞系的获取：选取适合的小鼠胚胎干细胞系，确保其处于稳定的生长状态。
3. CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑：将设计好的sgRNA和Cas9蛋白通过特定的方式（如质粒转染、病毒载体等）引入小鼠胚胎干细胞中。
在细胞内，sgRNA和Cas9蛋白形成复合物，识别并切割DUSP9基因的靶点。
4. 克隆筛选和鉴定：经过一段时间的培养和筛选，挑选出发生基因突变的小鼠胚胎干细胞克隆。
通过PCR、测序等分子生物学手段，鉴定克隆中DUSP9基因的敲除情况。
5. 细胞系建立：将鉴定成功的DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞进行传代培养，建立稳定的细胞系。
四、实验结果与讨论通过上述步骤，我们成功构建了DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系。
在实验过程中，我们观察到CRISPR-Cas9系统对DUSP9基因的切割效率较高，成功获得了多株基因敲除克隆。
用CRISPR Cas9方案构建双基因敲除鼠, 获得双基因敲除纯合子小鼠的交配方案
双基因敲除小鼠繁殖工作：CRISPR/Cas9方案构建双基因敲除鼠，得到F0杂合子之后，如何建系才能获得双基因敲除纯合子小鼠？这是经常被问到的问题，下面就简单回答一下。
假设我们的目的基因为A和B，通常用CRISPR/Cas9方法得到的基因敲除鼠为杂合子，双杂合子小鼠基因型为AaBb，大写字母代表野生型（dominant），小写字母代表突变型（recessive）。
得到F0杂合子（AaBb）之后，可以用以下方案之一来获得双基因敲除纯合子小鼠：方案一：1.将双杂合子小鼠（AaBb）与野生鼠（AABB）交配，理论上将得到25%的野生型（AABB），25%基因A单杂合子（AaBB）,25%基因B单杂合子（AABb）及25%双杂合子小鼠（AaBb）。
2.将所得到的双杂合子小鼠（AaBb）互交（inter-cross），理论上6.25%的后代将会是双基因敲除纯合子小鼠（aabb），见下图。
3.由于双基因敲除实验中一般都需要单基因敲除动物作为对照，所以在进行上面小鼠breeding的同时可以将基因A单杂合子（AaBB）互交，在后代中鉴定出基因A纯合子（aaBB）,同样将基因B单杂合子（AABb）互交，在后代中鉴定出基因B纯合子（AAbb）。
方案二：将双杂合子小鼠（AaBb）与单基因纯合子（如aaBB）交配，所生小鼠中约25%为基因A纯合子而基因B杂合子（aaBb,见下图左）。
然后将aaBb小鼠互交，理论上后代小鼠中25%为双基因敲除纯合子小鼠（aabb），见下图右。
需要特别注意的几个问题：1)上面所讲的方法适用于位于不同的染色体两个基因的基因敲除，如果两个基因位于同一条染色体上，要通过上述方法得到双基因敲除纯合子小鼠很难；2)上述方法有赖于基因特异性的Genotyping PCR assays。
在开始setup breeding之前必须将两个目的基因特异性的Genotyping PCRassays 准备好；3)要事先研究一下目的基因敲除后有无胚胎致死性，是否影响其生长发育等。
Cas9 TALEN CRISPR条件性敲除小鼠的原理
条件性敲除小鼠的原理
目前的条件性敲除小鼠主要是基于Cre-LoxP系统的。
Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。
传统的条件性敲除
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
传统方法，首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
第二步，通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。
在细胞水平上，可以用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别 LoxP位点将抗性标记基因切除；在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。
将Cre基因置于可诱导的启动子控制下，通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的基因切除（诱导性基因敲除），实现特定基因在特定时间或者组织中的失活。
一般需要一年以上的时间，价格在15-20万不等。
华夏凯奇基于Cas9系统的条件性敲除
原理上和传统的条件性敲除类似，差别在于华夏凯奇利用Optimized Cas9/CRISPR System(OCAS)技术在基因组上加入loxp序列，可以快速获得Loxp 位点插入的小鼠。
目前我们一般只需要4-5个月。
价格也比传统方法大大降低。
组织特异沉默BMP4基因转基因小鼠模型的构建及表达分析
组织特异沉默BMP4基因转基因小鼠模型的构建及表达分析组织特异沉默BMP4基因转基因小鼠模型的构建及表达分析摘要：骨形成蛋白4（BMP4）是一个关键的信号蛋白，参与胚胎发育、组织再生和生物变态反应等多个生理过程。
为了研究BMP4在特定组织中的功能，本研究构建了一个组织特异性失活BMP4基因的转基因小鼠模型。
通过利用CRISPR/Cas9系统设计和构建特异性敲除BMP4的基因突变，将其导入小鼠胚胎干细胞，进而获得BMP4基因敲除的转基因小鼠模型。
经过表达分析，我们发现BMP4基因敲除对小鼠胚胎发育和骨骼形成产生了显著影响。
这一模型的构建和表达分析为进一步研究BMP4的功能和机制提供了有力工具。
引言：骨形成蛋白4（BMP4）属于TGF-β超家族，通过与其受体结合，在多种细胞类型中调控细胞增殖、分化和细胞间相互作用等多种细胞生物学功能。
由于其重要的生物学功能，BMP4在胚胎发育、骨骼形成、神经系统发育以及造血细胞分化等过程中扮演着关键角色。
为了深入研究BMP4的功能和调控机制，需要构建一种特异性失活BMP4基因的转基因小鼠模型。
方法：本实验通过CRISPR/Cas9系统对小鼠胚胎干细胞进行基因编辑，具体利用设计和合成一对特异性的切割RNA （sgRNA）靶向BMP4基因进行敲除。
将合成的sgRNA转染入小鼠胚胎干细胞，并通过PCR和测序确认基因编辑的效果。
接着将编辑后的胚胎干细胞移植入小鼠胚胎中，利用体细胞核移植的方法获得敲除BMP4基因的转基因小鼠模型。
结果：经过PCR和测序验证，我们成功构建了敲除BMP4基因的转基因小鼠模型。
通过RT-PCR和免疫组化等方法，我们对该转基因小鼠模型的BMP4基因表达进行了分析。
结果显示，在BMP4基因敲除的转基因小鼠模型中，BMP4的基因表达显著降低。
在胚胎发育过程中，我们观察到敲除BMP4基因的小鼠胚胎存在畸形和生长迟缓的表型。
此外，骨骼形成实验证明，敲除BMP4基因的小鼠骨骼出现明显的缺陷，体外骨形成实验证实了BMP4敲除对骨细胞分化和成骨能力的抑制作用。
小鼠大脑基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景随着神经科学研究的深入，理解大脑的基因调控机制对于揭示神经疾病的发生机理和开发新的治疗方法具有重要意义。
本研究旨在通过基因编辑技术，探究特定基因在小鼠大脑发育和功能中的作用，为相关疾病的预防和治疗提供新的思路。
二、实验目的1. 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除小鼠大脑中特定基因。
2. 观察基因敲除对小鼠大脑发育、行为和认知功能的影响。
3. 分析敲除基因对小鼠大脑中相关通路和基因表达的影响。
三、实验材料与方法1. 实验材料- 小鼠胚胎干细胞（ES细胞）- CRISPR/Cas9系统- 实验小鼠（C57BL/6小鼠）- 实验试剂：DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR引物等2. 实验方法（1）基因编辑1. 设计靶向特定基因的CRISPR/Cas9系统，包括sgRNA和Cas9蛋白。
2. 将sgRNA和Cas9蛋白导入小鼠ES细胞，进行基因编辑。
3. 对编辑后的ES细胞进行筛选，获得基因敲除的细胞系。
4. 将基因敲除的细胞系注射到C57BL/6小鼠的受精卵中，获得基因敲除的小鼠。
（2）小鼠行为和认知功能测试1. 观察基因敲除小鼠的生长发育、行为和运动能力。
2. 对小鼠进行认知功能测试，包括Morris水迷宫实验、Y迷宫实验等。
（3）基因表达分析1. 提取小鼠大脑样本，进行RNA提取和cDNA合成。
2. 利用PCR、RT-qPCR等方法检测敲除基因的表达水平。
3. 对小鼠大脑样本进行蛋白质组学分析，检测相关蛋白的表达水平。
四、实验结果1. 基因敲除成功敲除了小鼠大脑中特定基因，并通过PCR、RT-qPCR等方法验证了基因敲除的效果。
2. 小鼠行为和认知功能与野生型小鼠相比，基因敲除小鼠在Morris水迷宫实验中表现出明显的空间学习障碍，提示该基因可能参与小鼠的认知功能。
3. 基因表达分析敲除基因后，小鼠大脑中相关通路和基因表达发生了显著变化。
具体表现为：1. 神经递质合成酶的表达水平降低。
NSG小鼠详细介绍
NSG小鼠详细介绍简称： NSG Rag2-/- IL2rg-/-品系名称：NOD/scid 小鼠基因型：纯合子模型简介：NSG 小鼠是利用 CRISPR/Cas9 系统直接在 NOD/scid 鼠上进行Rag2 和 IL2rg 双基因敲除的小鼠，理论上没有任何背景残留，背景更纯。
与 NOD/scid 小鼠相比，NSG 小鼠的人体细胞和组织移植存活率显着提高，同时能够植入更高比例的正常或癌变人类细胞和组织。
另外，NSG 小鼠还能满足作为人类免疫系统模型的需求，植入人类造血干细胞后，NSG 小鼠的外周淋巴组织可以产生人类 T 细胞。
研究应用：可以作为人类细胞和器官的移植模型，肿瘤移植模型，便于医学研究，新药研发及毒理实验。
模型特点：在 Rag2 基因的第 3 号外显子上敲除 101 个碱基在 IL2rg 基因的第 1 号外显子上敲除 5 个碱基致病机理：IL2rg 基因编码白介素 2 受体γ蛋白，其他若干白介素受体不能共享此γ链，而T 细胞的早期发育要求若干白介素受体，因此会严重影响 T 淋巴细胞的生成。
Rag2 基因的缺失，使得淋巴细胞发育受阻。
因此当两个基因同时突变，即 Rag2-/- IL2rg-/-时，机体内B 淋巴细胞、T 淋巴细胞及 NK 细胞等缺失，免疫功能障碍。
BALB/c 小鼠和C57BL/6是两个小鼠品系；NSG是在NOD-SCID小鼠(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)基础上利用对Il2rg基因进行敲除，获得严重免疫缺陷小鼠，缺失成熟T、B、NK细胞，是人源化小鼠、异种移植、免疫重建的重要载体；对于研究人类造血干细胞、肿瘤发生与治疗、免疫缺陷疾病与体内免疫机制研究都具有重要意义；NOD，no obesity diabetes即非肥胖糖尿病小鼠。
巨噬细胞条件敲除小鼠
巨噬细胞条件敲除小鼠巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，具有重要的抗菌，抗病毒和免疫调节的作用。
巨噬细胞在机体内发挥着重要的生物学功能，扮演着“清道夫”的角色，负责捕捉、吞噬、消化和呈递细胞外抗原，刺激T 细胞和B细胞的免疫应答，参与免疫途径的激活和维持。
条件敲除是目前常用的基因功能研究方法之一，它是利用CRISPR 基因编辑技术，通过改造目标基因来探究基因功能的重要性。
巨噬细胞条件敲除小鼠是利用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠体内巨噬细胞表达的目标基因，从而研究其对生物学过程的影响。
条件敲除技术是一种基因修饰技术，可以使一些特定的基因在特定的组织器官或细胞类型中被靶向调控，从而产生目标基因的失活和表达减弱，使得研究人员可以更好地了解这些基因在特定细胞类型中的作用。
巨噬细胞条件敲除小鼠，就是利用条件敲除技术来靶向敲除小鼠体内巨噬细胞表达的目标基因，从而研究巨噬细胞在机体内的功能。
通过巨噬细胞条件敲除小鼠的研究，可以更加深入地了解巨噬细胞在维持免疫调节和抗菌、抗病毒中的作用机理。
例如，对脾脏中巨噬细胞条件敲除肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）的小鼠进行研究发现，与正常小鼠相比，敲除小鼠脾脏中的巨噬细胞数量明显降低，免疫应答意愿减弱，对大肠杆菌、沙门氏菌等细菌感染的清除能力也显著下降，说明TNFR1在免疫细胞抗菌和免疫调节中扮演着重要的作用。
除此之外，巨噬细胞条件敲除小鼠还可以用于研究巨噬细胞对肿瘤发展的影响。
例如，针对Tie2-Cre介导的STAT3条件敲除小鼠进行研究，发现敲除小鼠中的肿瘤细胞比正常小鼠中的肿瘤细胞更容易被巨噬细胞吞噬和消化，暗示了STAT3在肿瘤和巨噬细胞的相互作用中的重要性。
总之，巨噬细胞条件敲除小鼠是一种重要的实验动物模型，它可以为解决免疫学和肿瘤学等领域的一些重要问题提供有力的研究工具。
有了它的存在，我们可以更好地了解巨噬细胞在机体内的生物学功能，并可针对巨噬细胞在抗菌、抗病毒和免疫调节中的作用机理，寻找新的免疫干预方法和肿瘤治疗策略。
《2024年利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言基因编辑技术为现代生物学研究带来了巨大的突破。
在众多基因编辑技术中，CRISPR-Cas9系统以其高精度、高效率的特性备受关注。
本篇论文旨在探讨利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的过程、结果以及相关讨论。
二、材料与方法1. 材料小鼠胚胎干细胞系、DUSP9基因序列信息、CRISPR-Cas9系统相关试剂等。
2. 方法（1）设计并合成针对DUSP9基因的CRISPR-Cas9系统指导RNA（gRNA）。
（2）将gRNA与Cas9蛋白共同转入小鼠胚胎干细胞中。
（3）通过PCR、Western Blot等方法检测DUSP9基因的敲除情况。
（4）对敲除后的胚胎干细胞进行扩增、培养，并分析其生物学特性。
三、实验结果1. DUSP9基因敲除效率分析通过PCR和Western Blot等方法，我们成功检测到DUSP9基因的敲除情况。
在转导了CRISPR-Cas9系统的胚胎干细胞中，DUSP9基因的敲除效率达到了XX%。
2. 胚胎干细胞的生物学特性分析通过对敲除后的胚胎干细胞进行扩增、培养，我们发现其增殖能力、分化能力等生物学特性均与野生型胚胎干细胞无显著差异。
3. 基因敲除小鼠模型的构建与验证将敲除DUSP9基因的胚胎干细胞注射到小鼠囊胚中，成功构建了DUSP9基因敲除小鼠模型。
通过对小鼠进行基因检测，验证了DUSP9基因的敲除情况。
四、讨论本实验利用CRISPR-Cas9系统成功构建了DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，为进一步研究DUSP9基因的功能及其在相关疾病中的作用提供了有力工具。
同时，本实验也证明了CRISPR-Cas9系统在基因编辑领域的广泛应用和可靠性。
在实验过程中，我们注意到以下几点：首先，gRNA的设计与合成是影响基因敲除效率的关键因素之一，需要针对目标基因的序列信息进行精确设计。
CRISPRCas9基因敲除小鼠模型
CRISPRCas9基因敲除小鼠模型
根据基因序列设计合成sgRNA，针对Knockin插入点或点突变位置构建含Knockin片段或点突变的同源序列，与Cas9 mRNA共同注射到小鼠受精卵胞质，Cas9核酸酶、sgRNA、基因组靶序列结合并切割双链DNA，以含Knockin的同源序列为模版修复基因组DNA，最终获得在目的DNA序列插入Knockin片段或点突变的Knockin小鼠。
根据基因序列设计合成两个sgRNA，分别针对两个Loxp的插入点，构建含Loxp的同源序列，与Cas9 mRNA共同注射到小鼠受精卵胞质，Cas9核糖酶、sgRNA、基因组靶序列结合并切割双链DNA，以含Loxp同源序列为模板修复基因组DNA，最终获得在待敲除目的DNA序列两端各有一个Loxp序列的Flox小鼠。
基于CRISPRCas9构建小鼠UOX基因敲除模型
中外医疗China &Foreign Medical Treatment高尿酸血症(hyperuricemia)是由嘌呤代谢紊乱,尿酸排泄障碍引起的血尿酸异常为临床表现的异质性疾病。
尿酸病理性升高有5%~12%的风险导致尿酸结晶累积并损伤关节[1],引起痛风、急性及慢性关节炎等。
并且,高尿酸血症易引发并发症,如高血压、高血脂、2型糖尿病、冠心病。
临床上常规的高尿酸血症及痛风治疗手段为口服降尿酸药物[2],目前尚未有根治痛风的药物,新型降尿酸药物开发需要利用高尿酸动物模型进行降尿酸药物药效及药理筛选。
故建立稳定性好,更接近患者发病特征的高尿酸动物模型,能提高新型降尿酸药物开发效率及成药性,优化痛风治疗格局。
近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术凭借其简便性、特异性和高效性,在疾病动物模型构建领域应用日趋广泛和深入。
该研究利用CRISPR/Cas9,敲除小鼠基因组内尿酸氧化DOI:10.16662/ki.1674-0742.2020.07.032基于CRISPR/Cas9构建小鼠UOX 基因敲除模型张茹君1,夏海林1,朱赟2,黄晶3,孟雨菡21.常州卡文斯实验动物有限公司,江苏常州213104;2.江苏科标医学检测有限公司,江苏常州213161;3.百格基因科技(江苏)有限公司,江苏常州213000[摘要]目的通过CRISPR/Cas9获得UOX 基因敲除的小鼠纯合品系,为建立高尿酸血小鼠动物模型奠定基础。
方法根据小鼠UOX 基因第三外显子前后两个位点设计双sgRNA,通过PCR、体外转录和纯化获得sgRNA 和Cas9mRNA。
将sgRNA 和Cas9mRNA 显微注射进小鼠原核胚后,体外培养至二细胞胚阶段,进行胚胎移植至代孕母鼠。
F0代小鼠出生后,提取其DNA 进行电泳分析和测序分析。
F0代交配繁殖至F2代获得UOX 缺失的小鼠纯合品系。
结果显微注射sgRNA 和Cas mRNA 至原核胚,成功获得50枚囊胚。
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B-Cas9敲进小鼠——一个神奇的基因敲除小鼠制备工具CRISPR/Cas9技术自问世以来就受到了科学家们的青睐。
随着基因敲除技术不断更新完善，最近诞生了一种可以快速、高效制备基因敲除小鼠的工具模型--B-Cas9敲进小鼠。
B-Cas9敲进小鼠自身携带Cas9蛋白，只需注射sgRNA就可以对基因进行编辑。
那么，我们为什么需要B-Cas9敲进小鼠？它有哪些优势、应用领域如何呢？B-Cas9敲进小鼠又是如何制备的呢？
1）B-Cas9敲除小鼠的优势
不仅可以缩短敲除小鼠的制备周期，还可以提高敲除效率。
在携带有Cas9蛋白的小鼠体内注射sgRNA病毒，便可即时获得敲除小鼠；若在小鼠体内注射多个sgRNA病毒，就可以实现多基因同时敲除。
2）B-Cas9敲除小鼠的应用
不仅可以快速制备组织特异性基因敲除小鼠模型；其多基因变异更接近于肿瘤的异质性，还可以制备多基因敲除的癌症模型；除此之外, B-Cas9敲进小鼠还可以结合sgRNA文库进行高通量筛选。
3）B-Cas9敲除小鼠的制备原理
将表达Cas9蛋白的序列插入到Rosa26位点当中，并在Cas9前面添加TetO元件，以达到控制Cas9表达，实现可诱导型、组织特异性表达的效果。
B-Cas9敲进小鼠只有在注射了Dox后，Dox与Teto复合体结合才能诱导Cas9蛋白的表达。
（打靶策略如下图）
4）B-Cas9敲进小鼠与国外引进的Cas9敲进小鼠作比较，我们不难发现，B-Cas9敲进小鼠更加有优势。
时间上省去了运输和隔离的3-4个月，费用也减少一半多。
从遗传背景和技术改造来看，B-Cas9敲进小鼠的遗传背景是纯净的C57BL/6背景，而国外引进的Cas9敲进小鼠是129背景上回交的。
B-Cas9敲进小鼠最大的优势在于其可诱导、可逆性表达Cas9,让实验更加方便,易于操控。