坐骨神经损伤(SNI)大鼠模型具体方法及步骤

坐骨神经损伤(SNI)大鼠模型具体方法及步骤原型物种人

来源夹闭坐骨神经干导致坐骨神经损伤

模式动物品系SPF 级SD大鼠，雄性，8 周

实验分组随机分组：对照组，模型组，阳性药物组，受试药物组(三个剂量梯度组)，15只每组

实验周期4 weeks

建模方法建模方法：对雄性大鼠行腹腔注射麻醉。将大鼠俯卧位固定于鼠固定架上，铺孔巾，暴露鼠左下肢并剪掉鼠毛。碘酒、酒精消毒三遍，于左侧股后正中行纵行、长约6-8mm切口，暴露皮下肌肉。用止血钳钝性分离股二头肌、半腱肌、半膜肌后，分离出白色、粗大的坐骨神经，刺激后左足出现抽动。距坐骨结节6-8mm处（定位）；用大止血钳夹闭坐骨神经干，压满3扣；挤压5秒钟后松开止血钳，间隔10秒后再夹闭5秒钟，再放松10秒，第三次再夹闭5秒（定时）。神经干挤压伤宽度约3mm。9-0无创缝线标记后，将坐骨神经送回原位，整理肌肉，缝合创口；假手术组大鼠麻醉后，仅切开皮肤暴露左侧坐骨神经但不做钳夹，在相应部位相同方法标记后缝合。

后期取材：将取出的动物饲养一周，结束后，注射水合氯醛麻醉大鼠，将鼠仰卧位固定于大鼠固定架上。自颌下至小腹行胸、复联合切口，切断肋骨，剪断膈肌，暴露出跳动的心脏。用16号针头由左心尖刺入左心室，用软静脉留置导管沿左心室经主动脉瓣插入主动脉，剪开右心耳。先用0.9%生理盐水

250ml快速冲洗组织内血液，其后用4%多聚甲醛固定液快速推注100ml，再

缓慢推注100ml，直至使鼠尾巴翘起，身体逐渐僵硬，颜色变白为止。灌注后，立即将身体一僵硬的鼠于俯卧位固定于手术台上，由胸-骶部沿脊柱正中切开，暴露及分离背部肌肉，沿十二肋肌部切断T12 L1水平脊柱、脊髓。沿坐骨神经走行切腰4、腰5、骶1段脊髓和包括挤压伤在内的上下各2mm的坐骨神经。同法切取假手术组的相应部位等长标本。分三种方法进行处理及固定。(1) 4%多聚甲醛固定液中固定，制备石蜡切片。(2) 2.5%戊二醛液固定后，备做电镜。(3)液氮中冷冻，备做冰冻切片。

应用疾病模型

1、大鼠坐骨组织病理检查坐骨神经组织在4%多聚甲醛中固定24 小时后，包埋成石蜡块。石蜡块放在-20℃冰箱中冰一下，在切片机上进行切片，切片厚度4um，置于水槽中展开、捞片和贴片。石蜡切片切好后需要烤片，60℃烤片2 小时。进行Loyez苏木精染色，光镜下观察再生髓鞘的情况。

2、TUNEL检测坐骨神经组织凋亡情况

坐骨神经组织切片脱蜡，蛋白酶K室温下消化，TDT酶反应液37℃孵育1 h，0.3%H2O2抑制内源性过氧化物酶，Streptavidin-HRP 室温5min，DAB 显色，苏木精复染。阴性对照采用无酶标记液（去除TDT）代替TDT酶反应液。凋亡细胞核呈棕褐色颗粒，光镜下观察并计数凋亡细胞。

3、电镜观察自噬情况

坐骨神经组织2.5%戊二醛液固定，制备电镜样品，利用电镜在超微结构水平观察坐骨神经组织中自噬情况。