基因工程原理讲义：目的基因的克隆

第九讲目的基因的克隆

中国科学院遗传与发育生物学研究所

2017年8月

目录

一、基因克隆的一般概念

1．基因克隆定义

2．“克隆”的不同含义

3．基因克隆的过程

4．DNA片段的产生与分离

5．基因文库

二、基因克隆与分离的实验策略

1．物理策略

2．生物策略

3．克隆样品的选择

4．基因文库库容测算

三、cDNA基因克隆

1．概述

2．cDNA文库的构建

3．低丰度mRNA之cDNA克隆

4．稀少mRNA的cDNA克隆

5．全长cDNA的合成

6．cDNA克隆的优越性

四、基因组DNA克隆

1．cDNA克隆的局限性

2．基因组DNA克隆的优越性

3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆

1．基因定位克隆概述

2．RFLP分子标记

3．RFLP作图原理与步骤

4．染色体步移

5．大尺度物理图谱的构建

目的基因的克隆

一、基因克隆的概念

1．基因克隆的定义

基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。

*要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。

*有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：

a.DNA材料的选择与片段化；

b.外源DNA片段与载体分子的连接；

c.重组体分子的体外转化；

d.转化子克隆的选择或筛选。

2．克隆的不同含义：(动词、名词与形容词)

(1)“克隆”的三种含义

*1.“克隆”一词作名词时，是指从一个共同的祖先经无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的

特定的生命群体；

*2.“克隆”一词作动词时，则是指从同一祖先经无性繁殖产生这类遗传分子上同一的DNA分子、细胞群体或个体群体的

过程；

*3.“克隆”一词除了用作名词和动词之外，还可用作形容词使用，例如“克隆羊”(cloned sheep)中的“克隆”便是形容词，

这是中文的一个有别于英文的地方。

(2)名词“克隆”的三个内容

在作名词使用时，“克隆”涉及如下三个方面的内容：

a.在胚胎学、免疫学以及细胞生物学等学科中，“克隆”一词是

指是同一祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的细胞群体；

b.具有相同基因型的同一物种的两个或多个个体亦可用克隆表

示，因此从同一个受精卵分裂而来的单卵双生子(monozygotic

twins)便属于同一克隆；

c.在分子生物学中，带有一段插入DNA序列的独特的寄主/载

体单位(例如细胞寄主中的重组质粒载体)亦叫做克隆。

3．基因克隆的过程

a.DNA分子的体外切割——克隆用的DNA材料的片段化，它要

求在其分子的准确部位切割DNA分子的实验方法，识别序列特异的核酸内切限制酶的发现为DNA分子的体外切割提供了有力的工具。(A method for cutting DNA at precise locations)

b.DNA分子的体外连接——共价连接克隆DNA片段与载体分子

的方法(A method for joining two DNA fragment covalently) DNA连接酶的发现使这个问题得到了圆满的解决。

c.克隆载体的选择——选择能够自我复制的小分子量的载体DNA

分子。(Selection of a small molecular of DNA capable of self-replication)

待克隆的外源基因或DNA片段，可以被连接到质粒或病毒载体的DNA分子上(克隆载体)。这些重组合的DNA分子是由两个或

数个不同来源的DNA片段共价连接而成，称为重组体分子(recombinant DNAs)。

d.重组DNA的转化——将重组DNA分子从试管中转移到能使其进行DNA复制的寄主细胞的方法。(A method for moving recombinant DNA from test tube into a host cell that can provide the enzymatic machinery for DNA replication)

e.转化子的筛选与鉴定——筛选或鉴定含有重组体DNA分子的寄主细胞的方法。(Method to select of identify those host cells that contain recombinant DNA)

图6-2 真核基因克隆的基本步骤

4．DNA片段的产生与分离

我们知道所谓DNA文库(DNA library)是指，来自特定生物有机体基因组的全部DNA片段之每一条片段，都与克隆载本单独形成重组分子，此种包含有该特定生物有机体之全部DNA片段的重组克隆分子的集合体，称做DNA文库。简言之，是生物有机体的基因组DNA片段化之后形成的成千上万的DNA片段都被同一克隆载体所克隆。因此生物有机体的全部遗传信息通过基因文库(DNA文库)中的各种克隆得到了保存与体现，犹如书库保藏着人类的全部知识一样。由此可见，基因克隆与分离的头一步就必须对基因组DNA进行片段化。

(1)核酸内切限制酶的切割法

真核基因组DNA经核酸内切限制酶消化之后不进行凝胶电泳分部分离而直接与克隆载体重组，这种克隆方法，在早期研究中使用过，特称为“鸟枪法(shotgun approach)”。

缺点：①形成的重组体分子，实际上是一群带有不同大小的插入片段的重组载体的混合群体。造成目的基因筛选困

难、工作量大、费时、费力、费钱。

②有些目的基因的核苷序列中可能会存在一个甚至数

个限制酶识别位点。因此，克隆的目的基因有可能被

切成若干片段。