蒽酮法测定可溶性糖方法[仅供参考]
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蒽酮法测定可溶性糖方法
(一) 实验原理
糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物,在一定范围内,颜色的深浅与糖的含量成正比,故可用于糖的定量。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区吸收峰为630 nm,故在此波长下进行比色。
(二)材料、仪器设备及设计
1 材料
12种源砂生槐叶片,2种处理,4个重复,共96个样。
2 仪器设备
分光光度计,恒温水浴锅,20 ml刻度试管,5 ml和1 ml刻度吸管,5 ml和1 ml的移液枪,记号笔,吸水纸适量。
3 试剂
(1)蒽酮乙酸乙酯试剂:取分析纯蒽酮1 g,溶于50 ml乙酸乙酯中,贮于棕色瓶中,在黑暗中可保存数周,如有结晶析出,可微热溶解。
(2)100 ug/L蔗糖溶液:
1%蔗糖标准液:精确称取蔗糖1.000 g,加入少量水溶解,移入100 ml容量瓶,加0.5 ml 浓硫酸,定容至刻度线。
100 ug/L蔗糖溶液的配制:用移液枪精确吸取1%蔗糖标准液1 ml,加入到100 ml容量瓶,加蒸馏水定容。
(3)浓硫酸(比重1.84)
(三)实验步骤
1.标准曲线的制作:
按表1加入标准的蔗糖溶液,然后按顺序向试管中加入0.5 ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5 ml 浓硫酸,充分振荡,立即将试管放入沸水浴中,逐管准确保温1 min取出后自然冷却至室温,以空白作参比,在630 nm波长下测其光密度,以光密度为纵坐标,以糖含量为横坐标,绘制标准曲线,并求出标准线性方程。
管号
试剂
0 1,2 3,4 5,6 7,8 9,10
100µg.1-1蔗糖
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
/ml
水/ml 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 蔗糖量/µg 0 20 40 60 80 100
2.取样
取不同种源砂生槐幼苗,用蒸馏水冲洗干净,随后用吸水纸吸干水分。将叶片切下,用锡箔纸包住,放入液氮中冷冻。取完后将样品放入-80℃冰箱中保存。 3.可溶性糖的提取
将样品从冰箱中取出,称取0.20-0.30 g ,记录重量,使用镊子将样品夹入刻度试管中,加入10 mL 蒸馏水,塑料薄膜封口,于沸水中提取30 min (提取2次),提取液过滤入25 ml 容量瓶中,反复冲洗试管及残渣,定容至刻度。 4.显色测定
吸取样品提取液0.5 ml 于20 ml 刻度试管中(重复2次),加蒸馏水1.5 ml ,然后加入0.5 ml 蒽酮乙酸乙酯试剂和5 ml 浓硫酸,充分振荡,立即将试管放入沸水浴中,逐管准确保温1 min 取出后自然冷却至室温,以空白作参比(切勿忘掉对照)。在630 nm 波长下测其光密度,测定样品的光密度。
5.计算可溶性糖的含量,计算公式:
C × V 总 × D
样品含糖量(%)= ───────────── × 100% W × V 测 × 106
其中:C ——在标准曲线上查出的糖含量(µg ), V 总——提取液总体积(ml ), V 测——测定时取用体积(ml ), D ——稀释倍数,
W ——样品重量(g ),
106——样品重量单位由g 换算成µg 的倍数
数据统计表
海拔
处理 编号 吸光度 标准曲线斜率 标准方程求得糖含量C (ug ) 提取液量V (ml ) 吸取样品液体积a (ml ) 稀释倍数 组织重量(W ) 计算所得可
溶性糖含量
平均值
2900
CK
1 1 1
1 1 2
y = 0.0084x - 0.0026
R² = 0.9858
-0.2
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 20
40
60
80
100 120
吸光度
糖含量
标准曲线
1 1 3 1 1 4
PEG 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 2 4
3000 CK
2 1 1
2 1 2
2 1 3
2 1 4 PEG
2 2 1
2 2 2
2 2 3
2 2 4
3100 CK
3 1 1
3 1 2
3 1 3
3 1
4 PEG
3 2 1
3 2 2
3 2 3
3 2 4
3258 CK
4 1 1
4 1 2
4 1 3
4 1 4 PEG
4 2 1
4 2 2
4 2 3
4 2 4
3600 CK
5 1 1
5 1 2
5 1 3
5 1 4 PEG
5 2 1
5 2 2
5 2 3
5 2 4
3600 --1 CK
6 1 1
6 1 2
6 1 3
6 1 4 PEG
6 2 1
6 2 2
6 2 3
6 2 4
3700 CK
7 1 1
7 1 2
7 1 3
7 1 4 PEG
7 2 1
7 2 2
7 2 3
7 2 4
3800 CK
8 1 1
8 1 2
8 1 3
8 1 4 PEG
8 2 1
8 2 2
8 2 3
8 2 4
3900 CK
9 1 1
9 1 2
9 1 3
9 1 4 PEG
9 2 1
9 2 2
9 2 3
9 2 4
4000 CK
10 1 1
10 1 2
10 1 3
10 1 4 PEG
10 2 1
10 2 2