细胞融合

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科目细胞生物学实验题目动物细胞融合

【实验目的】

1、了解动物细胞融合的常用方法。

2、学习化学融合和电融合的基本操作过程。

3、观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。

【实验原理】

细胞融合，是指在自发或人工诱导下，两个或两个以上细胞或原生质体合并为双核或者多核细胞的过程。基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（如病毒诱导融合法）、化学方法（如聚乙二醇PEG诱导融合法）、物理方法（如电场诱导融合法）。

1、病毒诱导融合

仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。

2、化学诱导融合

很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG

是广泛使用的化学融合剂。

3、电激诱导融合

包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。

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本次试验利用PEG诱导细胞融合，聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。

【实验材料和用品】

1、材料

鸡血红细胞

2、试剂

0.85％生理盐水、50%PEG、Alsver’s液、GKN液

3、器材

离心管、滴管、离心机、光学显微镜、载玻片、盖玻片

【实验步骤】

1、鸡血细胞的制备与保存，取2mL鸡血+2mL Alsver’s液，再加6mL Alsver’s液，混匀后制成悬液。（在4℃下保存，本实验老师完成此步骤）。

2、取步骤1悬液1 mL +4 mL 0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理：

①：1200r/min离心5分钟。（去上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5 mL）

②：1000~1200r/min离心5分钟。（去上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5 mL）

③：1000~1200r/min离心7分钟。

3、将步骤2最后一次的沉降血球（去上清液后，约0.1~0.2mL），加入GKN液至1~2mL，制成10%的细胞悬液。

4、取上述10%的细胞悬液1mL，加入3mLGKN液。

5、实验①：取步骤4中悬液1.0mL+0.5mL 50%PEG液

实验②：取步骤4中悬液0.5mL+0.5mL 50%PEG液

实验③：取步骤4中悬液0.5mL+1.0mL 50%PEG液

混匀制片，常温下静止2-3分钟，在显微镜下观察。

【实验结果】

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在显微镜中能观察到未融合的细胞、接触融合的细胞（包括刚接触融合状、典型哑铃状、椭圆状等）等情况，具体形态如下图：

未融合的细胞（10

×40）接触融合的细胞（10

×40）

接触融合的细胞（10×40）接触融合的细胞（10×40）

【讨论与结论】

PEG法细胞融合的影响因素：

1. PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。

2. PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。

3. PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。

4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正

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比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细, 一般采用的温度为38~40℃。

5. 注意区分融合细胞与重叠细胞（若为融合细胞，那么无论怎么转动细焦旋钮，细胞膜皆是不完整的；否则反之），此次试验观察到较多细胞聚集成团，可能是细胞悬液浓度略大或滴的量不合适所致。

本实验所用材料为鸡的血细胞的原因：

1.鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；

2.实验材料便宜、易得。细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。

本实验注意项：

2、实验中由于为低速离心，故弃去上清时不宜直接倒掉，可使用滴管、移液管、移液器等吸取，否则血细胞容易弥散。

3、操作步骤（4）时应注意先加入细胞悬液，再加GKN液，使GKN液穿过细胞悬液。

4、离心时注意严格配平，不平时用水补平。

【思考题】

细胞融合的应用

（一）动物细胞

1、用于生产单克隆抗体

只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能像骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。

2、用于基因定位和绘制人类基因图谱

杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。

3、用于动物育种

体细胞核移植技术是将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术。动物体细胞融合后，杂种细胞难以发育再生为一个个体。但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细