发酵工程原理与技术第二章

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微生物的特性及工业微生物的要求
工业化菌种的要求
利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强 遗传性能要相对稳定不易变异和退化，不产生任何有 害的生物活性物质和毒素
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）
4
微生物的特性及工业微生物的要求
菌种单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合 因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。
青霉菌选育：先以氮芥处理很短时间而不引起突变， 再用UV处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可 获得高产菌株。
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几个应注意的问题
乙烯亚胺和UV复合处理，氯化锂和UV复合处理，都 用得较普遍，且有一定成效。
氯化锂本身无诱变作用，与一些诱变因子一起使用时 能促进突变。
返 回60
鉴定缺陷型
生长谱法
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生长谱法
方法： 营养缺陷型菌株与 MM以一定的浓度混合倒在 培养皿上，干燥后，在皿底 画上若干区域，然后，在正 面加上微量的氨基酸、维生 素、嘌呤或嘧啶等营养物的 粉末或结晶（滤纸片法也 可）。
培养后，如果某一营养物的 周围有微生物的生长圈，说 明它就是微生物的营养缺陷 型。
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随机分离方法
有些微生物的产物对筛选没有任何选择性优势。因此 常需随机地分离。
筛选！！！！
15
随机分离方法--筛选
生长因子产生菌的筛选 核苷酸等生长因子的生产不能作为分离步骤中的选择
压力，可用随机办法分离产生菌，并通过筛选试验检出产 生菌。
例如：通过观察分离株能否促进营养缺陷型的生长， 便可检出生长因子产生菌。
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自然选育
自然选育的优越性:简单易行,可以达到纯化菌 种,防止菌种衰退,稳定生产,提高产量的目的.
缺点:效率低,进展慢,很难使生产水平大幅度提 高.
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诱变育种
诱变育种理论基础：基因突变。
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自然突变：自然条件下出现的基因突变。 诱发突变：用各种物理和生物因素、化学 因素人工诱发的基因突变。 诱变剂处理使菌种发生突变频率和变异幅度提 高—获得特性优良变异菌株的几率高。
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பைடு நூலகம்
C.glutamicum的代谢调节与赖氨酸生产
天冬氨酸AK 天冬氨酸 磷酸
HSDH
天冬氨酸 高丝氨酸 半醛
赖氨酸
苏氨酸
甲硫 氨酸
为反馈抑制
为阻遏
AK：天冬氨酸激酶 HSDH：高丝氨酸脱氢酶
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营养缺陷型的筛选
淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型
前进
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淘汰野生型
原因： 营养缺陷型的比率很低，只有百分
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随机分离方法--筛选
19
随机分离方法--筛选
多糖产生菌的筛选 制糖工业污水中可能含有很多这种菌种。
可从菌落的黏液状外观识别这类产生菌。
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微生物菌种的选育
生物进化过程中野生型微生物形成完善的代谢调节机制
不会有代谢产物的积累
解除或突破微生物的代谢调节控制
目的产物积累
微生物育种的目的
方法：突变、体内重组 体外重组（基因工程）21
培养方法 分批式富集培养,连续富集培养 固体培养基
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施加选择压力的分离方法
分批式富集培养（摇瓶培养） 重复移植几次后，接种已富集的培养物到固体培养基，可 将优势微生物分离出来。
移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
12
施加选择压力的分离方法
连续富集培养： 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。 改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。
合，但不发生作用；末端产物的积累
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抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选
6
工业生产常用的微生物
霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产 多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
放线菌（actionmycetes）：原核微生物类群。 在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较为广泛。 主要用于生产多种抗生素
7
工业生产常用的微生物
担子菌（basidiomycetes）：主要用于多 糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。
前进
23
自然突变
多因素低剂量诱变效应：自然突变实质上是由一些原 因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如宇宙 空间各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱 变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物 质(如H2O2)的作用等。
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自然突变
互变异构效应：五种碱基第六位上的酮基和氨基， G
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随机分离方法--筛选
抗生素产生菌筛选 在含有敏感菌的平板上鉴定抗生作用。也可在液体培养基 中，检测抗菌活性。
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随机分离方法--筛选
药理活性化合物的筛选 酶靶法：
基本原理：一种化合物如在体外具有抑制代谢过程的 某一关键酶的作用，它在体内一般也具有相应的药理作用。
若将体外筛选出的活性化合物，再用动物做实验，可 筛选出新的药理活性化合物。
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诱变育种主要步骤
出发菌株的诱变处理 和 突变体的筛选。
前进
35
出发菌株诱变处理
包括：
出发菌株的选择 诱变剂的选择 诱变剂量和处理时间的确定
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几个应注意的问题
（1）出发菌株 出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。
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几个应注意的问题
（2）复合诱变因素的使用 野生型菌株用单一诱变因素有时能取得好效果；老
关键
2.开关按键和塑胶按键
设计间隙建议留
突变体的筛选
一般经初筛和复筛
初筛：一般定性，更多的是通过平板采用变色圈、透明圈、 抑制圈、生长圈或沉淀圈等方法测定某变异特性的 存在，粗略推算出产量，有时也用液体培养。 例子
复筛：对初筛结果的菌株生产性能作比较精确的定量测定 还需通过小型和中型发酵投产试验才能用于生产
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营养缺陷型突变株的筛选方法
诱变
淘汰野生型
检出营养缺陷型
鉴定营养缺陷型
富集培养 （抗生素法） （菌丝过滤法）
夹层培养法 逐个检出法 影印平板法
生长谱法
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反馈抑制和反馈阻遏
阻遏蛋白 操纵基因
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抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株
结构基因突变，使结构酶无结合能力但 有催化活性；末端产物的积累
调节基因或操纵基因突变 产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结
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几个应注意的问题
（3）剂量选择 变异率取决于诱变剂量，变异率和致死率之间有一
定关系。用致死率作为选择适宜剂量的依据。 合适剂量：同时增加变异幅度与正突变。
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几个应注意的问题
（4）变异菌株的筛选
诱变目的：高产菌株、新产物。
绝大部分个体死亡
少数存活 多数未变
少数突变 多数负变
少数正变 多数幅度小
藻类（alga）：许多国家已把它作为人类 保健食品和饲料。还可通过藻类将CO2转 变为石油；国外还有从“藻类农场”获 得氢能的报道。
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发酵工业微生物菌种的分离和选育
微生物菌种的分离 微生物菌种的选育
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微生物菌种的分离
施加选择性压力分离法 随机分离方法
10
施加选择压力的分离方法
富集培养 供给特殊培养基或加入某些抑制剂。
前进
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初筛
1 1
3
2
3
2
1 3
2
对照(HC0 =HC1+ HC2 + HC3)
3
诱变
( HC1＞ HC0 能力增强)
( HC2＜ HC0 能力减弱) ( HC3= HC0 能力不变)
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诱变后的突变株会继续变异，低单位菌株在传代过程 中往往占优势，因此复筛中常常出现产量高低不稳的状态， 必须进行自然分离—诱变育种和杂交育种必须环节。
工业化菌种的要求
培养条件易于控制 生长迅速，发酵周期短 发酵过程产生的泡沫少 不易感染它种微生物或噬菌体
对需要添加的前体物质有耐受力，并不能将前体物质作为一 般的碳源用。
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工业生产常用的微生物
细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆 菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物， 主要分布于含糖较多的酸性环境中。常 用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母 等。
自然选育和诱变育种交替使用可获高产菌株。
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特殊变异菌的筛选方法
营养缺陷型突变株 抗阻遏和抗反馈突变型 组成型突变株 抗（敏感）性突变株
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高丝氨酸缺陷菌生产赖氨酸
必需氨基酸 食品、医药、畜牧业需要量很大 但在代谢过程中，一方面赖氨酸对天冬氨酸激酶有反馈抑制， 另一方面还同时生成苏氨酸和甲硫氨酸，使赖氨酸不能在细 胞内累积 高丝氨酸缺陷菌（不能合成高丝氨酸脱氢酶，补充适量高丝 氨酸）则合成大量赖氨酸
和T可以酮式或烯醇式出现， A 和C可以氨基或亚氨基形式
出现。
NH2
NH2
N N
N
O
NH
NH
O
尿嘧啶(uracil, U)
NH
N
腺嘌呤
(adenine, A)
O
N NH
NH
O
胞嘧啶(cytosine, C)
O
H3C NH
NH
N
NH2
鸟嘌呤(guanine, G)
NH
O
胸腺嘧啶(thymine, T)
T以烯醇式出现，在DNA复制到达该点的一瞬间，与G 配对；
C以亚氨基出现时，在新合成的DNA单链的C点出现A 碱基对发生自然突变几率约10-8～10-9。
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自然突变
结果： 1、菌种衰退和生产质量下降； 2、对生产有益的突变。
为此，菌株应定期纯化，保存优良菌种(复壮)。 实际生产中，从高产批号中取样分离单菌落， 从中选 出稳定菌株用于生产。
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菌丝过滤法
条件：丝状真菌和放线菌 原理：在基本培养基上野生型发育成菌丝而营养缺陷
型不能，培养一段时间后，用擦镜纸等合适滤 纸过滤，重复多次过滤除去大部分野生型个体。
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55
检出缺陷型
A夹层培养法 B逐个检出法 C影印培养法
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夹层培养法
方法：先倒一薄层不含菌MM，冷凝后加上一层混有经过 诱变处理的菌液的MM，再浇一薄层不含菌MM，“三明 治”，培养长出菌即野生型，在皿底做上记号，再倒第四 层CM培养，野生型继续繁殖，菌落变大，营养缺陷型开 始生长，菌落较小
CM
MM
培养皿侧面
培养皿正面（新、小菌落 即营养缺陷型） 返 回57
逐个检出法
依次挑取菌落依次接种在MM和CM培养比较，在完全培养基 的某一部位长出菌落而MM不长，则是营养缺陷型
CM 营养缺陷型
CM MM
返 回58
影印培养法 影印接种
完全培养基 营养缺陷型
基本培养基
返 回59
影印培养法
营养缺陷型
微生物菌种的选育
经典育种：自然选育和诱变育种 定向育种：转化、转导、接合、原生质体融合、代谢 调控和基因工程等。
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自然选育
自然选育：利用菌种自然突变(Spontaneous Mutation)进 行菌种筛选的过程。 自然突变：微生物在没有人工参与下所发生的突变。 引起自然突变两个原因：多因素低剂量的诱变效应和互变 异构效应。
第二章 发酵工业微生物菌种
制备原理和技术
1
第一节 发酵工业微生物菌种的选育
微生物的特性及工业微生物的要求 发酵工业微生物菌种的分离和选育 发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏
2
微生物的特性及工业微生物的要求
微生物的特性
有些微生物能在厌氧的条件下生长 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长 有些微生物能进行复杂的代谢 有些微生物能利用较复杂的化合物 有些微生物能在极端的环境下生长
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互变异构效应
五种碱基都能形成酮式-烯醇式或氨基-亚氨基的互变异 构。这两种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。
O
OH
O-
C HN
C N
C N
+ H+
酮式 NH2+
HN
烯醇式 NH2
+HN
NH2
N
+ H+
亚氨基
氨基
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互变异构效应
平衡倾向于酮式和氨基时，DNA双链中以AT和GC碱基 对为主。
少数幅度大 多数不宜投产
少数适宜投产
存活率 突变率 正变率 高产率
投产率
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1.什么是传统机械按键设
计传？统的机械按键设计是需要手动按压按键触动
PCBA上的开关按键来实现功能的一种设计方式。
传统机械按键结构
层图： 按
PCB
传统机械按键设计要点： 1.合理的选择按键的类
键
A
型，尽量选择平头类的
开
按键，以防按键下陷。
之几到千分之几，淘汰为数众多的
野生型菌株，可达到“浓缩” 营养 缺
陷型的目的
方法：抗生素法或菌丝过滤法
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抗生素法
原理：抗生素只杀死生长中的细菌或真菌，在基本培 养基上加抗生素，将野生型细菌杀死，营养缺陷型不 死，从而来浓缩营养缺陷型
细菌 通常 青霉素 （抑制细胞壁的合成）
真菌
制霉菌素 （破坏真菌细胞膜）
连续富集培养法可以筛选出能共 生的稳定混合培养物，例如用甲 烷作碳源筛选到甲烷营养型和一 些非甲烷营养型的共生菌。
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施加选择压力的分离方法
固体培养基的使用 常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所需的基
质，以便促使酶产生菌的生长。 举例：产碱性蛋白酶的菌的分离。碱性土壤铺在
pH9～10的琼脂培养基(含有均匀的不溶性蛋白质)表面。根 据蛋白质水解圈的大小判断蛋白酶的产生能力。