基因工程原理讲义：目的基因的克隆
《基因工程的原理》 讲义
《基因工程的原理》讲义基因工程，这个听起来颇具科幻色彩的词汇，其实已经在我们的生活中扮演着越来越重要的角色。
从医疗领域的疾病治疗，到农业领域的作物改良，基因工程的应用无处不在。
那么，究竟什么是基因工程？它的原理又是什么呢？要理解基因工程，首先得知道基因是什么。
简单来说，基因是具有遗传效应的 DNA 片段，它就像是生命的密码，决定了生物的各种性状和特征。
基因工程的核心原理之一是基因重组。
这就好比是在一个巨大的基因库中，挑选出我们需要的基因片段，然后把它们重新组合在一起。
想象一下，我们有两个不同的生物体，一个具有某种优良性状，比如抗病虫害的能力；另一个具有其他我们想要的性状，比如高产。
通过基因工程的手段，我们可以把控制这两种性状的基因提取出来，然后整合到同一个生物体的基因组中，让它同时拥有这两种优良性状。
实现基因重组的第一步是获取目的基因。
这可不是一件容易的事情，科学家们需要运用各种技术和方法。
有时候，他们会直接从生物体的细胞中提取出含有目的基因的 DNA 片段。
但更多的时候，由于目的基因在整个基因组中所占的比例很小，直接提取就像大海捞针，所以需要先通过 PCR 技术（聚合酶链式反应）对目的基因进行大量扩增，使其数量达到可以操作的程度。
有了目的基因，接下来就要找一个“运输工具”把它送到受体细胞中去，这个“运输工具”就是载体。
常见的载体有质粒、噬菌体和病毒等。
这些载体就像是一辆辆小货车，它们能够携带目的基因进入受体细胞。
为了让目的基因能够顺利地装载到载体上，科学家们会使用限制酶对目的基因和载体进行切割，使它们产生相同的粘性末端，然后再通过DNA 连接酶将它们连接起来，形成重组 DNA 分子。
当重组 DNA 分子构建完成后，就可以将其导入受体细胞了。
导入的方法有很多种，比如对于植物细胞，可以使用农杆菌转化法、基因枪法等；对于动物细胞，可以使用显微注射法；对于微生物细胞，则可以用感受态细胞法。
受体细胞接受了重组 DNA 分子后，会将其整合到自己的基因组中，从而实现基因的表达。
第三章 基因克隆的载体
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
外源基因Pst I Tet中存活 但在Amp中死亡
② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③ 高拷贝数
2. 质粒载体相关知识介绍
（4）pBluescript SK
pBluescript SK is similar to the pGEM vectors except that it also carries an origin of replication for a filamentous phage, f1. f1 uses a single stranded DNA molecule as a genome and pBluescript KS
表达型质粒载体
装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯 化的元件，主要用来使外源基因表达出 蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆 的真核生物的基因臵于大肠杆菌的转 录—翻译信号控制之下。
① 表达载体的结构
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS
1.质粒的生物学特性
（4）质粒的复制类型 一种质粒在宿主细胞中存
在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为 两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid）, 拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）, 拷贝数为10-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在 不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。
基因工程操作技术及原理之基因克隆
基因工程操作技术及原理之基因克隆1．克隆已知序列的基因根据已知基因的序列设计引物(primer)，利用PCR方法克隆基因。
即使不同种属之间，基因编码区序列的同源性高于非编码区的序列。
在某种植物的同源基因被克隆的条件下，可先构建eDNA文库或基因组文库，然后以该基因(或部分序列)为探针来筛选目的基因的克隆。
2．功能克隆根据基因的产物蛋白质克隆基因，利用这种方法分离基因，首先应根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的mRNA序列，根据mRNA序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。
利用抗体或核苷酸探针筛选基因组DNA文库或cDNA文库，也可利用寡核苷酸引物对核D NA或cDNA进行PCR扩增。
通过对阳性克隆或PCR扩增产物的序列分析鉴定分离基因。
3．作图克隆作图克隆又称图位克隆，是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克隆技术。
根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。
作图克隆是从连锁标记出发，通过大片段克隆(BA C库或YAC库)的染色体步移(chromommewalking)到达靶基因。
4．表型差异克隆利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因，对于有些植物的性状，既不了解它们的基因产物也没有对它们进行基因定位，但已知它们的表型存在差异，利用这些差异，用下述方法也可克隆植物基因。
(1)消减杂交法即消减杂交法(subtractive hybridization)是通过鉴定两个mRNA间差异而分离基因的方法。
其基本方法是：提取两种差异细胞或组织的DNA后，反转录合成c DNA，并用限制性内切核酸酶切割成小片段。
将其中一个样品的酶切产物分成两份，分别连接不同的含有特定酶切位点的40bp左右的寡核苷酸接头，作为检测者(tester)。
用另外一个样品过量的酶切产物作为驱动者(driver)与带有不同接头的tester进行第一次杂交。
《基因工程的原理》 讲义
《基因工程的原理》讲义一、什么是基因工程基因工程，简单来说，就是一种在分子水平上对基因进行操作的技术。
它就像是一把神奇的“分子剪刀”，能够让我们按照自己的意愿，对生物的基因进行剪裁、拼接和重组，从而创造出具有新特性的生物。
基因是生命的蓝图，它决定了生物的各种特征和功能。
而基因工程则为我们提供了一种直接干预和改变这些蓝图的手段。
通过基因工程，我们可以将一个物种的基因转移到另一个物种中，赋予后者原本不具备的特性。
二、基因工程的基本工具要实现基因工程，就需要一些特殊的工具，就像工匠需要合适的工具才能打造出精美的作品一样。
1、限制性内切酶限制性内切酶就像是一把极其精准的“分子剪刀”，能够识别特定的核苷酸序列，并在这个位置将 DNA 分子切断。
不同的限制性内切酶识别的序列不同，这使得我们能够在特定的位置对 DNA 进行切割，为后续的基因重组做好准备。
2、 DNA 连接酶当我们把基因片段切割下来之后，需要把它们重新连接起来。
这时候，DNA 连接酶就派上用场了。
它能够将两个 DNA 片段的末端连接起来，形成一个完整的 DNA 分子。
3、载体基因片段很小，很难直接进入细胞发挥作用。
这时候就需要一个载体来帮忙，常见的载体有质粒、噬菌体和病毒等。
载体就像是一辆“小货车”，能够把我们需要的基因片段装载起来，并运输到目标细胞中。
三、基因工程的基本步骤1、目的基因的获取首先，我们要确定需要的基因，也就是目的基因。
这可以通过从生物的基因组中直接分离，或者利用 PCR 技术（聚合酶链式反应）进行扩增得到。
2、基因表达载体的构建将获取的目的基因与载体连接，构建成基因表达载体。
这一步就像是把货物装到货车上，并且要确保货物能够在货车上稳定存在，并且能够在合适的时候被卸载下来。
3、将目的基因导入受体细胞这一步就是要把装载着目的基因的载体“小货车”开到受体细胞里。
常用的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法等，对于动物细胞，可以采用显微注射法，对于微生物细胞，可以用感受态细胞法。
分子克隆技术实验讲义(最终版)
分子克隆技术实验讲义黑龙江大学生命科学学院2021年3月甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定一、实验目的1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。
2、学习和掌握质粒、T载体的特点。
3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。
4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。
5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。
6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。
7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。
8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。
二、相关知识〔一〕T载体的制备pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物〔T-A Cloning〕的商业化专用载体，由pΜC 18载体改建而成。
在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了Eco RⅤ识别位点，用Eco RⅤ进行酶切反响后，再左两侧的3′端添加“T〞而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
相关知识点：〔1〕质粒的提取；〔2〕酶切；〔3〕PCR等。
〔二〕DNA的重组与连接〔PCR产物的克隆〕把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。
所谓重组，就是把外源目的基因“装进〞载体的过程，即DNA的重新组合。
为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端〔compatible end〕，以产生末端连接。
现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。
相关知识点：〔1〕克隆与亚克隆；〔2〕DNA重组；〔3〕内切酶；〔4〕粘性末端与平末端；〔5〕连接酶；〔6〕连接酶的分类及功能等。
〔三〕大肠杆菌感受态细胞的制备外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。
第九章 目的基因的克隆
第九讲目的基因的克隆吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所２０05年8月目录一、基因克隆的一般概念1．基因克隆定义2．“克隆”的不同含义3．基因克隆的过程4．DNA片段的产生与分离5．基因文库二、基因克隆与分离的实验策略1．物理策略2．生物策略3．克隆样品的选择4．基因文库库容测算三、cDＮＡ基因克隆1．概述2．ｃDNA文库的构建3．低丰度mＲNA之cＤＮA克隆4．稀少ｍRNA的ｃDNＡ克隆5．全长ｃDNA的合成6．cDNＡ克隆的优越性四、基因组DNA克隆1．cDNA克隆的局限性2．基因组DNA克隆的优越性3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆1．基因定位克隆概述2．RFＬP分子标记3．RFＬＰ作图原理与步骤4．染色体步移5．大尺度物理图谱的构建ﻬ目的基因的克隆一、基因克隆的概念1．基因克隆的定义基因克隆亦叫做DNＡ克隆(DＮA clonｉｎg)，它是指将外源基因或DNＡ片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子ＤNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DＮA片段的实验操作，叫做基因克隆。
严格地说，基因克隆应叫做ＤＮA克隆,因为被克隆的是基因组的全部（理论上)的ＤＮA片段,而并不是所有的ＤNＡ片段都编码有基因。
＊要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别!完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离!尽管两者之间存在密切的相互关系。
因此在日常交谈中或是一般文字叙述中,甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分,是不妥当的。
*有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Moｌecular cloning），实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容,基因克隆的全过程包括如下四个步骤：ａ.DNＡ材料的选择与片段化;ｂ.外源DNA片段与载体分子的连接;ｃ．重组体分子的体外转化；d.转化子克隆的选择或筛选。
２．克隆的不同含义:(动词、名词与形容词)(1)“克隆”的三种含义*1.“克隆”一词作名词时,是指从一个共同的祖先经无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特定的生命群体；*2.“克隆”一词作动词时,则是指从同一祖先经无性繁殖产生这类遗传分子上同一的DNA分子、细胞群体或个体群体的过程；*3.“克隆”一词除了用作名词和动词之外，还可用作形容词使用,例如“克隆羊”（cloｎed ｓheep)中的“克隆”便是形容词,这是中文的一个有别于英文的地方。
第6章目的基因的分离克隆(植物基因工程)课件
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14(2) 如何从cDNA中找到所需要的基因？15转录水平上的基因克隆方法
l 差别杂交筛选 l 扣除杂交 l 代表性差别分析 l 差异显示 l cDNA阵列杂交 l 基因表达系列分析 l 抑制差减杂交
筛选目的基因(核酸探针法、免疫结合法)因库应当能包括全部的基因组序 列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总 克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 令检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：
令例:人类基因组3.0x106kb, 以λEMBL作载体， 插入片段的平均长度为17kb ，p为99%时, 基因 库应有8.1x105 个 重组噬菌体。
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n基于EST信息的基因克隆
EST
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由杨树EST库获得基因序列
PCNA
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克隆的核酸酶
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2、基因组水平上的克隆
将ry) ：将某种生物的基因组DNA切割成 一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进 行克隆。这些存在于所有重组
➢差别杂交筛选
含有表达 目的基因
不含有表 达目的基因cDNA 铺平板转膜 转膜提取分离 mRNA
cDNA 探针
提取分离 mRNA
cDNA 探针
比较 分析
用对照样品cDNA作探 针杂交的X光片中没有 而在检测样品cDNA作 探针杂交的X光片中有 的印斑，可对照X光片 从原平板挑出菌落进行 鉴定是否含有目的基因
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菌落杂交技术寻找目标DNA克隆
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文 库 的 抗 体 筛 选
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(2) T-DNA标签克隆基因
《基因工程的原理》 讲义
《基因工程的原理》讲义一、什么是基因工程基因工程，简单来说，就是一种在分子水平上对基因进行操作的技术。
它就像是一个极其精细的“基因手术”，通过一系列的技术手段，对生物体的基因进行剪切、拼接、重组和改造，从而实现对生物遗传特性的定向改变。
要理解基因工程，首先得知道基因是什么。
基因是具有遗传效应的DNA 片段，它就像一个神秘的密码本，决定了生物体的各种性状，比如我们的外貌、身高、性格，甚至是容易患上某些疾病的倾向。
而基因工程的出现，让我们有了主动去解读和改写这个“密码本”的能力。
不再是被动地接受自然的遗传安排，而是能够按照我们的意愿，去塑造和优化生物的特性。
二、基因工程的基本工具就像进行任何一项复杂的工程都需要特定的工具一样，基因工程也有它必不可少的“工具包”。
1、限制性内切酶限制性内切酶，也被形象地称为“分子剪刀”。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切断。
就好像一把精准的剪刀，能够在长长的 DNA 链条上找到我们想要的位置，然后干净利落地剪断。
不同的限制性内切酶识别的核苷酸序列是不一样的，这就为我们在基因操作中提供了多种选择，能够根据具体的需求来剪切 DNA。
2、 DNA 连接酶有了剪断的操作，自然还需要把断开的 DNA 片段重新连接起来。
这时候就轮到 DNA 连接酶登场了，它像是一个“基因胶水”，能够把两个具有相同末端的DNA 片段连接在一起，形成一个完整的DNA 分子。
3、运载体当我们把想要的基因片段剪切并连接好之后，还需要一个“运输工具”把它们送到目标细胞中去，这个“运输工具”就是运载体。
常见的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。
运载体就像是一辆辆小货车，它们能够携带我们精心准备的基因片段，顺利地进入到受体细胞中，并且能够在受体细胞中稳定地存在和复制。
三、基因工程的基本操作步骤1、目的基因的获取这是基因工程的第一步，也是关键的一步。
目的基因就是我们想要的那段具有特定功能的基因。
《基因工程》课程教学大纲
《基因工程》课程教学大纲课程名称：基因工程课程类别：专业主干课适用专业：生物技术考核方式：考试总学时、学分：32 学时 2 学分其中实验学时：0 学时一、课程教学目的通过对本门课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理、常用技术和工作思路，了解基因工程技术的应用及发展趋势，为进一步学习有关专业课及参加相关领域的生产和科研工作奠定基础。
二、课程教学要求本门课是以遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学、分子生物学等学科为基础的学科，要求学生有扎实的上述课程基础。
本课程的主要内容包括: 基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定、大肠杆菌基因工程、酵母菌基因工程、高等动物基因工程、高等植物基因工程等。
要求学生掌握基因工程的基本原理和常用方法与技术，了解该领域的研究动态与发展方向。
课程的基本内容随着本学科的发展而调整并限定其广度和深度，在保证达到一定培养规格的前提下，考虑学生的接受能力和学习负担，同时注意本课程和其它相关课程的相互联系与衔接，防止疏漏和不必要的重复。
三、先修课程生物化学、微生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学。
四、课程教学重、难点教学重点：基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
教学难点：目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
五、课程教学方法与教学手段以教师讲授为主，要求教师认真备课，熟悉本课程的基本内容以及该学科的最新发展趋势，以合适的形式进行教学，提倡采用多媒体作为辅助教学手段；学生可以通过阅读相关的英文资料了解本学科的研究状况与发展方向，也可以阅读一些感兴趣的参考资料，训练其针对所感兴趣的问题进行深入探讨的能力。
六、课程教学内容第一章概述（1学时）1．教学内容（1）基因工程的概念；（2）基因工程的发展和历史；（3）基因工程的研究意义。
2．重、难点提示（1）重点：基因工程的概念；（2）难点：基因工程的基因原理及在生物工程中的地位。
基因工程概论(3)
5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3’ … C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A… 5’
Zn2+
T-G-G-A-G-T… 3’
A-C-C-T-C-A… 5’
gap
核酸修饰酶 末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）：
TdT的基本特性：来自小牛胸腺
不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs 5’ p 3’ HO
3’ HO
TdT
5’ p 3’ HO AAAAAAAAAAA
Co2+
dATP AAAAAAAAAAAAAA OH 3’
p 5’
3 基因工程的基本条件
B 用于基因克隆的载体
载体的功能及特征
质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA
考斯质粒（cosmid）
载体的功能及特征 载体的功能：
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
DNA pol I
5’ ppp dN Mg2+
3’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’
5’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） ：
Klenow 酶的基本性质：
大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得C端三分之二的大 肽段，即为Klenow酶。 Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，
5’ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH
3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
… 3’
… 5’
基因工程技术与应用知识点
基因工程技术与应用知识点
1.基因工程技术的原理
基因克隆是指将感兴趣的基因从一个物种中剪切并插入到另一个物种
的DNA中。
首先，需要获得目标基因的DNA序列，然后通过PCR扩增得到
足够多的目标基因的DNA片段。
接下来，将目标基因的DNA片段与质粒进
行连接，形成重组质粒。
最后，将重组质粒导入宿主细胞中，使其进行复
制和表达。
这样，目标基因就被克隆到宿主细胞的基因组中。
转基因是指利用基因工程技术将外源基因导入目标细胞中，使其产生
新的功能或性状。
转基因主要通过两种方法实现：直接注射外源基因或利
用载体导入外源基因。
直接注射外源基因常用于转基因动物的制作，而利
用载体导入外源基因则常用于转基因植物的制作。
通过转基因技术，可以
实现农作物的抗虫、抗病、抗逆性增强，以及工业酶的大规模生产等。
2.基因工程技术的应用
农业领域：基因工程技术可以用于农作物的抗虫、抗病和抗逆性提高
等方面。
通过转基因技术，可以使植物表达抗虫蛋白，减少对农药的依赖；也可以导入外源基因，增强植物的抗逆性，使其在恶劣环境下仍能正常生长。
工业领域：基因工程技术可以用于工业酶的生产，如乳酸菌发酵生产
乳酸。
此外，基因工程还可以用于生物燃料的生产，如利用转基因酵母生
产乙醇。
基因工程的载体和受体情况讲解
（2）质粒的不相容性（incompatibility）
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质
（3）质粒的可转移性
据此，革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： ✓接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F质粒。 ✓非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R质粒的一些成员。
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质 粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定。
R因子（resistance factor）
✓最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现 还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和 Staphylococcus中。
✓R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子 （resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（rdeterminant）。RTF为分子量约为11×106 Dalton，控制质粒拷 贝数及复制。抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106 Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。
基因工程的载体和受 体情况讲解
一、用于基因克隆的载体
1.载体的概念
（1）携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 （2）能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞， 具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩 增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 （3）实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞。
基因克隆的原理
基因克隆的原理
基因克隆是指通过重组DNA分子来复制或复制特定基因的过程。
它的原理涉及利用DNA重组技术从一个生物体中提取目
标基因，并将其插入到另一个宿主生物体的基因组中。
以下是基因克隆的基本原理和步骤：
1. 提取目标基因：从一个生物体的DNA中提取目标基因。
这
可以通过多种方法实现，如聚合酶链式反应（PCR）或酶切和连接技术。
2. 槽融合：使用合适的酶将目标基因与质粒DNA或其他载体DNA相连接。
这些质粒DNA通常是经过改造的DNA分子，
包含有关目标基因的所需信息，如启动子、激活子和选择性标记。
3. 转化宿主细胞：将重组质粒DNA导入到宿主细胞中。
这可
以通过多种方法实现，如电穿孔、化学转化或基因枪。
宿主细胞通常是细菌或酵母等单细胞生物。
4. 选择性筛选：使用特定的标记或抗生素等方法筛选出已经成功转化的宿主细胞。
这有助于确保目标基因已经被插入到宿主细胞的基因组中。
5. 复制和表达：将含有目标基因的宿主细胞进行培养和繁殖，以实现大规模的基因复制。
通过适当的培养条件和诱导剂等方法，目标基因可以被表达出来，并产生所需的功能蛋白或产物。
总的来说，基因克隆基于DNA重组技术，利用质粒DNA或其他载体DNA将目标基因导入宿主细胞的基因组中。
这种方法使得科学家能够通过修改和复制基因，研究基因功能、制备蛋白质或生产其他有用的化合物。
（整理）基因工程试验.
（整理）基因⼯程试验.基因⼯程实验流程实验⼀丹参总DNA的提取实验⽬的：掌握从植物或动物的组织（细胞）中抽提DNA的⽅法。
实验材料：丹参叶⽚实验器材：台式离⼼机，恒温⽔浴锅，电泳仪，研钵和杵，离⼼管，微量移液器，枪头实验步骤：第⼀次使⽤前请先在漂洗液WB和结合液PQ中加⼊指定量的⽆⽔⼄醇，充分混匀，加⼊后请及时在⽅框打钩标记已加⼊⼄醇，以免多次加⼊!取所需适量裂解液PL放置在65℃预热，使⽤前加⼊β-巯基⼄醇到终浓度2%。
1.取适量植物组织（新鲜组织100mg 或⼲重组织30 mg）在研钵中加⼊液氮充分碾磨成细粉。
2.转移细粉到⼀个1.5ml离⼼管，不要解冻，加600µl 65℃预热的裂解液PL (确认已加⼊β-巯基⼄醇⾄2%)，剧烈涡旋振荡混匀，⽤⼤⼝径枪头轻柔吹打帮助裂解。
如果组织裂解困难，可根据需要加⼀个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。
3.65℃⽔浴20-60分钟，在⽔浴过程中颠倒离⼼管以混合样品数次。
可选如果组织⼲燥或者产量低，可以适当延长⽔浴时间。
如RNA残留多，可在⽔浴前加⼊6µlRNA酶（20mg/ml）。
4.加⼊700µl氯仿/异戊醇（体积⽐24：1混合），颠倒充分混匀⼏分钟（或者涡旋混匀），13,000rpm 离⼼5分钟。
若提取的植物组织富含多糖多酚，可以在第4步前⽤等体积酚/氯仿（1：1）抽提⼀遍。
5.⼩⼼吸取上清到⼀个新的1.5ml离⼼管，注意不要吸到界⾯物质。
如上清⽐较浑浊，则需要重复步骤4⼀遍，直到得到透亮上清。
6.较精确估算上清量，加⼊1.5倍体积结合液PQ （请先检查是否已加⼊⽆⽔⼄醇!）后⽴刻涡旋，充分混匀。
此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。
7.将上⼀步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加⼊⼀个吸附柱AC中，（吸附柱放- 5 - ⼊收集管中）13,000rpm离⼼30秒，倒掉收集管中的废液（先加700µl离⼼，弃废液，再加⼊剩余的溶液，再次离⼼）。
基因工程实验原理
基因工程实验原理
基因工程实验的原理是基于对生物体基因组的修改和重组，旨在增加或改变生物体的特性。
下面将介绍几种常见的基因工程实验原理：
1. 基因克隆：该实验原理是将所需基因从一个生物体中剪切并插入到另一个生物体的染色体上，使目标基因能够在新宿主中表达。
2. 限制性内切酶消化：该实验原理是利用限制性内切酶切割目标DNA，创建具有粘性末端的DNA片段。
然后，可以通过连接这些片段来构建重组DNA。
3. 反转录和cDNA合成：这个实验原理是利用逆转录酶将RNA转录成DNA，即cDNA（互补DNA），然后将其克隆到表达载体中。
4. 基因敲入和敲除：该实验原理是通过CRISPR/Cas9系统或其他方法，有针对性地切割或改写目标基因，从而敲除或敲入特定的DNA片段。
5. 转基因技术：这是将外源基因导入到目标生物体中，使其表达或增强特定的功能。
转基因技术的原理可以是通过基因枪、农杆菌介导的转化等手段。
这些实验原理是基因工程研究中常用的方法，可以用于改良农
作物、生产药物、开发生物燃料等领域。
在实验过程中，研究人员需要仔细设计实验方案，并根据具体需求选择适当的方法。
基因工程讲义
基因工程讲义目录第一章绪论 (3)一、基因工程的诞生 (3)二、基因工程的成就 (5)三、基因工程安全性的问题 (6)四、基因工程研究的内容 (8)第二章基因克隆所需的工具酶……………………………12一、限制性内切酶(restriction enzyme)………………………………12二、DNA连接酶 (20)三、DNA聚合酶 (24)四、逆转录酶 (27)第三章基因的克隆载体 (28)一、质粒载体 (28)二、大肠杆菌质粒载体 (30)三、λ噬菌体载体 (33)四、粘粒载体（柯斯质粒载体） (35)第四章目的基因的分离克隆 (38)第一节化学法合成目的基因…………………………………………38第二节PCR技术在基因克隆中的应用………………………………38一、PCR基本技术 (38)二、PCR技术在基因克隆方面的应用 (42)第三节基因文库技术分离目的基因 (45)一、基因文库的类别 (46)二、核基因组文库构建 (48)三、利用PCR技术构建c DNA文库 (49)四、应用差别杂交或扣除杂交法构建cDNA文库 (49)五、人工染色体文库 (50)第五章重组体的构建、转化及鉴定…………………………54一、质粒DNA的分离纯化 (54)二、目的基因与载体的连接 (54)三、重组体向宿主细胞的导入 (54)四、含重组质粒的细菌菌落的鉴定 (56)第六章克隆基因的表达………………………………………59第一节外源基因在原核细胞中的表达 (60)一、原核生物基因表达的特点 (60)二、基因表达的调控序列 (61)三、几种类型的原核表达载体 (62)四、提高克隆基因表达效率的途径 (63)第二节外源基因在真核细胞中的表达 (68)一、真核细胞基因克隆载体…………………………………………68第三节外源基因导入真核细胞的方法 (72)第七章重组体的筛选与鉴定 (76)一、遗传检测法 (76)二、物理检测法 (78)三、核酸杂交筛选法 (79)四、免疫化学检测法 (80)五、DNA—蛋白质筛选法 (81)《基因工程》课程教学大纲适用专业生物科学，生物技术预修课程普通生物学、遗传学、生物化学、分子生物学一、编写说明（一）本课程的性质、地位和作用自本世纪70年代基因工程诞生以来，在不到30年的时间内，已取得许多激动人心的成就，并继续向前迅猛发展，成为当今生物科学研究领域中最具生命力、最引人注目的前沿学科之一。
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基因工程原理
基因工程(gene engineering)常和 以下名称混用
• 遗传工程(genetic engineering); • 基因克隆(gene cloning); • 分子克隆(molecular cloning); • 基因操作(gene manipulation); • 重组DNA技术(recombination DNA technique)
义指II型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌
系编号、分离顺序。 例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称 H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型； “Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新 的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
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三、基因工程技术及其应用
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转基因植物
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转基因动 物作为生 物发生器
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基因工程原理
基因本身也是一个产业
Байду номын сангаас
５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-Ｏ
Ｈ
2. 末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA
G-3’
3’-GACGTC-5’ 3’-G
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第九讲目的基因的克隆中国科学院遗传与发育生物学研究所2017年8月目录一、基因克隆的一般概念1．基因克隆定义2．“克隆”的不同含义3．基因克隆的过程4．DNA片段的产生与分离5．基因文库二、基因克隆与分离的实验策略1．物理策略2．生物策略3．克隆样品的选择4．基因文库库容测算三、cDNA基因克隆1．概述2．cDNA文库的构建3．低丰度mRNA之cDNA克隆4．稀少mRNA的cDNA克隆5．全长cDNA的合成6．cDNA克隆的优越性四、基因组DNA克隆1．cDNA克隆的局限性2．基因组DNA克隆的优越性3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆1．基因定位克隆概述2．RFLP分子标记3．RFLP作图原理与步骤4．染色体步移5．大尺度物理图谱的构建目的基因的克隆一、基因克隆的概念1．基因克隆的定义基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。
严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。
*要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。
因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。
*有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：a.DNA材料的选择与片段化；b.外源DNA片段与载体分子的连接；c.重组体分子的体外转化；d.转化子克隆的选择或筛选。
2．克隆的不同含义：(动词、名词与形容词)(1)“克隆”的三种含义*1.“克隆”一词作名词时，是指从一个共同的祖先经无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特定的生命群体；*2.“克隆”一词作动词时，则是指从同一祖先经无性繁殖产生这类遗传分子上同一的DNA分子、细胞群体或个体群体的过程；*3.“克隆”一词除了用作名词和动词之外，还可用作形容词使用，例如“克隆羊”(cloned sheep)中的“克隆”便是形容词，这是中文的一个有别于英文的地方。
(2)名词“克隆”的三个内容在作名词使用时，“克隆”涉及如下三个方面的内容：a.在胚胎学、免疫学以及细胞生物学等学科中，“克隆”一词是指是同一祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的细胞群体；b.具有相同基因型的同一物种的两个或多个个体亦可用克隆表示，因此从同一个受精卵分裂而来的单卵双生子(monozygotictwins)便属于同一克隆；c.在分子生物学中，带有一段插入DNA序列的独特的寄主/载体单位(例如细胞寄主中的重组质粒载体)亦叫做克隆。
3．基因克隆的过程a.DNA分子的体外切割——克隆用的DNA材料的片段化，它要求在其分子的准确部位切割DNA分子的实验方法，识别序列特异的核酸内切限制酶的发现为DNA分子的体外切割提供了有力的工具。
(A method for cutting DNA at precise locations)b.DNA分子的体外连接——共价连接克隆DNA片段与载体分子的方法(A method for joining two DNA fragment covalently) DNA连接酶的发现使这个问题得到了圆满的解决。
c.克隆载体的选择——选择能够自我复制的小分子量的载体DNA分子。
(Selection of a small molecular of DNA capable of self-replication)待克隆的外源基因或DNA片段，可以被连接到质粒或病毒载体的DNA分子上(克隆载体)。
这些重组合的DNA分子是由两个或数个不同来源的DNA片段共价连接而成，称为重组体分子(recombinant DNAs)。
d.重组DNA的转化——将重组DNA分子从试管中转移到能使其进行DNA复制的寄主细胞的方法。
(A method for moving recombinant DNA from test tube into a host cell that can provide the enzymatic machinery for DNA replication)e.转化子的筛选与鉴定——筛选或鉴定含有重组体DNA分子的寄主细胞的方法。
(Method to select of identify those host cells that contain recombinant DNA)图6-2 真核基因克隆的基本步骤4．DNA片段的产生与分离我们知道所谓DNA文库(DNA library)是指，来自特定生物有机体基因组的全部DNA片段之每一条片段，都与克隆载本单独形成重组分子，此种包含有该特定生物有机体之全部DNA片段的重组克隆分子的集合体，称做DNA文库。
简言之，是生物有机体的基因组DNA片段化之后形成的成千上万的DNA片段都被同一克隆载体所克隆。
因此生物有机体的全部遗传信息通过基因文库(DNA文库)中的各种克隆得到了保存与体现，犹如书库保藏着人类的全部知识一样。
由此可见，基因克隆与分离的头一步就必须对基因组DNA进行片段化。
(1)核酸内切限制酶的切割法真核基因组DNA经核酸内切限制酶消化之后不进行凝胶电泳分部分离而直接与克隆载体重组，这种克隆方法，在早期研究中使用过，特称为“鸟枪法(shotgun approach)”。
缺点：①形成的重组体分子，实际上是一群带有不同大小的插入片段的重组载体的混合群体。
造成目的基因筛选困难、工作量大、费时、费力、费钱。
②有些目的基因的核苷序列中可能会存在一个甚至数个限制酶识别位点。
因此，克隆的目的基因有可能被切成若干片段。
③产生的有些片段可能太大，有些片段又可能太小，因此有些基因无法被克隆，形成不完全的基因库。
(2)机械切割法构建DNA文库最好使用随机片段化的方法制备DNA的克隆片段。
机械切割法和限制酶局部消化法处理基因组DNA，都可以产生出随机片段化的DNA克隆片段群体；机械切割的标准状况是：1500转/分搅拌器中高速搅拌，30分钟便可将DNA分子切成平均长度8kb的分子群体。
(3)限制酶局部消化用来产生DNA克隆片段的限制酶，必须考虑到它对DNA序列应该具有最佳的识别位点分布规律。
例如选用 噬菌体载体构建基因文库，就不能够承载大小25Kb的EcoRI片段，在这种情况下最好选用识别序列为4bp的Sau3A、HaeⅢ以及AluI 等限制酶。
(4)DNA片段的大小分部*蔗糖密度梯度离心——除去不适于克隆的过大或过小的DNA 片段；*琼脂糖凝胶电泳——此法可以在很窄的范围内获得高纯度的某种DNA片段，或是大小同源的DNA片段。
此法的缺点是，琼脂糖的污染有时会抑制尔后的酶催反应。
5．基因文库(1)基因文库和DNA文库*基因文库亦叫基因银行(Gene bank)，系指在一种载体分子中随机地克隆着某种生物、组织、器官或细胞类型的所有的DNA片段而构成的克隆集合体。
在理想的情况下，它应包含有该生物种全部的遗传信息。
在过去也称基因文库为鸟枪收集。
*DNA文库(DNA library)，基因文库是在基因工程诞生的早期就已被使用，已经习惯且通俗易懂。
但近年来一般称基因文库为DNA文库，这是一种更加符合实际更加科学的名称。
因为基因文库从本质上讲是由来自染色体基因组的全部DNA片段组成的。
(2)基因组文库和cDNA文库*基因组文库(Genomic library)，系指生物体基因组DNA经过核酸内切限制酶作部分消化切割之后，克隆在适当的载体分子上，然后将这重组的混合物转化给例如大肠杆菌这样的寄主菌株，于是便构成了包含该生物体整个基因组全部遗传信息的基因组文库。
*cDNA文库(cDNA library)，将纯化的某种生物的特定发育阶段或组织之mRNA，经反转录酶作用合成双链的DNA群体，同适当的载体分子重组之后转化给寄主菌株，如此便构成了特定的cDNA文库。
这种文库与基因组文库不同，它只包括特定的发育阶段特定组织或器官中表达的基因，而不是全部的基因。
二、基因克隆与分离的实验策略1．物理策略(physical strategy)基因的克隆与分离从大的方面看，可以区分为物理策略和生物策略两大类。
所谓物理策略是，首先构建基因组的物理图谱，如限制图和测序图，然后再据此确定基因的位置、全序列结构、表达蛋白质及其生物功能。
基因组DNA是一种线性结构，使用物理策略分离目的基因，是按照染色体、YAC克隆(或BAC克隆)、Cosmid克隆、亚克隆这种由大到小的过程，逐渐克隆、分离和测序，最后完成目的基因及其基因组的全测序。
2．生物策略(biological strategy)从具有某种表型(生物功能)的个体或细胞的基因组中，分离出与表型相关的基因片段，再以此为分子探针，筛选出基因的全序列和表达序列。
以这种方式克隆分离目的基因的策略，称为生物学策略。
3．克隆样品的选择(1)蛋白质大分子最早的功能基因克隆，是从分离纯化与特异表型相关的蛋白质开始的，然后根据蛋白质的氨基酸顺序反推出相应的核苷酸顺序，并以此为依据合成分子探针，从基因库中筛选出目的基因。
*1.优点：一般真核细胞中蛋白质种类的复杂度都比较低，仅有104种左右，故可比较容易地通过电泳分析得到间断的可分辨的图谱。
因此，对于一些大量表达的功能蛋白质之编码基因的分离，还是比较容易的。
*2.缺点：在任何类型的细胞中，都仅有少数基因表达成相应的蛋白质，而且其表达活性和种类还随着发育阶段的不同及环境因素的变化而变化，所以在不同的发育阶段和不同的环境条件下，不同类型的细胞中蛋白质的种类都是不完全的，也不尽然相同。
况且还有许多基因的蛋白质产物是未知的，或者其纯化量不足以进行氨基酸序列分析及相应抗体的制备。
因而要从蛋白质水平来分离目的基因，显然也是有困难的。
(2)mRNA大分子*高等真核生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定的发育阶段的单个细胞或个体中，都仅有15%左右的基因得以表达，产生出大约15000种不同的mRNA。
可见mRNA的复杂度与蛋白质的复杂度比较接近。
*正是由于这种基因的差别表达，才决定了高等植物的发育分化、细胞周期、对环境压力的反应，以及衰老与死亡等所有的生命过程。
*植物的正常代谢过程或者病理变化，以及光温的育性效应，不管其是由单基因控制的，还是由多基因控制的，本质上都是由于基因表达的改变造成的。