葡萄糖氧化酶传感器中酶的固定与电子转移研究进展

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．综述．ｄｏｉ：１０．３９６９６．ｉｓｓｎ．１００９－７０９０．２００９．０７．０２５葡萄糖氧化酶传感器中酶的固定与

电子转移研究进展

潘晓东１．刘枫２

摘要：回顾了葡萄糖氧化酶（ＧＯＤ）传感器研究的新进展。介绍了ＧＯＤ的固定（包括物理吸附、化学偶联、使用载体等方法的研究进展）、电子的转移（使用碳纳米管、纳米颗粒等方法的研究进展），并对ＧＯＤ传感器的发展前景进行了预测。

关键词：葡萄糖氧化酶；酶传感器；酶的固定；电子的转移；碳纳米颗粒；碳纳米管

中图分类号：Ｑ８１４．２；Ｒ３１８文献标识码：Ａ文章编号：１００９—７０９０（２００９）０４—０３６６—０４

ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎｅｎｚｙｍｅｆｉｘｉｎｇａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｇｌｕｃｏｓｅｏｘｉｄａｓｅｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓＰＡＮＸｉａｏ－ｄｏｎｇ１，ＬＩＵＦｅｎ９２（Ｊ．Ｔｈｅｌｌ７ｔｈＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰＬＡ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００１３，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ；２．ＴｈｅＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００１３，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

中国糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ．ＤＭ）的患病率为３．２１％。连续血糖测量对ＤＭ患者的治疗非常重要．可以有效控制胰岛素的用量和提前预报低血糖的发生．而在连续血糖测量系统中酶传感器是至关重要的。也是目前尚未解决的难题．现有的酶传感器的研究成果，还没有能应用到临床Ｉ－１。其中。葡萄糖氧化酶（ｇｌｕｃｏｓｅｏｘｉｄａｓｅ，ＧＯＤ）法测定血糖浓度的准确度、精密度已被公认是较好的．以这种方法为原理制成的血糖仪用血量少．检测速度快。尤其是ＤＭ患者可随身携带、自我检测血糖浓度．是我国卫生部推荐的血糖测定的常规方法。目前国内外相关报道中．基于ＧＯＤ测定葡萄糖浓度的方式主要有以下２种．光电式血糖测试法：将血样标本滴在含有ＧＯＤ试剂的试纸条上．用仪器测量试纸条的反射光．来计算血样中的血糖含量。另一种则是基于电极修饰的ＧＯＤ传感器。将ＧＯＤ及载体固定到电极上制成ＧＯＤ传感器．技术难点是如何较好同定生物活性物质，减少流失和失活１２ｌ。同时要具有较高的选择性．排除试样中其他物质对测定的干扰。它的ＧＯＤ传感器反应方程式如下：

①基质反应

Ｇｌｕｃｏｓｅ＋ＧＯＤ（ＦＡＤｌ—｝ＧｌｕｅｏｎｉｃＡｃｉｄ＋ＧＯＤ（ＦＡＤＨ２）

作者单位：１．解放军第１１７医院．浙汀杭州３１００１３：２．浙江大学生物医学工程与仪器科学学院，浙汀杭州３１００１３

收稿日期：２００８—０５—１３；修回日期：２００８—０８一１８

作者简介：潘晓东（１９７８一）。男，浙江杭州市人。本科，工程师，主要从事医学传感器的研究设计．

审校者：常津（天津大学材料学院纳米生物技术研究所．天津３０００７２）

②酶之氧化还原中心被氧再氧化

ＧＯＤ（ＦＡＤＨ２）＋Ｍｅｄｉａｔｏｒ（ｏｘ）－－－｝ＧＯＤ（ＦＡＤ）＋Ｍｅ－ｄｉａｔｏｒ（ｒｅｄ）

③适当的环境下

Ｍｅｄｉａｔｏｒ（ｒｅｄ）＿Ｍｅｄｉａｔｏｒ（ｏｘ）＋２ｅ一

酶是ＧＯＤ传感器的核心部分．然而它们一般都溶于水。其本身也不稳定．需要固定在各种载体上，才可延长生物活性物质的活性。固定化技术的运用很大程度上决定着传感器的性能，包括选择性、灵敏度、稳定性、检测范围与使朋寿命等。随着研究的不断深入，ＧＯＤ传感器的研究取得了很大的进步．主要表现在提高同定氧化酶活力的技术、电子的转移和各种高新技术在酶传感器中的应用等方面１２ｌ。下面拟对这些方面的新进展进行综述。

１葡萄糖氧化酶的固定

经典的同定化ＧＯＤ方法主要有物理吸附、化学偶联、交联、凝胶包埋和微胶囊法等。ＧＯＤ在固定化过程中活力降低的因素主要有：①固定过程中的化学损伤；②ＧＯＤ分子不适合的空间取向使得与底物发生邻近定向效应受阻．催化作用减弱［２１。因此，ＧＯＤ或蛋白质分子空间沉积的方向控制是制备高质量固定化ＧＯＤ、ＧＯＤ标试剂和生物器件的前提。同定化ＧＯＤ空间取向方法主要有共价键法、氨基酸置换法、抗体偶联法、生物素一亲和素亲和法和疏水定向固定法等１３１。１．１物理吸附

物理吸附是被吸附的流体分子与同体表面分子

万方数据

间的作用力为分子间吸引力．即所谓的范德华力（ＶａｎｄｅｒＷａａｌｓ）。因此，物理吸附又称范德华吸附，它是一种可逆过程。当固体表面分子与气体或液体分子间的引力大于气体或液体内部分子间的引力时．气体或液体的分子就被吸附在固体表面上．纳米颗粒因具有特殊的表面积和较高的表面能．在吸附ＧＯＤ的过程中起重要作用．同时也说明了ＧＯＤ不仅可以紧紧地吸附在纳米金颗粒上．而且还保持了其ＧＯＤ活性和电化学性质【４】。

钟霞等［５１采用自组装技术．首先在电极表面电沉积一层普鲁士蓝（Ｐｒｕｓｓｉａｎｂｌｕｅ．ＰＢ），然后在ＰＢ膜上电聚合一层邻苯二胺。通过邻苯二胺上的一Ｎ和纳米离子之间的静电作用吸附纳米金颗粒．最后于纳米金颗粒上固定ＧＯＤ。ＰＢ对于Ｈ：Ｏ，的电还原具有高的灵敏度和高的选择性：纳米粒子具有很好的生物兼容性使得ＧＯＤ不仅可以紧紧吸附在纳米金颗粒上．而且还能保持ＧＯＤ的活性和电化学性质．从而获得了具有高灵敏度和选择性的新型ＧＯＤ传感器．

岳波等同研究表明纳米颗粒表面积大、表面自由能高．亲水纳米金颗粒的加入能吸附更多的ＧＯＤ分子，增大响应电流、降低工作电压。

１．２偶联

偶联反应是由两个有机化学单位（ｍｏｉｅｔｙ）进行某种化学反应而得到一个有机分子的过程。偶联法同定ＧＯＤ具有寿命长、可反复利用、催化效率高等优点．可提高ＧＯＤ传感器的性能。如锁爱莉等同利用溶胶、凝胶技术，以甲基三甲氧基硅和＾ｖ一氨丙基三甲氧基硅烷为原料．利用溶胶凝胶技术制成了一种疏水亲水型硅胶。以ｌ一乙基一３一（３一二甲基氨丙基）一碳二亚胺一盐酸和Ｎ一羟基琥珀酰亚胺为催化剂．利用ＧＯＤ分子中的羧基基团与硅胶中氨基基团间的碳二亚胺偶联反应．实现了ＧＯＤ在硅胶上的固定化。结果发现固定化ＧＯＤ活力最优时的条件如下：＾ｙ一氨丙基三甲氧基硅烷的体积分数为７０％、给酶量为１６８００Ｕ、最适温度和最适ｐＨ分别为３５℃和５．５，固定化ＧＯＤ具有很好的操作稳定性和贮存稳定性．其米氏常数Ｋｍ为９．１ｍｍｏｌ／Ｌ。

１．３使用载体

二茂铁即二环戊二烯基铁（Ｃ，Ｈ广Ｆｅ＿Ｃ５Ｈ，），化学性质稳定，二茂铁可在较低的工作电压（０．３Ｖ）下。直接将电子从ＧＯＤ反应中心传递到电子表面。目前研究的重点是防止二茂铁等电子媒介体的流失．从而提高ＧＯＤ传感器的稳定性和使用寿命。提高ＧＯＤ传感器稳定性的主要方法是利用环糊精作为载体．形成主客体结构。如朱邦尚等［ｓｌ以电子媒介体１．１一二甲基二茂铁为客体与Ｂ—ＣＤＰ形成稳定的主客体包络物。用牛血清白蛋白一戊二醛交联法．把ＧＯＤ和主客体包络物固定到电极上。成功地制成了ＧＯＤ传感器。该传感器具有稳定性高、选择性好和较长的使用寿命等优点，线性响应范同为浓度０．Ｏｌ～１８．００ｍｍ０１／Ｌ。传感器所使用的介质对传感器性能也有重要影响。如高孟姣等嗍在研究Ｂ一环糊精与二茂铁主客体ＧＯＤ传感器在正丙醇、乙醇、乙腈３种有机溶液中的循环伏安特性时发现，该传感器在有机溶剂中的响应电流较缓冲液中增加．但具体原因还不清楚。提高传感器稳定性的另一种方法是在电极表面覆盖一层Ｎａｔｉｏｎ膜（Ｎａｔｉｏｎ膜是一种Ｃ—Ｆ聚合膜．具有磺酸钠结构，以Ｒ—Ｓ０３－Ｎａ＋表示１１０１）。如贾能勤等…Ｊ以基于丝网印刷技术制作的碳糊电极为基底电极。用二茂铁为电子媒介体．Ｎａｆｉｏｎ修饰厚膜碳糊电极制成了ＧＯＤ传感器。Ｎａｆｉｏｎ膜既可以防止二茂铁的流失。又可以防止抗坏血酸、尿酸的干扰，具有防污能力。该传感器的检测上限可达浓度１８．００ｍｍｏｌ／Ｌ。响应时间小于６０ｓ。二茂铁及其衍生物对抗坏血酸具有催化作用．易受抗坏血酸的十扰。而Ｎ一甲基吩嗪则可以消除抗坏血酸等的干扰。李海虹等【１２１通过交联方式将辣根过氧化物酶（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ．ＨＲＰ）固定在Ｅａｓｔｍａｎ—ＡＱ＿Ｎ一甲基吩嗪修饰电极上，制成Ｈ２０２酶传感器。将它与ＧＯＤ和半乳糖苷酶结合，制成双酶和三酶体系的酶传感器。用于葡萄糖和乳糖的测定。对ＤＭ患者的血糖测定结果与采用ＧＯＤ和ＨＲＰ的分光光度法的结果一致。

聚合物材料是同定化技术的主体材料．目前在固定化技术中应用最多。寇文朋等【１３】在聚乙烯醇长链骨架上接枝４一乙烯基吡啶和丙烯酰胺合成得到三元接枝物。采用这种三元接枝物凝胶固定ＧＯＤ制成了ＧＯＤ传感器。其响应时间为７～１０ｓ。当操作电位为０．６５Ｖ（以饱和甘汞电极为参比电极），底物葡萄糖的浓度为ｌｍｍｏｌ／Ｌ时．电流密度可达４８０ｎＡ／ｍｍ２；其线性范围为浓度５×１０－ｓ～５×１０－３ｍｏｌ／Ｌ．使用２个月后响应电流强度仍在８５％左右。

２电子的转移

化学修正后的ＧＯＤ与氧化还原反应电传导组合体或者将ＧＯＤ固定在氧化还原催化剂中都用来作为电子在电极和氧化还原反应中心之间传导的途径。可是电子在电极与ＧＯＤ之间的转移效率很低，甚至比自然存在的电子受体（比如Ｏ：）还要低，这是由于电子传播单元并没有处于最佳的空间位置及生物电催

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